專利名稱：雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙鏈核糖核酸(dsRNA)的結(jié)構(gòu)是兩條單鏈核糖核酸(RNA)以所謂互補(bǔ)的方式由氫鍵相連構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。dsRNA被預(yù)期具抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋的生理活性，但我國對(duì)dsRNA的研究幾乎處于停滯狀態(tài)，原因是由于原有的核酸類藥物明顯的毒副作用而限制了它的臨床使用。
公開發(fā)明本發(fā)明的任務(wù)是為以公知方法制備的dsRNA，找到新的醫(yī)療用途。
本發(fā)明所制備的核糖核酸是失配dsRNA，其制備方法是以RNA為基體，經(jīng)退火而成；核酸是核糖等與嘌呤環(huán)或嘧啶環(huán)相連，兩條RNA以所謂互補(bǔ)的方式由氫鍵相連構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明在dsRNA技術(shù)的基礎(chǔ)上，將分子量大小分布由沉降系數(shù)為≤42S的dsRNA修飾至4-28S左右的失配dsRNA，以改變現(xiàn)有抗病毒藥物毒副作用大的缺點(diǎn)，通過對(duì)dsRNA的結(jié)構(gòu)的修飾，保留其原有的抗病毒功能，降低毒副作用，并用于治療包括病毒性心肌炎、肝炎、腦炎、及呼吸道感染等疾病在內(nèi)的克薩奇病毒感染。
高分子的dsRNA在體內(nèi)停留時(shí)間很短，可以很快地被RNA酶水解為短的堿基對(duì)片段，小的堿基對(duì)片段可以在細(xì)胞膜間傳遞，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮免疫作用，也可穿過粘膜，對(duì)體液、腦組織液等也有免疫作用。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式在本說明書中，把作為合成dsRNA的多聚肌苷酸稱之為“Poly I”，而把多聚胞苷酸稱之為“Poly C”。
失配雙鏈核糖核酸的制備工藝(可參照Molecular Pharmacology，12,299-232)a.制備修飾的多聚胞苷酸(Poly C)取36毫摩爾的胞苷二磷酸、7毫摩爾的尿苷二磷酸、15毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷、2毫克/毫升的多核苷酸磷酸化酶，于37℃下反應(yīng)4.5小時(shí)。反應(yīng)后的溶液經(jīng)冷凍干燥，獲得的白色固體即為上述的修飾的Poly C。
b.制備雙鏈核糖核酸產(chǎn)物(dsRNA)使用市售的Poly I和Poly C或修飾的Poly C，溶解于50毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷溶液中，使之為10-12毫克/毫升的濃度，于水浴中將溫度從室溫緩慢地提高到68℃，在68℃下保溫約10分鐘，放置至其溫度降至室溫，再于4℃保存。上述溶液經(jīng)冷凍干燥，獲得白色固體，這種物質(zhì)即為上述的dsRNA。
所述雙鏈核糖核酸是失配的，PolyI·PolyC11-32U或稱rIn·r(C11-32U)n。
所述雙鏈核糖核酸可以核糖核酸RNA為對(duì)照物，分子量大小分布以沉降系數(shù)表示，集中在4S-28S范圍內(nèi)。
所述雙鏈核糖核酸可以核糖核酸RNA為對(duì)照物，分子量大小分布以堿基數(shù)表示，集中在50-10000的范圍內(nèi)。
乙型肝病毒性肝炎簡稱乙型肝炎，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起。乙肝病毒進(jìn)入人體后，由血液進(jìn)入肝臟，主要定位于肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖。
據(jù)權(quán)威統(tǒng)計(jì)，全世界有20億人已經(jīng)受到過HBV的感染，估計(jì)其中的3.5億人已經(jīng)成為HBV的慢性攜帶者，即俗稱的乙肝患者！而本病每年會(huì)造成約100萬人的死亡。我國是HBV感染的極高流行區(qū)。感染過HBV的人數(shù)大約有7億，目前有慢性無癥狀乙肝病毒攜帶者約1.2億，其中約3千萬將死于與乙肝有關(guān)的肝臟疾病(如肝硬化、肝腫瘤等)。僅從乙肝病毒攜帶者的數(shù)字來說，差不多就是全國人民十有其一。
引發(fā)肝癌的機(jī)理目前還不很清楚。有學(xué)者認(rèn)為，乙型肝炎病毒引發(fā)肝癌的途徑，是由于先有HBV釀成肝炎，肝炎又導(dǎo)致肝硬變，使肝細(xì)胞發(fā)生不典型增生，繼而發(fā)展成肝癌；另有一些學(xué)者則認(rèn)為慢性肝炎可以不經(jīng)過肝硬變階段而直接導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。但他們不同的觀點(diǎn)中有一點(diǎn)是一致的，即HBV可能是人類肝癌發(fā)病諸多因素中的主要啟動(dòng)因素。
發(fā)明效果失配dsRNA是一類低毒、廣譜的抗病毒材料，它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生廣譜的內(nèi)源干擾素及其它免疫因子，干擾病毒合成，改變細(xì)胞骨架，促進(jìn)2’，5’-寡聚腺苷酸合成，激活蛋白激活酶和RNA L酶的活力，以降解進(jìn)入機(jī)體的病毒，提高機(jī)體綜合免疫能力，保護(hù)正常細(xì)胞免受病毒感染，達(dá)到抑制、治療惡性病毒性疾病的目的。
本發(fā)明對(duì)失配dsRNA進(jìn)行了長期研究，且進(jìn)行了失配雙鏈核糖核酸對(duì)慢性乙型肝炎的治療進(jìn)行了初步研究(見報(bào)告1)、失配雙鏈核糖核酸對(duì)小鼠肝癌的抗腫瘤作用的初步研究(見報(bào)告2)，并已得到一定的結(jié)果，證明失配dsRNA對(duì)人類肝腫瘤及乙型肝炎有顯著的抑制作用。
報(bào)告1.失配雙鏈核糖核酸注射液治療慢性乙型肝炎的初步研究一般資料用失配雙鏈核糖核酸注射液治療慢性乙型肝炎19例，治療一個(gè)月后復(fù)查一次，復(fù)查病人13例，其中男12例，女1例，最小年齡14歲，最大年齡49歲，檢出HBV標(biāo)志物陽性最短的2年，最長的10年。
用法3例每天1支，肌肉注射，療程15天。
10例每天2支，隔日一次，肌肉注射，療程1個(gè)月。
結(jié)果15天療程和1個(gè)月療程因人數(shù)少，其結(jié)果無法比較，故一起計(jì)算。
患者使用反應(yīng)食欲增強(qiáng)，體力旺盛，無不良反應(yīng)，初步觀察，比α-干擾素好。下表為12例HBV大三陽患者失配雙鏈核糖核酸注射液治療前后的檢測比較。
HbeAg HBV-DNA轉(zhuǎn)陰 降低 無變化 升高 合計(jì)轉(zhuǎn)陰 降低 無變化 升高 合計(jì)0 3 5 4 12 2 4 3 3 12
初步結(jié)論該失配雙鏈核糖核酸試用品在已用的病例中，患者癥狀明顯改善，部分患者要求應(yīng)用失配雙鏈核糖核酸治療。該試用品在短期觀察中抑制病毒復(fù)制方面有一定療效，值得進(jìn)一步擴(kuò)大臨床驗(yàn)證。
報(bào)告2.失配雙鏈核糖核酸注射液對(duì)小鼠肝癌的抗腫瘤作用材料與方法實(shí)驗(yàn)時(shí)取昆明種小鼠50只，18-22g，雌雄各半，腋部皮下接種按1∶3稀釋的肝癌細(xì)胞懸液，0.2ml/只。接種后，隨機(jī)分為5組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)組分為三組，分別按人體推薦量的100倍(高)、50倍(中)和25倍(低)的失配雙鏈核糖核酸注射液給小鼠腹腔注射(ip)，0.2ml/只，每日一次，連續(xù)7天。陽性對(duì)照組給予5-氟尿嘧啶(5-Fu)ip，25mg/Kg，每日1次，連續(xù)4天。空白對(duì)照組ip同容量生理鹽水。停藥后次日，處死小鼠，稱體重，剖取瘤塊，稱瘤重，求抑瘤率。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果Poly IC12U對(duì)小鼠肝癌具有抑瘤作用，高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率分別為36.5％、59.6％和62.5％(見下表)。表Poly IC12U的抗腫瘤作用組別劑量動(dòng)物數(shù)體重(g) 瘤重(g)抑瘤率 P值前后 前 后(x±S) ％對(duì)照--1010 20.4±0.85 27.9±0.63 1.04±0.05--5-Fu 25mg/Kg 1010 21.4±1.05 22.9±1.75 0.16±0.05 84.6 ＜0.001實(shí)驗(yàn)組2mg/Kg 1010 20.7±1.16 26.5±2.51 0.39±0.14 62.5 ＜0.001實(shí)驗(yàn)組1mg/Kg 1010 20.8±0.92 27.1±2.09 0.42±0.11 59.6 ＜0.001實(shí)驗(yàn)組0.5mg/Kg1010 21.4±0.53 28.0±3.31 0.66±0.15 36.5 ＜0.001結(jié)論從失配雙鏈核糖核酸對(duì)肝癌小鼠的抗腫瘤初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本藥的高、中、低三個(gè)劑量組的抑瘤率分別為36.5％、59.6％和62.5％，均顯示抑瘤作用。失配雙鏈核糖核酸為干擾素誘導(dǎo)劑，已知干擾素在惡性腫瘤的免疫治療中具有一定療效，是否失配雙鏈核糖核酸系通過體內(nèi)干擾素的誘生發(fā)揮抗腫瘤作用應(yīng)予以考慮。
權(quán)利要求
1.雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是失配的，PolyI·PolyC11-32U或稱rIn·r(C11-32U)n。
3.如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是以核糖核酸RNA為對(duì)照物，分子量大小分布以沉降系數(shù)表示，集中在4S-28S范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是以核糖核酸RNA為對(duì)照物，分子量大小分布以堿基數(shù)表示，集中在50-10000的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸在制備治療人類肝腫瘤及乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在dsRNA技術(shù)的基礎(chǔ)上,將分子量大小分布由沉降系數(shù)為≤42S的dsRNA修飾至4－28S左右的失配dsRNA,以改變現(xiàn)有抗病毒藥物毒副作用大的缺點(diǎn),通過對(duì)dsRNA的結(jié)構(gòu)的修飾,保留其原有的抗病毒功能,降低毒副作用。本發(fā)明可用于治療包括病毒性心肌炎、肝炎、腦炎及呼吸道感染等疾病在內(nèi)的克薩奇病毒感染。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1357332SQ0113613
公開日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月23日
發(fā)明者聶實(shí)踐, 胡冬琴 申請(qǐng)人:北京百林康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司