專利名稱：治療結(jié)腸癌等消化道腫瘤的抗iv型膠原酶單抗3d6與力達(dá)霉素的免疫偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由單克隆抗體和抗腫瘤藥物組成的免疫偶聯(lián)物及其制備方法和在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。
據(jù)報(bào)道，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和新血管生成之間存在著密切的關(guān)系，惡性腫瘤或其間質(zhì)細(xì)胞通過分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶來降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)組分，從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。因此，MMPs成為引人注目的腫瘤治療的分子靶點(diǎn)(Drugs Aging 1997，11229)。IV型膠原酶，又稱為明膠酶，包括MMP-2和MMP-9兩個(gè)組分，是MMPs家族中的重要成員，它可以降解基底膜中作為其它組分構(gòu)建支架的IV型膠原，從而有利于腫瘤細(xì)胞破壞和穿透基底膜進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移(Mol Med Today 2000，6149)。大量研究表明，抑制IV型膠原酶或其它MMPs的分泌及其活性的小分子藥物在體內(nèi)具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用(J Natl Cancer Inst 2001，93178)。由于IV型膠原酶在惡性腫瘤組織的表達(dá)和活化顯著增加，本實(shí)驗(yàn)室以往以抗IV型膠原酶單抗3D6的Fab’片段攜帶抗腫瘤藥物進(jìn)行的單抗導(dǎo)向治療取得了良好的效果，并申請(qǐng)了專利(專利公開號(hào)CN1268377A)。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)人的結(jié)腸癌和其它消化道腫瘤組織進(jìn)行研究的過程中發(fā)現(xiàn)，用抗IV型膠原酶單抗3D6進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，人的結(jié)腸癌、食管癌及胃癌等消化道腫瘤組織染色結(jié)果呈陽性。其中，在對(duì)5例人結(jié)腸癌組織及其鄰近正常組織進(jìn)行染色時(shí)發(fā)現(xiàn)，正常組織與單抗3D6的免疫組織化學(xué)染色為陰性，而結(jié)腸癌組織則呈現(xiàn)不同程度的陽性染色，表明IV型膠原酶在腫瘤組織中特異性表達(dá)。而用單抗3D6及其Fab’片段與抗腫瘤藥物組成的免疫偶聯(lián)物治療結(jié)腸癌等消化道腫瘤的研究尚未見報(bào)道。以本研究所自行研制的抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素(LDM)(中國抗生素雜志1994，19(2)164)作為彈頭藥物，本發(fā)明制備了單抗3D6-LDM偶聯(lián)物，并觀察了其對(duì)小鼠移植性結(jié)腸癌C26的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，與同等劑量的游離力達(dá)霉素相比，3D6-LDM偶聯(lián)物的抗腫瘤作用顯著增強(qiáng)。因此，3D6-LDM偶聯(lián)物有可能成為治療結(jié)腸癌等消化道腫瘤的新型抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的目的是以合適的方法制備單抗3D6-LDM的偶聯(lián)物，并將此偶聯(lián)物用于結(jié)腸癌等消化道腫瘤的治療。
2.以2-IT和MBS作為交聯(lián)分子的單抗3D6-LDM偶聯(lián)物的制備利用抗IV型膠原酶單抗3D6作為攜帶抗腫瘤藥物的導(dǎo)向載體(1)經(jīng)羥基磷灰石柱純化后的單抗3D6置截留分子量為10kDa的透析袋中用pH8.0的0.05M硼酸緩沖液進(jìn)行透析，調(diào)節(jié)其濃度為5mg/ml。取溶于pH為8.0的0.05M的硼酸緩沖液中，濃度為4 mg/ml的2-IT溶液10μl加入上述5mg/ml的3D6溶液中，在充氮?dú)獾臈l件下于室溫反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后，置截留分子量為30kDa的離心濃縮管中，以0.05M，pH為6.8的磷酸鹽緩沖液(PB)進(jìn)行緩沖液交換，并離心除去未反應(yīng)的2-IT。(2)取力達(dá)霉素溶解于0.05M pH6.8的PB中配成5mg/ml的濃度，攪拌下加入溶于DMF的濃度為10mg/ml的MBS，室溫反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后，置截留分子量為10kDa的透析袋中，以0.05M，pH6.8的PB充分透析16h。透析完畢后立即與經(jīng)2-IT修飾的單抗3D6進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，室溫反應(yīng)6h或過夜。反應(yīng)液置截留分子量為30kDa的超濾離心濃縮管中，離心超濾3-4次，去除未反應(yīng)的MBS修飾的力達(dá)霉素，得到3D6-LDM的偶聯(lián)物。
3.以SPDP或長鏈的N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)作為交聯(lián)分子的3D6-LDM偶聯(lián)物的制備(1)取LDM 2mg溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配成4mg/ml的濃度，然后加入摩爾數(shù)為10倍過量的SPDP或LC-SPDP(15mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中)，室溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后置濃度為0.1mol/L的醋酸緩沖液(pH4.5)中充分透析。取透析內(nèi)液加入二巰基蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mmol/L，室溫反應(yīng)30min，然后置磷酸鹽緩沖液中充分透析。(2)另取單抗3D6 2mg溶于pH為6.8，濃度為0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中，加入摩爾數(shù)為10倍過量的SPDP或LC-SPDP，室溫反應(yīng)30min，于PBS液中充分透析。(3)合并(1)和(2)中的透析內(nèi)液，室溫反應(yīng)過夜。然后經(jīng)Sephadex G-75柱分離，收集第一峰，得到3D6-LDM的偶聯(lián)物。
本發(fā)明所說的單抗3D6-LDM偶聯(lián)物與IV型膠原酶和腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)證明，該偶聯(lián)物保留了與IV型膠原酶和上述各種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。本發(fā)明所說的單抗3D6在不同人腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌等消化道腫瘤組織對(duì)單抗3D6呈現(xiàn)陽性染色、而在結(jié)腸癌周圍的正常組織中染色為陰性，說明IV型膠原酶在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)具有特異性。本發(fā)明所說的3D6-LDM偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用實(shí)驗(yàn)顯示，3D6-LDM偶聯(lián)物比單獨(dú)使用LDM對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性強(qiáng)，且與偶聯(lián)物的濃度成依賴關(guān)系。而本發(fā)明所說的3D6-LDM偶聯(lián)物靜脈注射給藥時(shí)，對(duì)小鼠結(jié)腸癌的治療效果明顯高于單獨(dú)使用LDM。
以下所舉3D6-LDM偶聯(lián)物的抗腫瘤活性的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言只是說明性的，而非限制性的。實(shí)施例1單抗3D6和3D6-LDM偶聯(lián)物與IV型膠原酶和腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性以ELISA方法進(jìn)行。單抗3D6與人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌C26細(xì)胞、人口腔鱗癌KB細(xì)胞、小鼠肝癌H22細(xì)胞呈現(xiàn)良好的免疫結(jié)合活性(圖2)。偶聯(lián)后測定單抗3D6-LDM偶聯(lián)物與IV型膠原酶以及人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、小鼠結(jié)腸癌C26細(xì)胞、人口腔鱗癌KB細(xì)胞、小鼠肝癌H22細(xì)胞的免疫結(jié)合能力，結(jié)果顯示3D6-LDM偶聯(lián)物保留了單抗3D6與IV型膠原酶(圖3)以及上述各種腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力(圖4)。實(shí)施例2單抗3D6在不同人腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色單抗3D6在對(duì)多例人結(jié)直腸癌、盲腸癌、食管癌、胃癌等消化道腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，呈現(xiàn)較高的陽性反應(yīng)率(表1)。實(shí)驗(yàn)中的組織切片均設(shè)有空白對(duì)照(以PBS替代單抗3D6)、陰性對(duì)照(以無關(guān)的抗力達(dá)霉素單抗F9替代單抗3D6)，染色結(jié)果均為陰性，證明單抗3D6的免疫組織化學(xué)染色為針對(duì)組織中IV型膠原酶的特異性染色結(jié)果。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，單抗3D6在人體結(jié)直腸癌、盲腸癌、食管癌、胃癌等消化道腫瘤組織中均有不同程度的陽性染色。在消化道腫瘤組織樣本中，單抗3D6的染色多位于腺細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞頂端和基底以及侵襲入基質(zhì)或血管的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，并呈強(qiáng)陽性染色，陽性率達(dá)80％(32/40)，顯示IV型膠原酶在腫瘤細(xì)胞破壞和穿透基底膜的過程中起作用。
表1 單抗3D6在不同人腫瘤組織中的免疫組織化學(xué)染色腫瘤樣本 陰性染色例數(shù) 陽性染色例數(shù)染色陽性率(％)結(jié)腸癌 1 21 95.2盲腸癌 1 3 75.0食管癌 2 3 60.0胃癌 4 5 55.6另外，觀察5例結(jié)腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學(xué)染色，正常組織中染色為陰性，而結(jié)腸癌組織顯示不同程度的陽性染色(表2)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)棕色深染顆粒位于腺上皮細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的頂端，個(gè)別病例見于周圍間質(zhì)內(nèi)(圖5，圖6)。結(jié)果顯示了IV型膠原酶在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的特異性。
表2 半定量分析單抗3D6在結(jié)腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)腸癌病例序號(hào) 結(jié)腸癌組織染色情況 鄰近正常組織染色情況1 ++++ -2 +++ -3 + -4 ++++ -
5 ++ -實(shí)施例33D6-LDM偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用用四氮唑藍(lán)(MTT)法測定3D6-LDM偶聯(lián)物及游離力達(dá)霉素對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌C26細(xì)胞和肝癌H22細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果游離力達(dá)霉素對(duì)兩種細(xì)胞的IC50分別為4.8×10-11mol/L和6.2×10-11mol/L，3D6-LDM偶聯(lián)物表現(xiàn)出比游離力達(dá)霉素更強(qiáng)的體外細(xì)胞毒性，對(duì)兩種細(xì)胞的IC50分別為4.3×10-12mol/L和5.1×10-12mol/L。力達(dá)霉素及3D6-LDM偶聯(lián)物濃度依賴性地抑制H22細(xì)胞的增殖(圖7，表4)。
表3 MTT法測定力達(dá)霉素和3D6-LDM在體外對(duì)肝癌H22細(xì)胞的殺傷作用A560(％對(duì)照)藥物濃度(mol/L×10-12)LDM3D6-LDM100027.73 18.63100 53.44 26.2910 74.80 60.041 78.40 64.180.1 80.41 78.670.0182.41 83.02實(shí)施例43D6-LDM偶聯(lián)物靜脈注射對(duì)小鼠結(jié)腸癌C26的療效 取體內(nèi)傳代的小鼠結(jié)腸癌C26瘤塊，勻漿后以生理鹽水按1∶3的比例稀釋，然后按0.2ml/只接種于BALB/c小鼠腋窩皮下，接種72小時(shí)后靜脈注射給藥，對(duì)照組給予生理鹽水，共給藥一次，實(shí)驗(yàn)第10天測量各組動(dòng)物的腫瘤體積，并以瘤體積計(jì)算抑瘤率。結(jié)果表明，3D6-LDM偶聯(lián)物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.10mg/kg劑量的抑瘤率分別為54.5％，70.3％和81.2％，而0.05mg/kg力達(dá)霉素的抑瘤率為56.4％，顯著低于等劑量的偶聯(lián)物(表4)。
表4 3D6-LDM靜脈注射給藥對(duì)小鼠移植結(jié)腸癌C26的生長抑制作用動(dòng)物數(shù) 體重(g) 瘤重(mg)藥物劑量(mg/kg) 抑瘤率(％)開始/結(jié)束開始/結(jié)束Xaver±SD對(duì)照 10/1018.4/18.21.01±0.193D6 0.75 10/1018.0/17.90.75±0.2025.7LDM0.0510/10 18.1/18.3 0.44±0.1656.4*3D6+LDM0.75+0.05 10/10 18.5/18.1 0.62±0.1338.6*3D6-LDM0.025 10/10 18.2/17.9 0.46±0.0954.5*3D6-LDM0.0510/10 18.1/16.4 0.30±0.0670.3**3D6-LDM0.1010/10 18.6/16.3 0.20±0.0681.2**皮下接種腫瘤，第3天靜脈注射給藥一次；*P＜0.01與對(duì)照組比較，**P＜0.01與力達(dá)霉素組比較發(fā)明效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是在于確定了抗IV型膠原酶單抗3D6與力達(dá)霉素偶聯(lián)物的制備方法，觀察到單抗3D6與結(jié)腸癌等消化道腫瘤之間的免疫組織化學(xué)反應(yīng)，為單抗3D6-LDM偶聯(lián)物用于結(jié)腸癌等消化道腫瘤的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。力達(dá)霉素是一種迄今為止報(bào)道的具有最強(qiáng)細(xì)胞毒作用并有明顯體內(nèi)抗腫瘤作用的抗腫瘤抗生素，目前正作為一類新藥處于研究開發(fā)階段。單抗3D6-LDM偶聯(lián)物在對(duì)小鼠移植性肝癌的治療中顯示出良好的療效，而關(guān)于其對(duì)結(jié)腸癌等消化道腫瘤的治療尚無報(bào)道。免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)證明，單抗3D6在結(jié)腸癌等消化道腫瘤組織中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而在周圍正常組織中染色為陰性。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)也表明，3D6-LDM偶聯(lián)物與小鼠結(jié)腸癌C26以及人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞之間存在較強(qiáng)的免疫結(jié)合活性。用3D6-LDM偶聯(lián)物治療小鼠移植性結(jié)腸癌C26表現(xiàn)出比游離力達(dá)霉素更強(qiáng)的抗腫瘤作用。因此，預(yù)期單抗3D6與力達(dá)霉素的偶聯(lián)物將有可能開發(fā)成為新型的抗腫瘤導(dǎo)向藥物用于臨床腫瘤治療，并取得良好的效果。
權(quán)利要求
1.抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達(dá)霉素(LDM)的免疫偶聯(lián)物，其特征是單抗3D6-LDM偶聯(lián)物是由單抗3D6蛋白分子上的氨基和LDM輔基蛋白分子上的氨基之間通過小分子的交聯(lián)劑作為接頭形成的單抗3D6和LDM分子比為1∶1的免疫偶聯(lián)物，偶聯(lián)物的分子量為160kDa左右，其中用于連接單抗3D6和LDM的小分子接頭可以是2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)和N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)，也可以是N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等其它小分子異型雙功能交聯(lián)劑。
2.一種抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達(dá)霉素(LDM)的免疫偶聯(lián)物的制備方法，其特征是所說偶聯(lián)物的制備是將力達(dá)霉素先以異型雙功能交聯(lián)劑如N-羥基琥珀酰亞胺基-間-(N-馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾，然后加入經(jīng)2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)巰基化的單抗3D6，反應(yīng)后經(jīng)純化得到產(chǎn)物；或者是將力達(dá)霉素以其它異型雙功能交聯(lián)劑如N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或長鏈的N-羥基琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)等異型雙功能交聯(lián)劑作為中介體與單抗3D6進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)純化得到產(chǎn)物。
3.抗IV型膠原酶單克隆抗體3D6與力達(dá)霉素(LDM)偶聯(lián)物在治療結(jié)腸癌等消化道腫瘤中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的抗IV型膠原酶單抗3D6,以2－亞胺基四氫噻吩(2－IT)和N－羥基琥珀酰亞胺基－間－(N－馬來酰亞胺基)苯甲酸酯(MBS)或其它交聯(lián)劑分子作為中介體,與力達(dá)霉素(LDM)偶聯(lián),獲得了單抗3D6－LDM的偶聯(lián)物,以單抗3D6對(duì)人的結(jié)腸癌、食管癌和胃癌等消化道腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,顯示IV型膠原酶在上述消化道腫瘤中的表達(dá)和活化增加,間接ELISA方法測定單抗3D6與鼠結(jié)腸癌26(C26)、人結(jié)腸癌HT－29、鱗癌KB、肝癌22(H22)的免疫結(jié)合活性,結(jié)果顯示,HT－29、C26細(xì)胞對(duì)單抗3D6具有較強(qiáng)的免疫結(jié)合能力,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用于治療小鼠結(jié)腸癌,3D6－LDM偶聯(lián)物顯示出比同等劑量的游離LDM更強(qiáng)的腫瘤生長抑制作用,因此,3D6－LDM偶聯(lián)物可能用于結(jié)腸癌及其它消化道腫瘤的治療。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1389472SQ0212531
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者甄永蘇, 王風(fēng)強(qiáng), 李亮, 劉秀均, 尚伯楊 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所