專利名稱：抑制由α的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可抑制白血球粘附且尤其是由α4整合素調介的白血球粘附的化合物，其中α4整合素較佳為VLA-4。
參考技術在本專利案中以上標號形式來引用下列公開物、專利案及專利申請案1Hemler和Takada，歐洲專利申請案第330,506號，1989年8月30日公開。
2Elices，等人，Cell，60577-584(1990)3Springer，Nature，346425-434(1990)4Osborne，Cell，623-6(1990)5Vedder，等人，Surgery，106509(1989)6Pretolani，等人，J.Exp.Med.，180795(1994)7Abraham，等人，J.Clin.Invest，93776(1994)8Mulligan，等人，J.Immunology，1502407(1993)9Cybulsky，等人，Science，251788(1991)10Li，等人，Arteriosckr.Thromb.，13197(1993)11Sasseville，等人，Am.J.Path.，14427(1994)12Yang，等人，Proc.Nat.Acad.Science(USA)，9010494(1993)13Burkly，等人，Diabetes，43529(1994)14Baron，等人，J.Clin.Invest.，931700(1994)15Hamann，等人，J.Immunology，1523283(1994)16Yednock，等人，Nature，35663(1992)17Baron，等人，J.Exp.Med，17757(1993)18van Dinther-Janssen，等人，J.Immunology，1474207(1991)
19van Dinther-Janssen，等人，Annals.Rheumatic Dis.，52672(1993)20Elices，等人，J.Clin.Invest，93405(1994)21Postigo，等人，J.Clin.Invest，891445(1991)22Paul，等人，Transpl.Proceed.，25813(1993)23Okarhara，等人，Can.Res.，543233(1994)24Paavonen，等人，Int.J.Can.，58298(1994)25Schadendorf，等人，J.Path.，170429(1993)26Bao，等人，Diff.，52239(1993)27Lauri，等人，British J.Cancer，68862(1993)28Kawaguchi，等人，Japanese J.Cancer Res.，831304(1992)29Konradi，等人，PCT/US00/01686，2000年1月21日提出申請。
上述所有公開物的全部內容均如同明確并單獨地指明每一單獨公開物那樣以引用的方式并入本文中。
背景技術：
VLA-4(亦稱為α4β1整合素及CD49d/CD29)最初由Hemler和Takada1識別，其為β1整合素類細胞表面受體的一成員，β1整合素的每一成員均包含兩個亞單位，即一條α鏈及一條β鏈。VLA-4包含一條α4鏈和一條β1鏈。整合素至少有9種，其均共有相同的β1鏈但各具有不同的α鏈。這9種受體均可與多種細胞基質分子的一種不同補體(例如，纖維連接蛋白、層粘聯(lián)蛋白、膠原)結合。例如，VLA-4可與纖維連接蛋白結合。VLA-4還可與內皮細胞及其它細胞所表達的非基質分子相結合。這些非基質分子包括VCAM-1，其在培養(yǎng)基中的經(jīng)細胞因子激活的人類臍靜脈內皮細胞上表達。使VLA-4具有纖維連接蛋白和VCAM-1結合活性的抗原決定部位不同，并且已證實每一活性均可獨立地加以抑制2。
通過VLA-4及其它細胞表面受體調介的細胞間粘附與許多炎癥反應有關。在損傷或其它炎癥性刺激部位，激活的血管內皮細胞表達對白血球具有粘附性的分子。白血球對內皮細胞粘附的機制部分地與白血球上的細胞表面受體對內皮細胞上相應的細胞表面分子的識別及結合有關。一旦結合，這些白血球將移行越過血管壁進入受損部位并釋放出化學介質來與感染作斗爭。對于免疫系統(tǒng)的粘附受體的評論，參見(例如)Springer3和Osbom4。
炎癥性腦病，例如實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)、多發(fā)性硬化癥(MS)及腦膜炎，均為其中內皮/白血球粘附機制導致對原本健康的腦組織造成破壞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病實例。在這些炎癥性疾病中，大量白血球移行越過血腦屏障(BBB)。白血球釋放有毒介質可引起廣泛組織損傷，從而導致神經(jīng)傳導受損和癱瘓。
在其它器官系統(tǒng)中，粘附機制亦會造成組織損傷，從而導致白血球遷移或激活。例如，已經(jīng)顯示，心肌局部缺血后對心臟造成的初始損傷會因白血球進入受損組織而進一步惡化，從而引起更進一步的損傷(Vedder等人)5。其它由粘附機制調介的炎癥性或需治療的病癥包括，(例如)哮喘病6-8、阿爾茨海默氏病、動脈粥樣硬化9-10、AIDS癡呆癥11、糖尿病12-14(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病15(包括潰瘍性結腸炎和克隆氏病(Crohn’s disease))、多發(fā)性硬化癥16-17、類風濕性關節(jié)炎18-21、組織移植22、腫瘤轉移23-28、腦膜炎、腦炎、中風和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及白血球調介的急性肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
已揭示，經(jīng)取代的氨基嘧啶，作為一類化合物，可抑制VLA-4與VCAM-1的結合，因此呈現(xiàn)抗炎癥的特性。盡管這些化合物對此類結合具有拮抗性，但這些化合物的生物利用率提高將會增強其效能。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)與先前揭示的其它經(jīng)取代的氨基嘧啶化合物相比，當通過其AUC測量時，某些N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺?；交奏?4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物具有出乎意料高的生物利用率。
在其組合物的一個方面中，本發(fā)明涉及一式(I)化合物
其中每一X均獨立為氟、氯或溴；p為一0到3的整數(shù)；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、吡咯基、2，5-二氫吡咯-1-基、哌啶基或1，2，3，6-四氫吡啶-1-基；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一較佳實施例中，R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團。
在一較佳實施例中，本發(fā)明提供若干式(II)化合物 其中每一X均獨立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；
及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一尤其較佳實施例中，本發(fā)明提供若干式(III)化合物 其中每一X均獨立為氟或氯；n為0或1；R2為-CH2-R1，其中R1選自由氫、甲基或-CH＝CH2組成的群組；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在其組合物的另一方面中，本發(fā)明涉及一式(IV)化合物 其中每一X均獨立為氟、氯或溴；p為一0到3的整數(shù)；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、吡咯基、2，5-二氫吡咯-1-基、哌啶基或1，2，3，6-四氫吡啶-1-基；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一較佳實施例中，R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團并且R2為炔丙基。
在一較佳實施例中，本發(fā)明提供若干式(V)化合物 其中每一X均獨立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2為低碳炔基；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
在一尤其較佳實施例中，本發(fā)明提供若干式(VI)化合物 其中每一X均獨立為氟或氯；n為0或1；
R2為低碳炔基；R1和R3及它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
本發(fā)明所涵蓋的N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺?；交奏?4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物包括下表I所列的那些表I
本發(fā)明所涵蓋的特定化合物包括以下化合物。下文所用的這些化合物根據(jù)苯丙氨酸衍生物命名，但或者，這些化合物也可根據(jù)N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺?；交?嘧啶-4-基]-p-羰氧基苯丙氨酸衍生物或2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-p-氨甲?；?苯基丙酸衍生物命名。
N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺酰基)-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
另一方面，本發(fā)明提供若干包含一醫(yī)藥上可接受載劑及一治療有效量的本文所定義化合物的醫(yī)藥組合物。
在其一方法方面中，本發(fā)明涉及一種用于治療一患者至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)調介的疾病的方法，該方法包括投予一包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的本發(fā)明化合物的醫(yī)藥組合物。
本發(fā)明的化合物及醫(yī)藥組合物可用于治療至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)或白血球粘附調介的疾病狀況。該類疾病狀況包括，例如，哮喘病、阿爾茨海默氏病、動脈粥樣硬化、AIDS癡呆癥、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病(包括潰瘍性結腸炎和克隆氏病)、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、組織移植、腫瘤轉移、腦膜炎、腦炎、中風和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及白血球調介的急性肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
其它病癥包括(但不限于)炎癥性疾病，例如，結節(jié)性紅斑、過敏性結膜炎、視神經(jīng)炎、葡萄膜炎、過敏性鼻炎、強直性脊椎炎、干癬性關節(jié)炎、血管炎、萊特爾綜合征(Reiter′s syndrome)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、進行性系統(tǒng)性硬化癥、多肌炎、皮肌炎、韋格納氏肉牙腫病(Wegner′s granulomatosis)、主動脈炎、類肉瘤病(sarcoidosis)、淋巴細胞減少癥、顳動脈炎、心包炎、心肌炎、充血性心臟衰竭、結節(jié)性多動脈炎、過敏綜合征、過敏癥、嗜酸細胞過多綜合征、Churg-Strauss綜合征、慢性阻塞性肺病、過敏性肺炎、慢性活動性肝炎、間質性膀胱炎、自體免疫性內分泌衰竭、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自體免疫性再生障礙性貧血、慢性遷延性肝炎及甲狀腺炎。
在一較佳實施例中，該病癥為一炎癥性疾病。
具體實施例方式
如上述，本發(fā)明涉及可抑制白血球粘附并且尤其是至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)調介的白血球粘附的化合物。然而，在進一步詳細闡述本發(fā)明之前，首先定義以下術語。
除非另有說明，否則在說明書及專利申請范圍中所用的以下術語具有以下涵義本文所用“低碳烷基”指具有1至5個碳原子的單價烷基基團，其包括直鏈及具支鏈的烷基基團。該術語可用(例如)甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基等基團來舉例說明。
本文所用“低碳亞烷基”指具有1至4個碳原子的二價亞烷基基團，其包括直鏈及具支鏈的亞烷基基團。該術語可用(例如)亞甲基、亞乙基、正亞丙基、異亞丙基、(-CH2CH(CH3)-及-CH(CH3)CH2-)等基團來舉例說明。
術語“低碳烯基”指一較佳具有2至6個碳原子且具有至少1個(較佳僅1個)烯基不飽和位點(即，＞C＝C＜)的烯基基團。該術語可用(例如)烯丙基、乙烯基、丙烯基、丁烯基等基團來舉例說明。
術語“低碳炔基”指一較佳具有2至6個碳原子且具有至少1個(較佳僅1個)炔基不飽和位點(即，-C≡C-)的炔基基團。該術語可通過(例如)乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2-C≡CH)、3-丁炔基(-CH2CH2C≡CH3)等基團來舉例說明。
“低碳環(huán)烷基”指具有一單環(huán)的3至6個碳原子的環(huán)烷基基團，其包括(例如)環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基及環(huán)己基。
術語“低碳亞烷基環(huán)烷基”指由如本文所定義的一低碳亞烷基-低碳環(huán)烷基組成的基團。該類基團可用亞甲基環(huán)丙基(-CH2-環(huán)丙基)、亞乙基環(huán)丙基等來舉例說明。
“醫(yī)藥上可接受的載劑”指一可用于制備一醫(yī)藥組合物的載劑，其通常安全、無毒并且在生物學上及其它方面皆無不良后果，包括一可滿足獸醫(yī)應用以及人類醫(yī)藥應用要求的載劑。說明書及權利要求書中所用的“一醫(yī)藥上可接受的載劑”包括一種或一種以上該載劑。
“治療”一疾病包括(1)預防該疾病，即，使一暴露于該疾病下或易感染該疾病但尚未患病或尚未表現(xiàn)出該疾病癥狀的哺乳動物該疾病的臨床癥狀不再發(fā)展。
(2)抑制該疾病，即，阻止或減輕該疾病的發(fā)展或其臨床癥狀；或(3)減輕該疾病，即，使該疾病或其臨床癥狀消退。
一“治療有效量”指，當投予一哺乳動物用以治療一疾病時，一化合物足以實現(xiàn)該疾病的上述治療的量。該“治療有效量”將視該化合物、該疾病及其嚴重程度以及待治療的哺乳動物的年齡、體重等情況而不同。
“醫(yī)藥上可接受的鹽”指一式I化合物的醫(yī)藥上可接受的鹽，該些鹽來源于多種在此項技術中習知的有機和無機抗衡離子，包括(僅舉例而言)鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨等；并且當該分子包含一堿性官能團時，指有機或無機酸的鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽等。
整合素是一大類同源跨膜聯(lián)接蛋白，其為動物細胞上用于與大多數(shù)細胞外基質蛋白(例如膠原、纖維連接蛋白、層粘聯(lián)蛋白)結合的主要受體。整合素為由一α鏈與一β鏈構成的異源二聚體。迄今，人們已經(jīng)鑒別出20種不同的整合素異源二聚體，它們由9種不同的α亞單位及14種不同的β亞單位構成。術語“α4整合素”指異源二聚體類酶聯(lián)細胞表面受體，其包含與這些β亞單位中的任一個配對的α4亞單位。VLA-4是一α4整合素的實例，并且是α4和β1亞單位的異源二聚體，其亦稱為α4β1整合素。
化合物制備本發(fā)明之化合物可用以下實例中闡明的方法和程序由易獲得的起始材料制得。這些方法和程序概括說明了制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺?；交奏?4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物的特定反應方案。涵蓋于本發(fā)明但在這些實例和方法中未舉例說明的化合物可通過購得的或此項技術中習知的起始材料之適當取代而容易地制得。
用于制備本發(fā)明化合物的其它程序和反應條件將在以下述實例中加以闡述。另外，可用于制備在本發(fā)明某些方面中有用的化合物的其它程序揭示于2002年12月10日頒布的美國專利第6,492,372號中；該專利案的揭示內容以引用的方式并入本文中。
醫(yī)藥調配物當作為藥物使用時，本發(fā)明的化合物通常以醫(yī)藥組合物的形式投與。這些組合物可通過包括經(jīng)口、經(jīng)直腸、經(jīng)皮膚、經(jīng)皮下、經(jīng)靜脈內、經(jīng)肌內及經(jīng)鼻內在內的多種途徑投與。這些組合物通過注射和口服二者均有效。該類組合物可用制藥技術中熟知的一種方法制備且其包含至少一種活性化合物。
本發(fā)明亦涵蓋含有一或多種與醫(yī)藥上可接受載劑聯(lián)合的上述式I化合物作為活性成分的醫(yī)藥組合物。在制備本發(fā)明組合物時，通常將該活性成分與一賦形劑混合，用一賦形劑稀釋或將入一可為膠囊、小袋、紙或其它容器形式的載劑中。所用賦形劑通常是一適合投予人類受試者或其它哺乳動物的賦形劑。當該賦形劑用做一稀釋劑時，其可為一固體、半固體或液體材料，對活性成分起媒劑、載劑或媒介的作用。因此，這些組合物可呈片劑、丸劑、散劑、含片、小袋、藥丸、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(作為固體或在液體媒介中)、軟膏(包含例如多達10重量％的活性化合物)、軟質明膠及硬質明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液、無菌包裝的粉末的形式。
在制備一調配物時，該活性化合物在與其它成分混合之前可能需磨細以提供適合的粒徑。如果該活性化合物實質不溶，則通常將其磨細至粒徑小于200網(wǎng)目。如果該活性化合物實質可溶于水，則一般通過磨細將粒徑調節(jié)至使得其在調配物中可實質均勻分布，例如約40網(wǎng)目。
適宜賦形劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、磺蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿及甲基纖維素。這些調配物可另外包括潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；潤濕劑；乳化及懸浮劑；防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯及羥基苯甲酸丙酯；增甜劑；及調味劑。本發(fā)明的組合物可采用此項技術中熟知的方法調配成在投予患者后能實現(xiàn)活性成分的快速、持久或延遲釋放。
較佳將這些組合物調配成單位劑量形式，每一劑量含約5至約100mg且更通常約10至約30mg的活性成分。術語“單位劑量形式”指適宜作為單一劑量用于人類受試者或其它哺乳動物的物理分立單位，每一單位含一經(jīng)計算與一適宜醫(yī)藥賦形劑聯(lián)合可產(chǎn)生期望治療效果的預定量的活性材料。
該活性化合物的有效劑量范圍甚廣，并且通常以一在醫(yī)藥上有效的量投與。然而，應了解，該化合物的實際投與量將由醫(yī)生根據(jù)包括下列的相關情況決定欲治療的病癥、所選投藥途徑、實際投與的化合物、個體患者的年齡、體重和反應、患者癥狀的嚴重程度等。
對于制備例如片劑等固體組合物，可將主要活性成分與一醫(yī)藥賦形劑混合以形成一包含本發(fā)明一化合物的均勻混合物的固態(tài)預調配組合物。當將這些預調配組合物稱為均勻時，是指該活性成分均勻地擴散至該組合物各處，使得該組合物可容易地細分成等效單位劑型，例如，片劑、丸劑及膠囊。然后，將此固態(tài)預調配物細分成上述類型的單位劑型，其包含(例如)約0.1至約500mg的本發(fā)明活性成分。
本發(fā)明的片劑或丸劑可經(jīng)包覆或以另外的方式配制，以提供一具有持久作用的優(yōu)點的劑型。例如，該片劑或丸劑可包含一內部劑量組份及一外部劑量組份，后者呈一包膜形式包覆于前者的表面上。這兩種組份可通過一腸溶性層分開，該腸溶性層用以抵抗胃內的分解作用，從而允許內部組份完整地進入十二指腸或延遲釋放。該類腸溶性層或包衣可使用多種材料，包括大量聚合酸及聚合酸與蟲膠、十六烷醇及乙酸纖維素等材料的混合物。
本發(fā)明新穎組合物可摻配成液體形式供經(jīng)口或注射投與，其形式包括水溶液、經(jīng)適當調味的糖漿、水性或油性懸浮液及具有可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的經(jīng)調味乳劑以及酏劑及類似的醫(yī)藥賦媒劑。
供吸入或噴入用的組合物包括在醫(yī)藥上可接受的水性或有機溶劑中的溶液和懸浮液或其混合物及粉末。這些液體或固體組合物可包含如上文所述的在醫(yī)藥上可接受的適當賦形劑。這些組合物較佳通過口或鼻呼吸的途徑投與以獲得局部或全身效果。在較佳醫(yī)藥上可接受的溶劑中的組合物可通過使用惰性氣體霧化。經(jīng)霧化的溶液可從霧化裝置直接吸入或可將該霧化裝置附裝至一面罩帷罩或間歇式正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組合物可較佳從以恰當方式遞送調配物的裝置以經(jīng)口或經(jīng)鼻方式投與。
以下調配物實例可說明本發(fā)明的醫(yī)藥組合物。
調配物實例1制備包含以下成分的硬質明膠膠囊數(shù)量成分(mg/膠囊)活性成分 30.0淀粉 305.0硬脂酸鎂 5.0將以上成分混合并按照340mg的量充入硬質明膠膠囊。
調配物實例2用以下成分制備一片劑調配物數(shù)量成分(mg/片)活性成分 25.0微晶纖維素 200.0膠狀二氧化硅 10.0硬脂酸 5.0將該些組份混合并壓制成片劑，每片重240mg。
調配物實例3制備一包含以下組份的干燥粉末吸入器調配物成分重量％活性成分 5乳糖 95將活性混合物與乳糖混合并添加入一干燥粉末吸入器具。
調配物實例4按下述制備每片含30mg活性成分的片劑數(shù)量成分(mg/片)活性成分 30.0mg淀粉 45.0mg微晶纖維素35.0mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液) 4.0mg羧甲基淀粉鈉 4.5mg硬脂酸鎂 0.5mg滑石粉1.0mg合計 120mg使活性成分、淀粉及纖維素通過20號網(wǎng)目美國篩并充分混合。
將聚乙烯吡咯烷酮溶液與所得粉末混合，然后使其通過16網(wǎng)目美國篩。將這樣制得的顆粒在50℃至60℃下干燥并使其通過16網(wǎng)目美國篩。將預先通過30網(wǎng)目美國篩的羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂及滑石粉添加至該些顆粒中，混合后，在一制片機上將其壓制，得到每片重120mg的片劑。
調配物實例5按下述制成每粒含40mg藥物的膠囊成分數(shù)量(mg/膠囊)活性成分 40.0mg淀粉 109.0mg硬脂酸鎂1.0mg合計 150.0mg
將活性成分、淀粉及硬脂酸鎂混合，使其通過一20號網(wǎng)目美國篩，再以150mg的量充入硬質明膠膠囊中。
調配物實例6按下述制成每支包含25mg活性成分的栓劑成分數(shù)量活性成分 25mg飽和脂肪酸甘油酯 2,000mg使活性成分通過一60網(wǎng)目美國篩，并懸浮于預先用最少所需熱量熔化的飽和脂肪酸甘油脂中。然后將該混合物注入一標稱容量為2.0g的栓劑模具中并使其冷卻。
調配物實例7按下述制成每5.0mL劑量包含50mg藥物的懸浮液成分 數(shù)量活性成分 50.0mg黃原膠 4.0mg羧甲基纖維素鈉(11％)微晶纖維素(89％) 50.0mg蔗糖 1.75g苯甲酸鈉 10.0mg調味劑及顏料 適量純水至 5.0ml將藥物、蔗糖及黃原膠混合，使其通過一10號網(wǎng)目美國篩，然后與一預先配制的微晶纖維素與羧甲基纖維素鈉的水溶液混合。將苯甲酸鈉、調味劑及染色劑用一些水稀釋，邊添加邊攪拌。然后添加足量的水以得到所需體積。
調配物實例8數(shù)量成分(mg/膠囊)活性成分 15.0mg淀粉 407.0mg硬脂酸鎂3.0mg合計 425.0mg
將活性成分、淀粉及硬脂酸鎂混合，使其通過一20號網(wǎng)目美國篩，再以425mg的量充入硬質明膠膠囊中。
調配物實例9按下述可制備一靜脈內調配物成分數(shù)量活性成分 250.0mg等滲鹽水 1000亳升調配物實例10按下述可制備一局部用調配物成分數(shù)量活性成分1至10g乳化蠟 30g液體石蠟20g白色軟石蠟 至100g將白色軟石蠟加熱至熔化。納入液狀石蠟及乳化蠟并攪拌至溶解。向其中添加活性成分并繼續(xù)攪拌至散開。然后將該混合物冷卻成固體。
本發(fā)明方法中采用的另一較佳調配物使用經(jīng)皮遞藥裝置(“貼片”)。該類經(jīng)皮貼片可用來以經(jīng)控制數(shù)量連續(xù)或不連續(xù)輸注本發(fā)明化合物。遞送藥劑用的經(jīng)皮貼片的制造及使用方法在此項技術中為人熟知。參見(例如)1991年6月11日頒布的美國專利第5,023,252號，其以引用的方式并入本文中。該類貼片可制造成用于持續(xù)地、間斷地或按需要遞送藥劑。
當期望或需要將醫(yī)藥組合物導入大腦時，可使用直接或間接放置技術。直接技術通常涉及將一藥物遞送管置于受試者的腦室系統(tǒng)中來繞過血腦屏障。美國專利第5,011,472號揭示一用來將生物學因子輸送至身體的特定解剖學區(qū)域的此類可植入遞藥系統(tǒng)，該專利案以引用的方式并入本文中。
通常較佳的間接技術一般涉及通過將親水性藥物轉變成脂溶性藥物而將該組合物調配成可提供藥物潛伏化作用。潛伏化作用通常通過阻斷藥物中的羥基、羰基、硫酸根及伯氨基基團來實現(xiàn)以使藥物更易溶于脂質中且更易穿過血腦屏障?；蛘?，親水性藥物的遞送可通過靜脈內輸注能迅速打開血腦屏障的高滲溶液來增強。
功用本發(fā)明化合物可通過競爭性地結合α4整合素(較佳VLA-4)來抑制活體內至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)調介的白血球對內皮細胞的粘附。因此，本發(fā)明化合物可用于治療哺乳動物至少部分由α4整合素(較佳VLA-4)或白血球粘附調介的疾病。這些疾病包括哺乳動物患者的炎癥性疾病，(例如)哮喘病、阿爾茨海默氏病、動脈粥樣硬化、AIDS癡呆癥、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎癥性腸病(包括潰瘍性結腸炎及克隆氏病)、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、組織移植、腫瘤轉移、腦膜炎、腦炎、中風和其它大腦創(chuàng)傷、腎炎、視網(wǎng)膜炎、異位性皮膚炎、干癬、心肌局部缺血及急性白血球調介的肺部損傷(例如在成人呼吸窘迫癥候群中發(fā)生的損傷)。
投予哺乳動物患者的藥量將視所投與藥物、投藥目的(例如預防或治療)、患者狀況、投與方式等而有所不同。在治療應用中，將組合物以一足以治愈或至少部分阻止該疾病及其并發(fā)癥的癥狀的量投予一已患病患者。一足以達成此目的的量定義為“治療有效劑量”。對此用途有效的藥量將取決于所治療疾病以及臨床主治醫(yī)師依照(例如)炎癥的嚴重程度、患者的年齡、體重及綜合情況等作出的判斷。
投予患者的組合物呈上述醫(yī)藥組合物的形式。這些組合物可通過常規(guī)的滅菌技術滅菌或可過濾滅菌。所得水性溶液可于包裝后按原樣使用或凍干，投藥前再將此凍干制劑與一無菌水性載劑組合。該化合物制劑的pH值通常介于3與11之間，較佳為5至9且最佳為7至8。應了解，使用某些上述賦形劑、載劑或穩(wěn)定劑將會導致形成醫(yī)藥鹽。
本發(fā)明化合物的治療劑量將視(例如)所進行的治療的特定用途、該化合物的投藥方式、患者的健康狀況和狀態(tài)及處方醫(yī)師的判斷而不同。例如，對于靜脈內投藥，該劑量通常介于約20μg至約500μg/千克體重之間，較佳為約100μg至約300μg/千克體重。鼻內投藥之適宜劑量范圍通常為約0.1pg至1mg/千克體重。有效劑量可從得自活體內或動物模型測試系統(tǒng)的劑量反應曲線推知。
以下合成及生物學實例意欲舉例說明本發(fā)明，而無論如何不能將其理解為限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，否則所有溫度都是以攝氏溫度表示。
實例在下面實例中，下列縮寫具有以下涵義。如果有的縮寫未加以定義，則其具有公認的涵義。
AUC ＝ 曲線下面積bd＝ 寬雙峰bs＝ 寬單峰BSA ＝ 牛血清白蛋白d ＝ 雙峰DMAP ＝ 4-N，N-二甲氨基吡啶乙基碳化二亞氨鹽酸鹽EDTA ＝ 乙二胺四乙酸EtOAc＝ 乙酸乙酯EtOH ＝ 乙醇eq. ＝ 當量的FACS ＝ 熒光激活細胞分選儀FITC ＝ 異硫氰酸熒光素g ＝ 克i.p. ＝ 腹腔內h ＝ 小時HBSS ＝ 翰克司平衡鹽溶液(Hank′s Balanced Saline Solution)Hct ＝ 血細胞比容或一定容積的血樣中通過離心獲得的迭集紅細胞的量度HB或Hb ＝ 血紅蛋白HEPES＝ 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-乙磺酸IgG Fc ＝ 免疫球蛋白的一結合域kg ＝ 千克L＝ 升m＝ 多重峰(與NMR數(shù)據(jù)一起使用時)M＝ 摩爾的(molar)MCH ＝ 平均紅細胞血紅蛋白含量；Hb/RBC
MCHC ＝ 以百分數(shù)表示的平均紅細胞血紅蛋白計數(shù)；Hb/Hct.
MCV ＝ 平均紅細胞體積；紅細胞的平均體積，通常以每個紅細胞的立方微米數(shù)表示MeOH ＝ 甲醇mg＝ 毫克mL＝ 毫升mm＝ 毫米mM＝ 毫摩爾的(millimolar)mol ＝ 摩爾mmol ＝ 毫摩爾mpk ＝ 毫克/千克N ＝ 當量的ng＝ 納克PBS++ ＝ 磷酸鹽緩沖鹽水psi ＝ 磅/平方英寸q.s.或Q.S. ＝ 補足體積Rfs或Rf ＝ 保持系數(shù)rpm ＝ 每分鐘轉數(shù)rt或RT＝ 室溫s ＝ 單峰t ＝ 三重峰TFA ＝ 三氟乙酸THF ＝ 四氫呋喃TLC或tlc ＝ 薄層色譜法μL ＝ 微升μg ＝ 微克μm ＝ 微米Vt＝ 總體積WBC ＝ 白血球
w/v ＝ 重量/容積本發(fā)明的化合物可按照方案1中所示及以下方法所述制得。
實例1制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1制備2，4-二氯-5-硝基嘧啶(2)。依照Whittaker(J.Chem.Soc.1951，1565)的程序將5-硝基尿嘧啶(1)用磷酰氯(POCl3)和N，N-二甲基苯胺(PhNMe2)處理，得到化合物2?；衔?亦可以從City Chemical(West Haven，CT)獲得。
步驟2制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-L-酪氨酸叔丁基酯(3)。在-10℃下向L-酪氨酸叔丁基酯(H-Tyr(OH)-OtBu)(30.6g，0.129mol)溶于THF(250mL)的溶液內添加2，4-二氯-5-硝基嘧啶(25g，0.129mol)，在添加期間使溫度保持為低于5℃。添加結束后，隨即滴加N，N-二異丙基乙氨(EtiPr2N)(33.7mL，0.194mol)。在-10℃下攪拌1小時后，緩慢添加入二乙氨(Et2NH)(66.73mL，0.645mol)，然后將反應混合物加熱至室溫過夜。將反應混合物用二乙基醚(500mL)稀釋，并用0.2N檸檬酸(3×150mL)、水(1×150mL)及10％ K2CO3(3×150mL)洗滌有機層。對有機層進行干燥(Na2SO4)、過濾及真空濃縮，得到一黃色殘余物。將該殘余物通過快速色譜法(在硅膠上用20％ EtOAc/己烷)純化生成一37.39g(67％)黃色泡沫狀的化合物3。Rf＝0.21(在硅膠上用25％ EtOAc/己烷)。
步驟3制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(4)。向N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-L-酪氨酸叔丁基酯(37.39g，0.087mol)溶于CH2Cl2(150mL)的溶液中添加DMAP(10.59g，0.087mol)。5分鐘后，滴加三乙氨(TEA)(18.19mL，0.131mol)。滴加1-吡咯烷氨甲醯氯(14.42mL，0.131mol)并將反應物回流加熱(40℃)過夜。對反應混合物進行真空濃縮并用EtOAc(300mL)吸收。將有機相用0.2N檸檬酸(3×150mL)、水(1×150mL)、飽和NaHCO3(3×150mL)、鹽水(1×150mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾并真空濃縮后生成43.07g(94％)的黃色固體化合物4。Rf＝0.5(在硅膠上用50％ EtOAc/己烷)。
步驟4制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-氨基嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(5)。將N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(43.07g，0.081mol)和10％ Pd/C(4.3g，10重量％ Pd)溶于EtOH(200亳升)的混合物在45psi氫氣下?lián)u動，直到TLC(在硅膠上用50％ EtOAc/己烷)顯示100％轉化成產(chǎn)物(48小時)。然后使反應混合物濾過一硅藻土塞并真空濃縮，生成40.29g(100％)紫色泡沫狀化合物5。Rf＝0.11(在硅膠上用6∶1的EtOAc/己烷)。
步驟5制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(6)。用干冰/CH3CN浴將N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-氨基嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(40.29g，0.081mol)冷卻至-20℃。將混合物攪拌30分鐘，然后緩慢添加4-氯苯磺酰氯(17.06g，0.081mol)。在-20℃至-15℃下攪拌反應物4小時，然后將其升溫至室溫過夜。將反應混合物用EtOAc(400mL)稀釋，并用0.2N檸檬酸(3×150mL)、水(1×150mL)、飽和NaHCO3(3×150mL)、鹽水(1×150mL)洗滌有機層，過濾及真空濃縮后生成一褐色殘余物。將該殘余物通過快速色譜法(在硅膠上使用50％ EtOAc/己烷)純化生成一43.49g(80％)黃色泡沫狀化合物6。Rf＝0.35(在硅膠上用50％ EtOAc/己烷)。
步驟6制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(7)。向N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(42.92g，0.064mol)溶于丙酮(Me2CO)(600mL)的溶液中添加K2CO3(12.75g，0.096mL)，并在室溫下攪拌該混合物1小時。緩慢添加入碘乙烷(EtI)(7.73mL，0.096mol)，并在室溫下攪拌反應混合物過夜。對反應混合物進行真空濃縮，殘余物用EtOAc(300mL)吸收。用水(2×300mL)、鹽水(1×100mL)洗滌有機相，用Na2SO4干燥，進行過濾并真空濃縮。通過快速色譜法(在硅膠上使用2∶1己烷/EtOAc)純化殘余物，生成37.36g(85％)白色固體狀化合物7。Rf＝0.53(在硅膠上用50％ EtOAc/己烷)。
步驟7制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸鹽酸鹽(8)；將N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯(36.21g，0.052mol)的甲酸(500mL)溶液加熱至70℃并保持2小時，然后對其進行真空濃縮。將殘余物再次溶解于甲酸(500mL)中并再次在70℃下加熱2小時?；旌衔锏捏w積減少80％，然后將其用至少1當量的1.0N鹽酸(52mL，0.052mol)處理，隨后再用蒸餾水(100mL)處理。對所得非均勻混合物進行真空濃縮。添加蒸餾水(100mL)，對此非均勻混合物進行真空濃縮。將后面的步驟重復兩次，生成一濕白色產(chǎn)物。在40℃下將其放置在高真空下干燥7天，生成32.8g(93％)可自由流動的白色固體狀化合物8。Rf＝0.25(7/3 MeOH/H2O+0.1％ TFA，反相)。
1H NMR(CD3OD)δ8.22(bs，1H)，7.82-7.79(m，1H)，7.64-7.60(m，2H)，7.36-7.33(m，1H)，7.22-7.13(m，2H)，7.07-6.98(m，2H)，4.91-4.90(m，1H)，4.80-4.79(m，1H)，4.12-4.10(m，1H)，3.87-3.75(m，1H)，3.55-3.53(m，4H)，3.41-3.40(m，3H)，3.26-3.19(m，2H)，2.03(bs，1H)，1.97-1.89(m，3H)，1.27-1.15(m，6H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.97-0.92(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ175.8，175.7，166.5，162.7，162.2，155.8，155.7，155.7，152.6，148.1，147.7，142.0，138.5，136.2，132.6，132.3，131.9，131.7，123.7，111.8，111.5，62.3，57.8，44.9，38.7，38.0，27.4，26.6，15.3，14.9，14.7，14.0，13.9實例2制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、6及7按照實例1實施。步驟5用4-氟苯磺酰氯代替4-氯苯磺酰氯實施。
1H NMR(CD3OD)δ8.17(bs，1H)，7.90-7.87(m，2H)，7.40-7.34(m，2H)，7.20-7.16(m，1H)，7.08-7.00(m，3H)，5.52-5.51(m，1H)，4.96-4.93(m，2H)，5.78-5.70(m，1H)，3.85-3.75(m，1H)，3.59-3.53(m，4H)，4.47-4.43(m，2H)，3.44-3.24(m，2H)，2.02-1.94(m，3H)，1.24-1.16(m，6H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.99-0.94(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ133.0，132.9，132.5，132.2，123.7，123.6，118.6，57.1，44.3，38.3，27.3，26.6，14.7，14.1MS m/z 629.5(MH+)實例3制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例2實施。步驟6用硫酸二甲酯代替碘乙烷實施。
1HNMR(CD3OD)δ8.16(bs，1H)，7.89-7.88(m，1H)，7.39-7.35(m，3H)，7.20-7.13(m，1H)，7.05-7.00(m，2H)，4.85-4.84(m，1H)，4.14-4.12(m，1H)，3.59-3.54(m，5H)，3.45-3.44(m，2H)，3.45-3.33(m，3H)，3.13-3.12(m，1H)，3.02-3.01(m，1H)，2.04-1.95(m，4H)，1.29-1.18(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ176.5，169.8，166.9，166.4，156.2，152.7，151.8，150.4，136.8，133.3，133.2，132.5，123.7，118.8，118.5，57.8，57.1，48.3，44.5，41.0，38.8，27.5，26.7，14.1MS m/z 615.2(MH+)實例4制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例1實施。步驟6用硫酸二甲酯代替碘乙烷實施。
1H NMR(CD3OD)δ8.20(bs，1H)，7.83-7.80(m，2H)，7.67-7.64(m，IB)，7.37-7.34(m，1H)，7.21-7.18(m，1H)，7.10-7.03(m，2H)，4.88-4.87(m，1H)，4.13-4.10(m，1H)，3.55-3.45(m，6H)，3.42-3.40(m，2H)，3.24-3.23(m，2H)，3.11-3.10(m，1H)，3.02-3.01(m，1H)，2.04-2.03(m，1H)，1.98-1.90(m，3H)，1.28-1.18(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ176.0，166.4，161.8，155.9，155.4，152.6，146.5，142.2，137.6，137.4，136.4，132.5，131.9，123.7，114.6，62.4，58.1，57.7，45.0，40.8，38.6，38.3，27.4，26.6，15.3，13.9實例5制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例3實施。步驟3用1-哌啶羰酰氯代替1-吡咯烷羰酰氯實施。
1H NMR(CD3OD)δ8.16(bs，1H)，7.90-7.88(m，2H)，7.40-7.35(m，2H)，7.21-7.20(m，1H)，7.14-7.13(m，1H)，7.02-7.01(m，2H)，5.51(bs，1H)，4.83-4.77(m，1H)，3.64-3.53(m，6H)，3.34-3.33(m，2H)，3.20-3.17(m，1H)，3.12-3.11(m，2H)，3.02-3.01(m，1H)，1.68-1.65(m，6H)，1.19-1.17(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ185.0，169.7，166.3，152.7，136.6，135.0，133.2，133.0，132.5，131.8，126.3，123.6，121.7，118.6，118.3，57.6，54.5，46.9，44.3，39.6，38.7，27.6，25.9，14.0實例6制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例2實施。步驟3用1-哌啶羰酰氯代替1-吡咯烷羰酰氯實施。
1H NMR(CD3OD)δ8.17(bs，1H)，7.91-7.85(m，2H)，7.39-7.31(m，3H)，7.20-7.16(m，1H)，7.05-6.97(m，2H)，4.88-4.69(m，2H)，4.71-4.69(m，1H)，3.80-3.75(m，1H)，3.62-3.39(m，6H)，3.34-3.32(m，2H)，3.30-3.16(m，3H)，1.68-1.65(m，4H)，1.23-1.17(m，6H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.99-0.94(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ199.9，187.6，183,1，176.2，169.7，166.3，163.0，162.7，153.9，152.9，136.5，133.1，133.0，132.7，132.4，123.8，118.8，118.4，111.1，110.6，102.8，79.4，57.3，55.4，44.4，38.9，38.4，27.7，26.1，15.1，14.8，14.3，14.2實例7制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例2實施。步驟3按以下程序實施。
1H NMR(CD3OD)δ7.92-7.86(m，2H)，7.41-7.32(m，3H)，7.22(d，1H)，7.04-6.91(m，3H)，4.29-3.98(m，4H)，3.88-3.72(m，1H)，3.69-3.37(m，4H)，2.40-2.24(m，2H)，1.28-1.11(m，6H)，1.10-1.00(t，1.5H)，1.01-0.89(t，1.5H)13C NMR(CD3OD)δ174.2，169.7，166.4，163.2，162.8，157.0，153.3，153.2，152.4，144.3，143.8，136.1，135.6，135.5，133.2，133.1，132.5，132.2，123.7，118.9，118.6，112.9，112.6，57.5，38.1，37.7，17.4，14.7，14.5，13.8，13.7
MS m/z 615(MH+)另一制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯的方法。向-15℃的化合物3(24.9g，0.0578mol)與氯甲酸4-硝基苯酯(11.7g，0.0578mmol)溶于CH2Cl2(300mL)的經(jīng)攪拌溶液中添加三乙氨(24.2mL，0.173mol)，添加速度需保證反應混合物的溫度不超過-10℃。攪拌20分鐘后，滴加氮雜環(huán)丁烷(3.30g，0.0578mmol)，然后加熱反應混合物至室溫并攪拌過夜。將反應混合物用EtOAc(100mL)及己烷(100mL)稀釋，然后用10％的K2CO3水溶液重復萃取，直到在水相中看不到黃色(4-硝基酚)為止。將有機層用鹽水(75mL)洗滌，用MgSO4干燥，過濾并蒸發(fā)后生成28.5g(96％)黃色固體N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-硝基嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸叔丁基酯，其不加以純化即可使用。Rf＝0.17(在硅膠上用2∶5 EtOAc/己烷)。
實例8制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例7實施。步驟6用硫酸二甲酯代替碘乙烷實施。
1H NMR(CD3OD)δ7.95-7.76(m，2H)，7.44-7.11(m，4H)，7.01-6.83(m，3H)，4.30-3.93(m，4H)，3.66-3.41(m，4H)，3.14-2.92(m，3H)，2.42-2.21(m，2H)，1.32-1.01(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ152.3，136.3，133.4，133.2，132.4，123.6，118.8，118.5，38.2，17.4，13.8MS m/z 601(MH+)實例9制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、6及7按照實例8實施。步驟5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實施。
1H NMR(CD3OD)δ7.83(d，2H)，7.67(d，2H)，7.36-7.18(m，2H)，7.06-6.86(m，3H)，4.29-3.97(m，4H)，3.66-3.34(m，5H)，3.15-2.95(m，4H)，2.41-2.22(m，2H)1.26-1.06(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ157.2，153.0，152.5，142.9，142.5，136.4，132.5，132.1，132.0，123.8，57.9，52.2，40.7，38.0，17.4，13.6MS m/z 617(MH+)實例10制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、6及7按照實例7實施。步驟5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實施。
1H NMR(CD3OD)δ7.86-7.76(m，2H)，7.70-7.60(m，2H)，7.32(bd，1H)，7.21(bd，1H)，7.03-6.97(m，2H)，6.90(bs，1H)，4.29-4.00(m，4H)，3.89-3.72(m，1H)，3.70-3.36(m，5H)，3.28-3.10(m，2H)，2.42-2.24(m，2H)，1.28-1.13(m，6H)，1.11-1.02(t，1.5H)，1.01-0.90(t，1.5H)MS m/z 631(MH+)實例11制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、6及7按照實例3實施。步驟5用2，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實施。
1H NMR(CDCl3)δ1.16(bs，6H)，1.93(bs，4H)，2.50-3.75(m，13H)，4.83(bs，1H)，6.60-7.40(m，7H)，7.60(bs，1H)，7.77(m，1H)，9.41(bs，1H)實例12制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、6及7按照實例2實施。步驟5用2，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯實施。
1H NMR(CDCl3)δ0.91(t，J＝6.9，1.8H)，1.12(m，7.2H)，1.92(bs，4H)，2.50-4.00(m，13H)s4.78(m，0.6H)，4.88(m，0.4H)，6.55(d，J＝6.9，0.4H)，6.77(d，J＝6.3，0.6H)，6.80-7.38(m，6H)，7.51(s，0.4H)，7.58(s，0.6H)，7.74(m，1H)，9.33(m，1H)實例13制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例11實施。步驟3按實例7實施。
1H NMR(CDCl3)δ1,14(t，j＝6.6，6H)，2.32(m，2H)，2.50-3.80(m，9H)，4.13(m，4H)，4.62(m，0.6H)，4.81(m，0.4H)，5.81(bd，0.6H)，5.90(bd，0.4H)，6.90-7.40(m，7H)，7.77(m，1H)MS m/z 619.2(MH+)實例14制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例12實施。步驟3按照實例7實施。
1H NMR(CDCl3)δ0.89(t，J＝6.7，1.8H)，1.16(m，7.2H)，2.28(m，2H)，3.00-4.00(m，8H)，4.09(bs，4H)，4.79(m，0.6H)，4.88(m，0.4H)，6.80-7.30(m，7H)，7.57(s，0.4H)，7.62(s，0.6H)，7.75(m，1H)，11.9(bs，1H)MS m/z 633.2(MH+)實例15制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例2實施。步驟6用炔丙基溴代替碘乙烷實施。
1H NMR(CDCl3)δ1.18(m，6H)，1.93(bs，4H)，2.37(s，1H)，3.00-3.70(m，10H)，3.80(d，J＝21.3，0.6H)，3.98(d，J＝18.3，0.4H)，4.51(m，1H)，4.88(m，1H)，6.75-7.35(m，7H)，7.58(s，0.6H)，7.63(s，0.4H)s7.86(m，2H)，9.71(bs，1H)
實例16制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例11實施。步驟6用炔丙基溴代替硫酸二甲酯實施。
1H NMR(CDCl3)δ1.17(m，6H)，1.94(m，4H)，2.40(m，1H)，3.00-3.75(m，10H)，3.99(d，J＝18.0，0.6H)，4.18(d，J＝18.0，0.4H)，4.50(m，1H)，4.90(m，1H)，6.75-7.35(m，7H)，7.81(m，2H)，10.0(bs，1H)實例17制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺酰基)-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、4、5、6及7按照實例16實施。步驟3按照實例7實施。
1H NMR(CDCl3)δ1.18(m，6H)，2.34(m，3H)，3.00-3.75(m，6H)，3.80-4.25(m，5H)，4.47(m，1H)，4.89(m，1H)，6.75-7.35(m，7H)，7.79(m，2H)，10.3(bs，1H)MS m/z 643.2(MH+)實例18制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例7實施。步驟6用炔丙基溴代替碘乙烷實施。
1H NMR(CDCl3)δ1.25(m，6H)，2.28(m，3H)，3,00-3.75(m，6H)，3.80-4.25(m，5H)，4.47(m，1H)，4.89(m，1H)，6.75-7.35(m，7H)，7.57(s，0.6H)，7.62(s，0.4H)，7.79(m，2H)，10.6(bs，1H)MS m/z 625.2(MH+)實例19制備N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸步驟1、2、3、4、5及7按照實例1實施。步驟6用炔丙基溴代替碘乙烷實施。
1H NMR(CD3OD)δ8.13(s，1H)，7.86-7.82(m，2H)，7.62-7.58(m，2H)，7.32-7.28(m，2H)，7.19-7.17(m，1H)，7.04-6.98(m，2H)，4.83-4.5(m，2H)，4.12-3.82(m，1H)，3.63-3.37(m，8H)，3.27-3.08(m，2H)，2.72(bs，1H)，2.04-1.86(m，4H)，1.24-1.07(m，6H)13C NMR(CD3OD)δ177.2，176.5，162.7，156.7，155.7，154.5，153,2，142.6，140.3，137.4，137,3，133.1，132.9，132.8，132.7，132.2，132.1，124.3，111.3，80.5，80.3，77.7，58.2，57.7，44.9，43.4，28.1，27.3，14.8，14.7MS m/z 655(MH+)以下方法可用于測試本發(fā)明的化合物。
實例Aα4β1整合素粘附性分析Jurkat細胞對人血漿纖維連接蛋白的粘附性程序在4℃下將96孔板(Costar 3590 EIA板)用濃度為10μg/mL的人類纖維連接蛋白(Gibco/BRL，cat #33016-023)涂覆并過夜。然后將板用牛血清白蛋白(BSA，0.3％)溶于鹽水的溶液封阻。按照生產(chǎn)商的說明書用Calcein AM對Jurkat細胞(保持在對數(shù)生長期)進行標記，并使其以2×106細胞/mL的濃度懸浮于Hepes/鹽水/BSA中。然后，在室溫下使細胞經(jīng)受測試化合物及對照化合物作用30分鐘，再轉移至經(jīng)纖維連接蛋白涂覆的板的單個加樣孔中。在37℃下使粘附進行35分鐘。然后使用新鮮鹽水通過輕緩的抽吸和移液來洗滌這些加樣孔。用一熒光板讀數(shù)器在EX 485/EM 530處定量與剩余粘附細胞相關的熒光。
細胞培養(yǎng)物可通過以下方法來制備首先在第1天以1∶10、在第2天以1∶2對處于靜止期的Jurkat細胞進行分樣，并在第3天進行分析。在第3天以1∶4對第1天以1∶10分樣的細胞進行分樣以供第4天分析之用。
分析板可通過以下制備首先配制10μg/mL的Gibco/BRL人類纖維連接蛋白(cat #33016-023)溶于PBS++的工作溶液。然后在室溫下以50mL/加樣孔將一Costar 3590 EIA板浸漬2小時(認為其亦可在4℃下過夜)。最后，在室溫下用Hepes/鹽水緩沖液以100μL/加樣孔的量對該板進行抽吸并封阻1小時，隨后用150μL的PBS++洗滌3次。
化合物的稀釋可通過以如下方式制備化合物1∶3的連續(xù)稀釋液來完成。對于每一板(4種化合物/板)，將600μL添加至位于一滴定架上的4個Bio-Rad滴定管中。用此項技術中熟知的方法將足量化合物添加至每一適合的管內，以得到2X濃度。用Falcon Flexiplate，將100μL Hepes/鹽水緩沖液或人類血清添加至B至G排。使用一設定至180μL且具有四個間隔均勻的吸頭的多道移液管。將每組四個管混合5次，并將180μL 2X化合物轉移至B行第1列的每一化合物稀釋液中，A行保持空白。將180μL添加至A行的其它加樣孔中。通過轉移50μL至下一稀釋液并混合5次來沿該板連續(xù)地進行稀釋，每次混合后都更換吸頭。在F行處停止稀釋。G行不含有化合物。
20μg/mL的21/6抗體溶于Hepes/鹽水緩沖液或人類血清的溶液作為陽性對照，其擱置于一試劑槽中以添加至細胞懸浮板。
細胞染色可通過以下方法實現(xiàn)首先通過在50mL試管內離心(1100rpm，5分鐘)來獲得對數(shù)期的Jurkat細胞。將細胞重新懸浮于50mL PBS++中，旋轉并再次懸浮于20mL PBS++中。添加入20μL Calcein AM對細胞染色30分鐘。用Hepes/鹽水緩沖液將容積補足至50mL并對細胞進行計數(shù)，旋轉并再次以2×106細胞/mL懸浮于Hepes/鹽水緩沖液或人類血清中。
將化合物使用以下程序培養(yǎng)。在一新的撓性板中，將65μL已染色的細胞添加至B至H行。然后，按照板的布置將65μL 2X化合物添加至適宜的行中，并混合3次。將65μL 2X-21/6抗體添加至H行中并混合3次。最后將板在室溫下培養(yǎng)30分鐘。
纖維連接蛋白粘附性在以下加工程序后用一熒光板讀數(shù)器在EX 485/EM 530處測得。將培養(yǎng)后的細胞混合3次并將100μL轉移至經(jīng)纖維連接蛋白涂覆的板上，在37℃下培養(yǎng)35分鐘。通過沿加樣孔的側邊輕輕地吸取100μL室溫的PBS++并將板翻轉90度抽吸來逐行洗滌每一塊板。重復此程序，共洗滌3次。洗滌后通過沿加樣孔的側面移液將用100μL充填各加樣孔。
在含人類血清和不含人類血清兩種情況下計算每一化合物的IC50值。IC50為生長或活性受到的抑制程度為50％時的濃度。數(shù)據(jù)列于下表中
細胞對人類血漿纖維連接蛋白的粘附性(不含人類血清)

細胞對人類血漿纖維連接蛋白的粘附性(含有人類血清)


實例B用于測定候選化合物與α4β1的結合的活體外飽和分析下文闡述一活體外分析，該分析用來測定一化合物要在下一實例所闡述的實驗性自體免疫性腦脊髓炎(“EAE”)模型中或在其它活體內模型中具有活性所需的血漿濃度。
將對數(shù)生長的Jurkat細胞洗滌并重新懸浮于含20μg/mL 15/7抗體的標準動物血漿內(Yednock，等人，J.Biol.Chem.，(1995)270(48)28740)。
將Jurkat細胞在含66μM至0.01μM不同濃度的已知候選化合物的標準血漿試樣中稀釋兩倍(使用一標準的12點連續(xù)稀釋，以得到一標準曲線)或在從候選化合物處理過的動物外周血液得到的血漿試樣中稀釋兩倍。
然后在室溫下將細胞培養(yǎng)30分鐘，用含2％胎牛血清及皆1mM的氯化鈣和氯化鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)(分析介質)洗滌兩次以去除未結合的15/7抗體。
然后使細胞接觸與藻紅蛋白偶聯(lián)的1∶200山羊F(ab′)2抗小鼠IgG Fc(Immunotech，Westbrook，ME)(其已經(jīng)通過與5％所研究動物物種的血清共同培養(yǎng)而被吸附用于提供任何非特異性交叉反應性)，并于4℃下在黑暗中培養(yǎng)30分鐘。
用分析介質將細胞洗滌兩次并重新懸浮于相同溶液中。然后用如Yednock等人在J.Biol.Chem(1995，27028740)所述的標準熒光激活細胞分選儀(“FACS”)分析對這些細胞進行分析。
然后將數(shù)據(jù)繪制成熒光-劑量曲線圖，例如以一標準的劑量反應形式。形成曲線上部平穩(wěn)段的劑量代表在活體內模型中獲得功效所需的量。
實例C用于測定生物利用率的卡匣式投藥及血清分析通過用一卡匣(即，每一投藥溶液中6種化合物的混合物)給大鼠服藥來篩選口服生物利用率。此卡匣包含5種測試對象及一標準化合物，總劑量為10mg/kg。用等摩爾的1N NaOH將每一化合物/測試對象轉換為鈉鹽并以2mg/mL溶于水中。通過等體積混合此六種溶液制成該卡匣藥。將此卡匣藥溶液充分混合，然后將pH值調節(jié)至7.5至9。該藥溶液在研究的前一天制備并在室溫下攪拌過夜。
該篩選中使用Charles River Laboratories的6至8周齡的雄性SpragueDawley(SD)大鼠。將大鼠隔離至少1天并允許持續(xù)進食及飲水。晚上在投與該卡匣藥之前，使大鼠禁食約16小時。
每一卡匣內指配4只SD大鼠。將一單次劑量的投藥溶液經(jīng)口投予每一只大鼠。記錄投藥量(5mL/kg)及投藥時間并在投藥兩小時后給予大鼠食物。
在以下時間點通過心臟穿刺采集血樣4小時、8小時及12小時。將大鼠用CO2氣體在10至20秒內麻醉以后立即采集血液。在采集完12小時的血樣后，通過CO2窒息法及隨后的頸部錯位法將大鼠無痛致死。
在處理血樣之前將其在低溫(4℃)下保存于經(jīng)肝素化的微量采血管中。將血樣離心(10000rpm，5分鐘)，取出血漿并儲存于-20℃的冷藏箱中直至進行藥物濃度分析。使用以下直接沉淀血漿的方案來分析血漿中的藥物濃度。
通過以下在一1.5mL 96孔板中制備活體內血漿試樣按順序添加100μL的測試血漿、150μL的甲醇，隨后旋轉10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的內部標準，并旋轉30秒鐘。
通過以下在一1.5mL 96孔板中制備標準曲線試樣按順序添加100μL的對照小鼠血漿、150μL的甲醇，并旋轉10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的內部標準的，并旋轉30秒鐘。將0至200ng(10種濃度)溶于50％甲醇中的相關化合物攙入試樣以獲得一0.5ng/mL至2,000ng/mL的標準曲線范圍。再一次將試樣渦旋30秒。
然后將試樣在Eppendorf微量離心機中以3000rpm離心20至30分鐘，再將80至90％的上清液轉移至一干凈的96孔板中。然后將有機溶劑蒸發(fā)直至試樣干燥(在40℃及氮氣下，30至60分鐘(ZymarkTurbovap))。
然后將殘余物溶解于200至600升流動相(50％ CH3OH/0.1％ TFA)中。繼而使用一PE-Sciex API-3000三級四極質譜儀、Perkin-Elmer、Series200自動采樣器及shimadzu 10A泵進行LC/MS/MS。用PE-Sciex Analyst(vl.1)進行采集并用PE-Sciex Analyst(vl.1)完成數(shù)據(jù)分析及定量。用25％ CH3OH、0.1％TFA-100％ CH3OH、0.1％ TFA的流動相將5至50μL量的試樣注射至一反相ThermoHypersil DASH-18柱上(Keystone 2.0×20mm，5μm，PN8823025-701)。以約300μL/分鐘的流速進行約8分鐘。
用線性梯形法則計算t＝0至最后取樣時間tx的曲線下面積(AUC)(參見Handbook of Basic Pharmacokinetics，Wolfgang A.Ritschel and Gregory L.Kearns，5thed，1999)。
AUC0-tx＝S((Cn+Cn+1)/2))(tn+1-tn)[(μg/mL)h]在卡匣投藥圖中，在血管外投藥后第4、8及12小時采樣，計算t＝0至t＝12h的AUC。計算每一個體動物的AUC0-12h值，在下表中報告平均AUC0-12h。


實例D哮喘病模型由α4β1整合素調介的炎癥性癥狀包括(例如)嗜酸性粒細胞匯聚、呼吸道過度反應及伴隨慢性哮喘病發(fā)生的阻塞。以下內容闡述用于研究本發(fā)明化合物治療哮喘的活體內效應哮喘病動物模型。
大鼠哮喘病模型此模型采用Chapman等人在Am J.Resp.Crit Care Med(1534，A219(1996))中及Chapman等人在Am.J.Resp.Crit Care Med(1554，A881(1997))中(兩者的全部內容均以引用的方式并入本文中)闡述的方案。將卵清蛋白(OA，10mg/mL)與氫氧化鋁(10mg/mL)混合，并在第0天注射(i.p.)給Brown Norway大鼠。在第7天及第14天再次注射OA及佐劑。在第21天，將已致敏的動物箝制于塑料試管內并使其在一僅鼻孔可暴露的裝置中暴露(60分鐘)于OA氣霧劑(10mg/kg)下。72小時后用戊巴比妥(pentobarbtial)(250mg/kg，i.p.)將動物處死。通過一氣管插管用3等份(4mL)翰克司溶液(HBSS×10，100mL；EDTA 100mM，100mL；HEPES 1M，25mL；用水補足至1L)灌洗大鼠的肺；收集所獲得的細胞并通過添加翰克司溶液將所得液體的總體積調節(jié)至12mL。對全部細胞進行計數(shù)(Sysmex微細胞計數(shù)器F-500，TOA Medical Electronics Otd.，Japan)，通過稀釋所得液體(至約106細胞/mL)并將1等份(100μL)用移液器轉移至一離心機(Cytospin，Shandon，U.K.)內來制作涂片。將涂片風干，用一溶于甲醇中的固綠溶液(2mg/mL)固定5秒鐘，并用伊紅G染色5秒鐘，用噻嗪染色5秒鐘(Diff-Quick，Browne有限公司U.K.)，以區(qū)分嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞。使用油浸(x100)光學顯微鏡檢查法每涂片共計數(shù)500個細胞。將本發(fā)明化合物用一0.5％羧甲基纖維素及2％土溫80(Tween 80)懸浮液調配并經(jīng)口投予已經(jīng)對過敏原即卵清蛋白過敏的大鼠。在該模型中，認為可在被有效致敏的Brown Norway大鼠呼吸道中抑制由過敏原誘導的白血球積聚的化合物具有活性。
小鼠哮喘病模型亦在一急性肺部炎癥的小鼠模型中對這些化合物進行評價，該評價按照Kung等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.13360-365，(1995)中及Schneider等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.20448-457，(1999)中(兩者的全部內容均以引用的方式并入本文中)所述的程序進行。在第1天通過注射(i.p.)0.2mL含20μg卵清蛋白(4級，Sigma)及2mg注射明礬(Pierce)的卵清蛋白/明礬混合物將6只雌性黑色小鼠(8至12周齡)致敏。在第14天時給予一強化注射。在第28天及第29天用霧化的1％卵清蛋白(溶于0.9％的鹽水中)對小鼠進行20分鐘的免疫激發(fā)。在第30天，即首次激發(fā)后48小時，將小鼠無痛致死并收集支氣管肺泡灌洗試樣(3mL)。用FACs/FITC染色法定量嗜酸性粒細胞。將本發(fā)明化合物用一0.5％羧甲基纖維素及2％土溫80懸浮液調配并經(jīng)口投予已經(jīng)對過敏原即卵清蛋白過敏的小鼠。在該模型中，認為可在被有效致敏的C57BL/6小鼠呼吸道中抑制由過敏原誘導的白血球積聚的化合物具有活性。
綿羊哮喘病模型該模型采用Abraham等人在J.Clin，Invest，93776-787(1994)中及Abraham等人在Am J.Respir Crit Care Med 156696-703(1997)中闡述的程序，兩者的全部內容均以引用的方式并入本文中。通過靜脈注射(鹽水溶液)、經(jīng)口(2％吐溫80，0.5％羧甲基纖維素)及氣霧劑形式投與至對豬蛔蟲(Ascarissuum)抗原過敏的綿羊來對本發(fā)明化合物進行評價。在該模型中，如化合物可減少早期抗原誘導的支氣管反應及/或阻斷晚期呼吸道反應，例如，具有一抗抗原誘導的晚期反應及呼吸道過度反應(“AHR”)的保護性效應，則認為其具有活性。
使用對吸入的豬蛔蟲抗原顯現(xiàn)出早期和晚期支氣管反應兩者的過敏性綿羊來研究候選化合物的呼吸道效應。用2％的利多卡因(lidocaine)對鼻孔進行局部麻醉后，將一氣球導管從一鼻孔插入至下食道中。然后以一撓性纖維光學支氣管鏡引導，經(jīng)由另一鼻孔用一有囊氣管內管來培養(yǎng)這些動物。
按Abraham(1994)所述來估測胸膜壓力。用一次性醫(yī)藥霧化器產(chǎn)生氣霧劑(見下面的調配物)，該霧化器可提供一質量中位氣動粒徑為3.2微米(用Andersen級聯(lián)沖擊器測得)的氣霧劑。將此霧化器連接至一劑量計系統(tǒng)上，該系統(tǒng)由一電磁閥與一壓縮空氣源(20psi)組成。霧化器的出口導入一塑性T形部件，該部件的一端連接至一活塞呼吸機的吸氣孔。在霧化器的吸氣循環(huán)開始時將電磁閥啟動1秒鐘。以500mL的VT遞送氣體，速率為每分鐘呼吸20次。僅用0.5％的碳酸氫鈉溶液作為對照。
根據(jù)Abraham(1994)所述產(chǎn)生對卡巴膽堿的累積濃度反應曲線，來評價支氣管反應性。在處理開始之前及抗原激發(fā)后24小時均進行支氣管活組織檢查，該檢查按照Abraham(1994)所述實施。
亦按Abraham(1994)所述實施肺泡巨噬細胞的一活體外粘附研究，并計算粘附細胞的百分比。
氣霧劑調配物用以下程序制備一候選化合物以30.0mg/mL的濃度溶于0.5％碳酸氫鈉/鹽水(w/v)中的溶液A.制備0.5％碳酸氫鈉/鹽水儲備溶液100.0mL

步驟1.向一容積為100mL的燒瓶內添加0.5g碳酸氫鈉。
2.添加約90.0mL鹽水并經(jīng)聲波處理直至溶解。
3.用鹽水補足至100.0mL并充分混合。
B.制備30.0mg/mL的候選化合物10.0mL

步驟1.向一容積為10.0mL的燒瓶內添加0.300g待測化合物。
2.再添加約9.7mL 0.5％的碳酸氫鈉/鹽水儲備溶液。
3.進行聲波處理直至候選化合物完全溶解。
4.用0.5％的碳酸氫鈉/鹽水儲備溶液補足至10.0mL并充分混合。
實例E對C57B6小鼠進行為期10天的毒性研究進行一為期10天的研究來評價本發(fā)明化合物對雌性C57B6小鼠的毒性。以5種劑量水平(0(媒劑對照)、10、30、100、300及1000mg/kg(mpk))通過管飼法投與該化合物，每一劑量水平投予5只小鼠。所有水平的劑量均為10mL/kg。劑量溶液在2％吐溫80溶于0.5％羧甲基纖維素(CMC)中的溶液中制備，并且每2至3天制備新的劑量溶液或懸浮液。處死前的觀察包括體重(第1、2、3、5、7、8及11天實施)，每日籠邊臨床觀察(1-2次/天)及周期性(第-1、2及9天實施)系列機能觀察。
在結束時，通過心臟穿刺采集血液試樣供臨床病理學(血液學及臨床化學)及藥物水平研究艇。分析這些EDTA血樣的總白血球數(shù)目、紅細胞數(shù)目、血紅蛋白、血細胞比容、紅細胞指數(shù)(MCV、MCH、MCHC)、血小板及WBC五部分的差異(嗜中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)。分析經(jīng)肝素化的血漿試樣的丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、白蛋白、蛋白質、鈣、葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、膽固醇及甘油三酯。
采集完血液后，對小鼠尸體進行剖檢并稱重器官(肝、脾、腎、心臟及胸腺)。采集腦、涎腺、胸腺、心臟、肺、肝、腎、腎上腺、脾、胃、十二指腸、回腸、結腸及子宮/卵巢這些組織的試樣并用福爾馬林穩(wěn)定。處理從媒劑對照、300及400mpk組的動物得到的組織并置于經(jīng)H&E染色的玻璃載玻片上，對組織病理學損傷進行評價。
使用Prism軟件通過Dunnet′s多重比較測試對體重變化、絕對及相對器官體重及臨床病理學結果進行分析，找出與載劑對照組相比的統(tǒng)計學顯著差異。用Dunnet′s、Fisher′s精確檢驗法對這些機能觀察系列結果進行差別分析并通過Cochran-Mantel-Haenszel相關性檢驗用SAS軟件進行劑量變化趨勢效應分析。
使用一常規(guī)的口服調配物，本發(fā)明化合物在此模型中將具有活性。
實例F大鼠中由佐劑引發(fā)的關節(jié)炎佐劑引發(fā)的關節(jié)炎(“AIA”)是一用于類風濕性關節(jié)炎(RA)研究的動物模型，其通過在Lewis大鼠的尾根部注射結核桿菌引發(fā)。
在注射后的第10天及第15天之間，動物會患上嚴重的漸進性關節(jié)炎。
通常，對化合物改變大鼠由佐劑引發(fā)的浮腫造成的后爪腫脹及骨損傷的能力進行測試。為了定量對AIA所導致的后爪腫脹的抑制程度，已定義兩種炎癥期(1)原發(fā)性及繼發(fā)性注射后爪炎癥期，及(2)繼發(fā)性未注射后爪炎癥期，其通常在注射爪中引發(fā)炎癥后約11天開始顯現(xiàn)。如果后一類型炎癥減輕，則表明測試化合物具有免疫抑制活性。Cf.Chang，Arth.Rheum.，20，1135-1141(1977)。
使用一RA動物模型(例如AIA)可研究與該疾病初期階段有關的細胞事件。在佐劑關節(jié)炎的早期，CD44在巨噬細胞及淋巴細胞上的表達上調，然而在該疾病的后期，LFA-1的表達上調。了解在佐劑關節(jié)炎的最早期粘附分子與內皮組織之間的相互作用可在RA治療方法方面獲得顯著進展。
權利要求
1.一種式(I)化合物 其中每一X均獨立為氟、氯或溴；p為一0到3的整數(shù)；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、吡咯基、2，5-二氫吡咯-1-基、哌啶基或1，2，3，6-四氫-吡啶-1-基；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
2.一種式(II)化合物 其中每一X均獨立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2選自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亞烷基環(huán)烷基組成的群組；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
3.一種式(III)化合物 其中每一X均獨立為氟或氯；n為0或1；R2為-CH2-R1，其中R1選自由氫、甲基或-CH＝CH2組成的群組；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
4.如權利要求1的化合物，其中R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團。
5.如權利要求1、2或3的化合物，其中R2為CH3。
6.如權利要求3的化合物，其中X為F或Cl且n為0。
7.如權利要求1的化合物，其選自由下列組成的組群N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸ELN；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(哌啶-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺酰基)-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-甲氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-乙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
8.一種醫(yī)藥組合物，其包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權利要求1至4、6或7的化合物。
9.一種治療一患者由α4整合素所調介的疾病的方法，該方法包括投予一醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權利要求1至4、6或7的化合物。
10.如權利要求9的方法，其中該疾病由VLA-4調介。
11.如權利要求9的方法，其中該疾病為一炎癥性疾病。
12.一種式(IV)化合物 其中每一X均獨立為氟、氯或溴；p為一0到3的整數(shù)；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、吡咯基、2，5-二氫吡咯-1-基、哌啶基或1，2，3，6-四氫吡啶-1-基；R2為低碳炔基；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
13.一種式(V)化合物 其中每一X均獨立選自由氟和氯組成的群組；m為一等于1或2的整數(shù)；R2為低碳炔基；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
14.一種式(VI)化合物 其中每一X均獨立為氟或氯；n為0或1；R2為低碳炔基；R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
15.如權利要求12的化合物，其中R1及R3和它們與之鍵結的氮原子一同形成一氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基或哌啶基基團。
16.如權利要求12、13或14的化合物，其中R2為炔丙基。
17.如權利要求15的化合物，其中X為F或Cl且n為0。
18.如權利要求12的化合物，其選自由下列組成的組群N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(2，4-二氟苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氟苯磺酰基)-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(氮雜環(huán)丁烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；N-(2-[N′，N′-二乙氨基]-5-[N″-(4-氯苯磺?；?-N″-炔丙氨基]嘧啶-4-基)-4′-(吡咯烷-1-基羰氧基)-L-苯丙氨酸；及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
19.一種醫(yī)藥組合物，其包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權利要求12至15、17或18的化合物。
20.一種治療一患者由α4整合素所調介的疾病的方法，該方法包括投予一醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含一醫(yī)藥上可接受的載劑及一治療有效量的如權利要求12至15、17或18的化合物。
21.如權利要求20的方法，其中該疾病由VLA-4調介。
22.如權利要求20的方法，其中該疾病為一炎癥性疾病。
23.如權利要求20的方法，其中該疾病為類風濕性關節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明揭示與α
文檔編號A61P19/02GK1656090SQ03811548
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月27日 優(yōu)先權日2002年5月24日
發(fā)明者安德烈·W·康拉迪, 克里斯托夫·M·塞姆科, 許英姿, 弗蘭克·斯塔潘貝克, 布賴恩·P·斯圖皮, 珍妮弗·史密斯, 尤金·D·托爾塞特, 邁克爾·A·普萊斯 申請人:伊蘭制藥公司