專利名稱：靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的靈芝菌絲體水溶性雜多糖及其制備方法和用途。它屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域，也屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤已成為人類死亡率最高的疾病，世界各國都在花費(fèi)巨資對腫瘤的治療進(jìn)行研究。針對癌癥患者免疫力低的現(xiàn)象，人們積極尋找一種既具有抗腫瘤效果又能提高機(jī)體免疫功能的藥物。80年代以來的研究表明，多糖對多種危害人類健康的疾病，如免疫紊亂、癌癥、糖尿病、高血壓、肝炎、肺炎等都具有顯著的療效。多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞素，從而提高人體的免疫機(jī)能，而且對正常細(xì)胞沒有毒副作用(Intern.J.Orient.Med.，17，57，1992)。Sone等人(Agric.Biol.Chem.，49，2461，1985)和Mizuno等人(Nipon Nogeikagaku Kaishi，42，2641，1985)分別報道了從靈芝子實體和菌絲體中提取的多糖具有明顯的抗腫瘤活性。近年有關(guān)靈芝藥物和保健品的報道很多，但靈芝菌絲體多糖的一、二級結(jié)構(gòu)并不完全清楚，此外由于野生靈芝子實體資源有限，而人工栽培生長周期長，同時靈芝孢子的破壁技術(shù)有待突破，使得靈芝子實體和靈芝孢子活性多糖的推廣應(yīng)用受到限制。而采用生物工程技術(shù)培養(yǎng)靈芝菌絲體，并從中分離出多糖可克服這些缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖及其制備方法和用途，所得水溶性雜多糖具有明顯抗腫瘤活性，而且其制備方法簡單易行、生產(chǎn)周期短、成本較低廉。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖，由下法制得采用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所提供的靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；然后室溫浸泡在磷酸鹽緩沖液中，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得水溶性雜多糖-蛋白質(zhì)(GM1)純品。上述離心后所得菌絲體殘渣用20～50℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得水溶性雜多糖-蛋白質(zhì)(GM2)純品。上述離心后所得菌絲體殘渣用50～100℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得水溶性葡聚糖(GM3)純品。
上述兩種水溶性雜多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和不同含量的蛋白質(zhì)組成，結(jié)合蛋白含量分別為13.5％和20.1％，其重均分子量分別為62.8×104和81.8×104，而水溶性葡聚糖的重均分子量604.7×104。
上述培養(yǎng)基的基本組成為D-葡萄糖(10～20％)，蛋白胨(0.6～1.2％)，酵母膏(0.5～1.5％)，KH2PO4(0.03～0.07％)，K2HPO4(0.03～0.07％)，MgSO4(0.03～0.07％)；以上百分比均為重量百分比。
上述培養(yǎng)條件為25～30℃搖床培養(yǎng)10～15天，搖床轉(zhuǎn)速為150～220rpm。所得菌絲體為淺黃色，且有一種淡香味。過濾出菌絲體并冷凍干燥的靈芝菌絲體粉末。產(chǎn)率為每升培養(yǎng)液5～8克干菌絲體。
上述靈芝菌絲體索氏提取去除脂肪時間在4～8小時，其在磷酸鹽緩沖液中的室溫下的提取時間在8～12小時，20～50℃下的提取時間為2～4小時，50～100℃下的提取時間為0.5～1.5小時；透析時間在5～10天。
上述水溶性多糖可用作抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品。
上述水溶性多糖用紅外、核磁共振、氣相色譜、蛋白質(zhì)分析儀、粘度計及光散射儀確定了其化學(xué)組成和二級結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的靈芝菌絲體水溶性雜多糖為結(jié)構(gòu)清楚的新的物質(zhì)，它們具有明顯抗腫瘤活性。由于弄清了其化學(xué)組成和二級結(jié)構(gòu)，加之無任何毒副作用，這種水溶性靈芝菌絲體雜多糖可成為理想的和有開發(fā)前景的抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品。利用生物工程發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)靈芝菌絲體，并從中分離出具有抗腫瘤活性的多糖。因此具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的水溶性雜多糖制備方法簡單易行、成本低廉、生產(chǎn)周期短、易于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體的實例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明
將靈芝菌絲體粉末(100克)依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取各8小時。然后室溫用0.2M磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)水溶液提取三次，每次12小時，離心，合并收集上清液(GM1)。所得殘渣用0.2M磷酸鹽緩沖液于20～50℃提取三次，每次4小時，離心，合并收集上清液(GM2)。所得殘渣用0.2M磷酸鹽緩沖液于50～100℃提取三次，每次1小時，離心，合并收集上清液(GM3)。提取液濃縮后，均用30％ H2O2脫色至淺黃色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，反復(fù)進(jìn)行9次以上直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后分別用清水和二次蒸餾水透析5天和3天，濃縮，最后冷凍干燥得白色粉狀多糖純品GM1、GM2和GM3分別為1.3克、0.5克和0.7克。
這些多糖的單糖組成、結(jié)合蛋白質(zhì)含量、分子量及產(chǎn)率列于附表1。經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院對植入Sarcoma 180腫瘤的小鼠進(jìn)行體內(nèi)腹腔注射實驗的生物活性結(jié)果列于附表2。顯然，靈芝菌絲體水溶性多糖均具有明顯的抗腫瘤效果。同時給藥期間小鼠體重均有增加，由此表明該多糖樣品無毒副作用，特別是分子量不超過1×106的兩種水溶性靈芝菌絲體雜多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有更高的抗腫瘤活性。該多糖可用于制備抗腫瘤藥物和提高機(jī)體免疫功能的保健品，具有極大的推廣和應(yīng)用前景。
附表1.靈芝菌絲體水溶性雜多糖單糖組成、蛋白質(zhì)含量、產(chǎn)率和分子量樣品產(chǎn) 蛋白 Mw×10-4單糖組成(％)率 質(zhì)(g鼠巖木甘露 半乳 葡萄 葡萄糖(％) (％) mol-1) 李糖 藻糖 糖糖糖糖氨GM1 1.313.54 62.8 - 6.7 0.4 26.1 48.3 10.1 8.5GM2 0.520.11 81.8 - 6.2 nd4.8 34.3 46.8 7.9GM3 0.7- 604.7 - 0.6 0.5 1.9 5.2 86.5 5.2-未檢測到；附表2.靈芝菌絲體水溶性雜多糖小鼠體內(nèi)抗S180腫瘤活性樣品 劑量 抑制率體重增加率(％)(mg/kg×da (％)ys)GM116×10 54.06 27.532×10 57.30 21.8GM216×10 73.03 4.732×10 68.54 4.9GM35×1043.07 33.316×10 55.06 23.332×10 51.46 11.權(quán)利要求
1.一種靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖，由下法制得采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；然后室溫浸泡在磷酸鹽緩沖液中，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
2.一種靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖，由下法制得采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含玉米漿的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；經(jīng)磷酸鹽緩沖液室溫提取后所得的菌絲體殘渣用20～50℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
3.一種靈芝菌絲體抗腫瘤水溶性雜多糖，由下法制得采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含玉米漿的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；經(jīng)磷酸鹽緩沖液室溫和20～50℃依次提取后的菌絲體殘渣用50～100℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
4.權(quán)利要求1所述水溶性雜多糖的制備方法，其特征在于采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；然后室溫浸泡在磷酸鹽緩沖液中，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)的H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的基本組成為10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比為重量百分比。
6.權(quán)利要求2所述水溶性雜多糖的制備方法，其特征在于采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；經(jīng)磷酸鹽緩沖液室溫提取后的菌絲體殘渣用20～50℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)的H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基的基本組成為10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比為重量百分比。
8.權(quán)利要求3所述水溶性雜多糖的制備方法，其特征在于采用靈芝菌種(Ganoderma tsugae)在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體，將靈芝菌絲體依次用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取去除脂肪；經(jīng)磷酸鹽緩沖液室溫和20～50℃提取離心后所得菌絲體殘渣用50～100℃的磷酸鹽緩沖液浸泡提取，離心，收集提取液；提取液濃縮后，用20％～30％(重量百分比)的H2O2脫色，用Sevag法除去游離的蛋白質(zhì)直至紫外檢測無280nm的蛋白質(zhì)吸收峰，然后透析、冷凍干燥得多糖純品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，所述培養(yǎng)基的基本組成為10～20％的D-葡萄糖、0.6～1.2％的蛋白胨、0.5～1.5％的酵母膏、0.03～0.07％的的KH2PO4、0.03～0.07％的K2HPO4、0.03～0.07％的MgSO4，以上百分比為重量百分比。
10.權(quán)利要求1、2或3所述的水溶性雜多糖用作抗腫瘤藥物或提高機(jī)體免疫功能的保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有抗腫瘤活性的靈芝菌絲體水溶性多糖的制備方法。用葡萄糖為主要成分配制成培養(yǎng)基，由靈芝菌種深層發(fā)酵培養(yǎng)出靈芝菌絲體。分別用磷酸鹽緩沖液在不同溫度下從菌絲體中提取出兩種水溶性雜多糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物和一種葡聚糖。其中兩種雜多糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物主要由D－葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，結(jié)合蛋白含量分別為13.5％和20.1％，其重均分子量分別為62.8×10
文檔編號A61K31/715GK1478902SQ03128290
公開日2004年3月3日 申請日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者張俐娜, 彭燕飛 申請人:武漢大學(xué)