專利名稱：來源于馬尼拉水蛭的透明質(zhì)酸酶,分離、純化和重組生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來源于熱帶水蛭馬尼拉水蛭(Hirudinariamanillensis)的新型透明質(zhì)酸酶的分離、純化和表征。因此，根據(jù)本發(fā)明，這種新酶被稱為“馬尼拉水蛭酶(manillase)”。本發(fā)明還涉及馬尼拉水蛭酶的重組生產(chǎn)方法，包括DNA和氨基酸序列以及表達載體和宿主系統(tǒng)的公開。最后，本發(fā)明涉及馬尼拉水蛭酶用于治療目的的用途，例如，用于治療心肌疾病、血栓事件和腫瘤。
透明質(zhì)酸或hyaluronan(HA)是線性不分支的高分子量(2-6×106)葡糖胺聚糖，由重復二糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(β1-4)GlcUA組成。其羧基在胞外液體的優(yōu)勢pH下完全離子化，無論是正常的或病理的。HA與硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素和肝素均屬于葡糖胺聚糖類(Jeanloz R.W.，風濕性關(guān)節(jié)炎(Arthr Rheum.)1960，3，233-237)。與其他未修飾的葡糖胺聚糖(GAG)不同，它沒有硫酸取代或共價連接的肽，其鏈長度和分子量通常極高。HA普遍分布于結(jié)締組織中，在引入改進的固定方法(Hellstrom S.等人，1990，組織化學雜志(Histochem.J.)22，677-682)和利用hyaluronan結(jié)合肽(HABP)的特異組織化學方法后，實際上在身體的所有部分中均發(fā)現(xiàn)。它在發(fā)育和成熟過程中也存在于神經(jīng)外胚層來源的組織中。
術(shù)語透明質(zhì)酸酶根據(jù)本發(fā)明通常是指一種酶，其作用于透明質(zhì)酸，而無論其對其他底物的活性如何。
透明質(zhì)酸酶首先從微生物中而后從哺乳動物睪丸中分離，后者現(xiàn)在是其主要來源(Meyer，K.《酶》，1971，307)。
根據(jù)反應(yīng)機制，透明質(zhì)酸酶被分為主要三類。
第一類微生物酶包括通過β-消除作用于其底物，產(chǎn)生A-4，5-不飽和二糖。因此該酶必須被命名為透明質(zhì)酸裂合酶，EC 4.2.99.1。
第二類，透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶或睪丸型透明質(zhì)酸酶(EC 3.2.1.35)作為一種內(nèi)切N-乙酰-β-D-己糖胺酶，將HA降解為較小的片段，首先是在游離還原末端含有己糖胺部分的四糖。與睪丸透明質(zhì)酸酶有類似性質(zhì)的酶已經(jīng)從蝌蚪、蛇毒、蜂毒、大量動物組織、人血清和其他來源中獲得。眾所周知，來自睪丸的透明質(zhì)酸酶也具有轉(zhuǎn)糖基酶活性(WeissmanB.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)1954，208，417-429)。屬于這類透明質(zhì)酸酶的酶顯示不僅對于透明質(zhì)酸而且對于軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、軟骨素和硫酸皮膚素的酶活性。
第三類由透明質(zhì)酸葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.36)組成，其作為一種內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶。該酶從歐洲醫(yī)蛭(Hirudo medicinalis)中分離(Yuki H.和Fishman W.H.，生物化學雜志1963，238，1877-79)，對HA絕對特異。硫酸軟骨素、皮膚素和肝素不是該透明質(zhì)酸酶的底物。它只將透明質(zhì)酸降解為在游離還原末端含有葡糖醛酸的四糖(Linker A.等人，生物化學雜志1960，235，924-27)。與哺乳動物內(nèi)切-β-葡糖胺酶相反，肝素對該水蛭透明質(zhì)酸酶的活性沒有影響。因此，它能與肝素一起對患者施用，其衍生物被廣泛用作抗凝劑。EP 0 193 330中公開了來源于水牛水蛭的蛭科亞科(包括Hirudinaria、Illebdella、Poecilodbella、Sanguisoga屬)種(Poecilodbella granulosa)的透明質(zhì)酸特異的內(nèi)切-β-葡糖苷酸酶(稱為“orgelase”)，其分子量約為28.5。
透明質(zhì)酸酶有許多體內(nèi)和體外用途。靜脈內(nèi)施用透明質(zhì)酸酶已被提議用于心肌梗塞的治療(Kloner R.A.等人，循環(huán)(Circulation)1978，58，220-226；Wolf R.A.等人，美國心臟病雜志(Am.J.Cardial.)1984，53，941-944；Taira A.等人，血管學(Angiology)1990，41，1029-1036)。心肌梗塞代表非機械損傷的常見形式；即嚴重的細胞損傷和死亡，在此情況下是由突然細胞缺氧引起的。在大鼠中誘導的實驗性心肌梗塞中(Waldenstrom A.等人，1991，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)88，1622-1628)，損傷的(梗塞區(qū))心肌的HA含量3天后在24小時內(nèi)幾乎增加到正常的3倍，并伴隨有間質(zhì)性水腫。梗塞區(qū)的相對含水量也進行性增高，到第3天達到最大值，并且與HA積累強烈相關(guān)。升高的HA含量與水腫的相同關(guān)聯(lián)已經(jīng)在實驗心臟和腎移植排斥中(Hallgren R.等人，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)1990，85，668-673；Hallgren R.等人，實驗醫(yī)學雜志(J.Exp.Med.)1990，171，2063-2076)，人腎移植排斥(Well A.等人，移植(Transplantation)，1990，50，240-243)、肺病(Bjermer A.等人，英國醫(yī)學雜志(Brit.Med.J.)1987，295，801-806)和特發(fā)性間質(zhì)纖維化(Bjermer A.等人，胸(Thorax)，1989，44，126-131)中發(fā)現(xiàn)。所有這些研究不僅提供了急性炎癥中HA升高的證據(jù)，而且證明其在液體局部滯留中的部分主要引起組織腫脹，并影響心臟的機械和電生理功能。
這些結(jié)果能解釋臨床實驗中使用的透明質(zhì)酸酶的作用機理。據(jù)報道，透明質(zhì)酸酶處理限制大鼠、狗和人中心肌缺血期間的細胞損傷(Maclean D.等人，科學，1976，194，199)。HA的降解之后可以是組織水積累的減少，組織壓的降低和最終較好的灌注。
已經(jīng)顯示，來自水蛭的透明質(zhì)酸酶以及含透明質(zhì)酸酶提取物能用于其他治療目的。因此，透明質(zhì)酸酶治療單獨或與環(huán)孢霉素結(jié)合，導致移植物存活期延長(Johnson C.等人，國際移植(Transplant Inter.)，待發(fā)表)。透明質(zhì)酸酶(“擴散因子”)最廣義上講可用于提高組織通透性，以增強其他藥理制劑的擴散(例如在癌癥治療中與細胞抑制劑結(jié)合)。此外，也能證明，透明質(zhì)酸酶可用于腫瘤治療，用作血管生成抑制劑，并作為腫瘤治療中局部藥物施用的助劑，用于青光眼和其他眼病的治療，并作為其他治療劑如局部麻醉劑和抗生素的助劑。Farr等人(1997，Wiener Medizinische Wochenschrift，15，347頁)的綜述文章及此處引用的文獻中給出了治療及有關(guān)用途的綜述。因此，需要一種活性化合物如透明質(zhì)酸酶。然而，已知的和可獲得的透明質(zhì)酸酶或者不穩(wěn)定(來自歐洲醫(yī)蛭的透明質(zhì)酸酶，Linker等人，1960，生物化學雜志235，924頁；Yuki和Fishman，1963，生物化學雜志238，1877頁)或者顯示相當?shù)偷谋然?EP 0 193 330，Budds等人，1987，生物化學與生理學(Comp.Biochem.Physiol.)87B，3，497頁)。而且，已知的透明質(zhì)酸酶均未能以重組形式獲得，而這是廣泛商業(yè)應(yīng)用的必要條件。
本發(fā)明現(xiàn)在第一次公開了從馬尼拉水蛭中分離、純化的一種新型透明質(zhì)酸酶，以及通過生物工程技術(shù)獲得的該酶的重組形式。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供從水蛭種馬尼拉水蛭中分離的純化蛋白質(zhì)，它具有透明質(zhì)酸酶的生物活性，其活性不受肝素影響，特征在于根據(jù)糖基化具有53-60kD的分子量。這種新的蛋白質(zhì)，被稱為“馬尼拉水蛭酶”，以其天然形式糖基化，具有約58kD(±2kD)的分子量，有4種糖基形式。然而，非糖基化的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的目的，它們可按照標準技術(shù)通過酶促或化學切割糖殘基而獲得。經(jīng)SDS-PAGE測定，本發(fā)明的非糖基化酶具有約54(±2)的分子量。
直接比較顯示，EP 0 193 330中公開的透明質(zhì)酸酶(“orgelase”)在相同條件下具有約28的分子量，并且含有許多雜質(zhì)如血紅蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的天然馬尼拉水蛭酶的最適pH為6.0-7.0，等電點為7.2-8.0，具有圖7所示的氨基酸序列。
令人吃驚的是，通過制備性純化方法獲得的馬尼拉水蛭酶(見下文)具有100-150、優(yōu)選地110-140(WHO)kU/mg蛋白質(zhì)的極高的比活，而orgelase的比活只有約1.2kU/mg。而且，orgelase與馬尼拉水蛭酶相比有更低的最適pH(5.2-6.0)。馬尼拉水蛭酶象orgelase一樣，不受肝素影響。
此外，本發(fā)明的一個目的在于提供一種分離并純化馬尼拉水蛭酶的方法，其包括下列步驟(i)用酸性緩沖液勻漿馬尼拉水蛭種的水蛭的頭和離心，(ii)硫酸銨沉淀步驟(i)的上清液，(iii)陽離子交換層析，(iv)伴刀豆球蛋白A親和層析，(v)疏水作用層析，(vi)在用透明質(zhì)酸片段包被的基質(zhì)上親和層析，(vii)凝膠滲透層析，和任選地，(viii)純化蛋白質(zhì)的酶促或化學去糖基化。
以上公開的方法步驟保證了能獲得具有這種高生物酶活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有透明質(zhì)酸酶生物活性的蛋白質(zhì)，其活性不受肝素影響，其分子量根據(jù)糖基化為53-60，可通過上述和權(quán)利要求書中所述的方法步驟獲得，優(yōu)選地具有＞100kU/mg蛋白質(zhì)的酶比活。術(shù)語“單位”在上下文中是指“國際單位”(IU)。
本發(fā)明公開了一種制備重組馬尼拉水蛭酶的方法，包括各自的DNA分子、載體和轉(zhuǎn)化的宿主細胞。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種編碼具有天然馬尼拉水蛭酶性質(zhì)的蛋白質(zhì)的DNA序列。
也能顯示，能選擇至少另外三種具有略微不同DNA序列的克隆，它們編碼具有馬尼拉水蛭酶(透明質(zhì)酸酶)性質(zhì)、具有略微不同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
所述克隆具有圖8、9、10所示的DNA序列(上面的序列)，這也是本發(fā)明的一個目的，以及含有所述序列的表達載體，和用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
另外，本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白，其具有透明質(zhì)酸酶生物活性，分子量根據(jù)糖基化為55-59kD，具有圖8、9、10所示的任一氨基酸序列(下面的序列)，或與所述序列至少80％同源的序列。術(shù)語“馬尼拉水蛭酶”包括具有上述性質(zhì)的所有這些蛋白質(zhì)。
天然的以及重組的蛋白質(zhì)可以用作能直接對患者施用或在藥用組合物中使用的藥物。因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供一種如上下文中所述的、可用作藥物的重組或天然蛋白質(zhì)，和含有該蛋白質(zhì)和藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的各自的藥用組合物。
本發(fā)明的藥用組合物還可含有極其多樣性的活性藥用化合物。優(yōu)選的藥劑是不抑制或影響根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物和藥學活性的抗凝劑。這些抗凝劑可以是，例如，肝素、蛭素或雙香豆素，優(yōu)選地是肝素。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種另外含有藥學活性化合物、優(yōu)選地肝素的藥用組合物。
對于在人類或獸醫(yī)治療中的應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地作為分散劑(“擴散”因子)或支持通過組織和皮膚的滲透。因此，馬尼拉水蛭酶能在例如腫瘤化學治療領(lǐng)域中用作其他物質(zhì)(如局部麻醉劑)的一種助劑，用于與急性心肌缺血或梗塞有關(guān)的疾病的治療，用于青光眼及其他眼病的治療，例如提高眼中生理液體的循環(huán)，用于皮膚和組織移植物的處理，用以去除淤血并改善循環(huán)，作為通過皮膚、膜、其他組織的藥物輸送系統(tǒng)，作為去除環(huán)繞某些致病微生物或某些腫瘤和癌組織的透明質(zhì)酸囊的藥劑，作為血管生成抑制劑，能用作抗血栓和抗腫瘤劑。
因此，如上下文所述的馬尼拉水蛭酶在生產(chǎn)特別用于治療心肌、心血管和血栓疾病和腫瘤的藥物中的應(yīng)用是本發(fā)明的一個目的。
在此使用時，術(shù)語“藥學可接受的載體”是指惰性的、無毒的固體或液體填料、稀釋劑或包裹材料，它們不與活性化合物或患者不利地反應(yīng)。合適的優(yōu)選的液體載體在本領(lǐng)域周知，如無菌水、鹽水、葡萄糖水、糖溶液、乙醇、二醇類和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、豆油和礦物油。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可作為單位劑量施用，其含有一般用于腸胃外施用的常規(guī)無毒藥學可接受的載體、稀釋劑、佐劑和載體。
術(shù)語“腸胃外”在此包括皮下、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和氣管內(nèi)注射和輸注技術(shù)。其他施用如口服和局部施用也是合適的。腸胃外組合物和組合最優(yōu)選地根據(jù)已知方法以大丸劑(bolus)形式或作為固定滴注靜脈內(nèi)施用。用于口服的片劑和膠囊含有常規(guī)賦形劑，如結(jié)合劑、填料、稀釋劑、成片劑、滑潤劑、分解劑和濕潤劑。片劑可按照本領(lǐng)域周知的方法包被。
口服液體制劑可以是水或油狀懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或者可以是干燥產(chǎn)品，在使用前可用水或另一種合適的載體重建。這些液體制劑可含有常規(guī)添加劑，如懸浮劑、乳化劑、非水載體和防腐劑。
局部施用可以是水或油狀懸液、溶液、乳劑、軟膏或優(yōu)選地乳膏的形式。
根據(jù)本發(fā)明的單位劑量可含有每日需要量的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或其亞多劑量，補足希望的劑量。對于指定患者(哺乳動物，包括人類)，治療可接受的劑量和劑量率取決于多種因素，如使用的特定活性材料的活性，年齡、體重、全身健康、性別、飲食、施用時間和途徑、清除率、的性質(zhì)。
因此，在所治療的患者中(體內(nèi))含抗凝劑(如肝素)的組合物和組合中，本發(fā)明蛋白質(zhì)(馬尼拉水蛭酶)的藥學有效的每日劑量約為0.01-100mg/kg體重(根據(jù)100kU/mg的比活)，優(yōu)選地為0.1-10mg/kg體重。根據(jù)施用形式，單次劑量可含有0.5-10mg馬尼拉水蛭酶。
當與馬尼拉水蛭酶一起施用時，例如肝素的濃度一般為一天500-4000U(IU)，但是，必要時可增加或減少。
本發(fā)明的馬尼拉水蛭酶的純化如實施例所詳述實現(xiàn)。表1顯示馬尼拉水蛭酶的制備性純化方案。表2顯示根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的富集過程，表3顯示馬尼拉水蛭酶與已知的水蛭透明質(zhì)酸酶的比較。
一種切割透明質(zhì)酸的酶，稱為馬尼拉水蛭酶，已經(jīng)從馬尼拉水蛭水蛭的頭中分離，并純化為同質(zhì)。該透明質(zhì)酸酶如下純化用酸抽提，硫酸銨沉淀，隨后在陽離子交換劑、伴刀豆球蛋白A Sepharose、丙基-Fractogel、hyaluronan片段-Sepharose和二醇-LiChrospher柱上連續(xù)層析。hyaluronan片段利用牛睪丸透明質(zhì)酸酶切割天然hyaluronan制備。純化并表征該片段后，如下所述制備親和基質(zhì)。這些親和基質(zhì)第一次用于透明質(zhì)酸酶的純化。這種高效層析是一種快速、有效地純化hyaluronan結(jié)合蛋白的技術(shù)。每一純化步驟后酶活性的恢復相當高。三次獨立的制備性純化的結(jié)果相當。它們產(chǎn)生高活性樣品，根據(jù)純化程度為20-160kU/mg。在比較實驗中，如現(xiàn)有技術(shù)所述分離已知的透明質(zhì)酸酶，并將其性質(zhì)與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)相比較(表3)。
根據(jù)表1的方案純化的透明質(zhì)酸酶不同于其他作者描述的其他水蛭透明質(zhì)酸酶。在非解離條件下(任何β-巰基乙醇)獲得類似的分子量，表明馬尼拉水蛭酶與哺乳動物來源的許多透明質(zhì)酸酶制劑一樣，是一種單亞基酶。經(jīng)MALDI測定，這種終制劑是表觀分子量為58±2的單亞基酶(

圖1)，等電點為7.2-8.0。表1馬尼拉水蛭酶的制備純化原材料的制備來自孟加拉的水蛭～15kg↓分離活動物冷凍這些動物↓頭的制備～1kg水蛭頭↓勻漿與抽提*酸沉淀離心**階段I-樣品36％硫酸銨沉淀上清液離心、透析**階段II-樣品陽離子交換EMD(SO3-)*層析透析***↓Con A-親和層析透析***↓丙基-Fractogel層析*透析***↓透明質(zhì)酸片段(HA)-親和層析透析***↓二醇-LiChrospher層析****→140 000 WHO單位↓反相層析分析****
表2馬尼拉水蛭酶從1kg水蛭頭中的純化(富集)
表3馬尼拉水蛭酶與已知水蛭透明質(zhì)酸酶的比較
表中的星號是指關(guān)于活性測定和生物化學表征的信息(*_*****)。
使用的活性測定和生物化學表征方法取決于分析樣品中馬尼拉水蛭酶的濃度。因此，它們在連續(xù)純化步驟中通過適當技術(shù)連續(xù)擴展。
*-活性測定-濁度降低檢測**-活性測定-濁度降低檢測-蛋白質(zhì)含量測定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)-血紅蛋白測定***-活性測定-濁度降低檢測-蛋白質(zhì)含量測定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印跡(抗人血紅蛋白抗體)****-活性測定-濁度降低檢測-蛋白質(zhì)含量測定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印跡，抗人血紅蛋白抗體-SDS-PAGE-Western印跡，抗Con A抗體-SDS-PAGE-Western印跡，抗肽抗體*****-MALDI-蛋白質(zhì)含量測定(Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印跡-抗肽抗體馬尼拉水蛭酶與伴刀豆球蛋白A的結(jié)合顯示，透明質(zhì)酸酶是一種糖蛋白，其糖成分終止于α-D-吡喃甘露糖基或α-D-吡喃葡糖基和空間相關(guān)的殘基。馬尼拉水蛭酶活性樣品在SDS-PAGE中顯示RF值幾乎相同的兩條帶。較長的SDS-PAGE和不同的電泳條件可用于更好地分離這些條帶。在這些實驗中，能檢測到另外兩條較弱的帶(圖2)。它們?nèi)康腘端部分(30個氨基酸)分別測序，再次顯示N端無差異。用內(nèi)切-F-糖苷酶(PNGase)去糖基化后，觀察到所有4條帶產(chǎn)生一條帶，MW降低約3。
因此，觀察到的電泳遷移率的差異極有可能是由于馬尼拉水蛭酶分子糖基化模式的差異。神經(jīng)氨酸酶、O-內(nèi)切-糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶加O-糖苷酶處理對純化的酶的分子量無影響(圖3)。這些結(jié)果表明，馬尼拉水蛭酶含有至少一種N-連接的寡糖鏈。O-連接的糖鏈不能用所用的方法檢測到。
作為結(jié)束的純化步驟，進行RP-層析。盡管還不能檢測到酶活性，但能除去鹽和肽蛋白酶抑制劑(圖4)。利用MALDI進一步表征含有蛋白質(zhì)的級分。利用MALDI測定的馬尼拉水蛭酶分子量為58.3。
肝素對該透明質(zhì)酸酶的活性沒有影響(圖5)。馬尼拉水蛭酶比歐洲醫(yī)蛭透明質(zhì)酸酶穩(wěn)定許多倍(圖6)。而且，部分純化的馬尼拉水蛭酶的樣品在狗和大鼠血漿中顯示極高的穩(wěn)定性，范圍為-20到+37。
HA-親和基質(zhì)的制備已經(jīng)在文獻中描述(Tengblad A.，生物化學與生物物理學學報(Biochim.Biophys.Acta)，1979，578，281-289)。該HA-基質(zhì)用于從相同來源中純化軟骨透明質(zhì)酸鹽結(jié)合蛋白或蛋白聚糖蛋白質(zhì)-硫酸角質(zhì)素核(Christner J.E.，分析生物化學(Anal.Biochem.)，1978，90，22-32)。利用親和基質(zhì)純化的HA-結(jié)合蛋白(HABP)進一步用于關(guān)于透明質(zhì)酸鹽受體(Green S.J.等人，細胞科學雜志(J.Cell Science)，1988，89，145-156；Chan F.L.等人，細胞生物學雜志(J.Cell.Biol.)，1997，107，289-301)或hyaluronan(Waldenstrom A.等人，1991，臨床研究雜志，88，1622-1628；Waldenstrom A.等人，歐洲臨床研究雜志(Eur.J.Clin.Invest.)，1993，23，277-282)在組織中分布的組織化學研究。
然而，我們實驗室發(fā)展的這種凝膠的制備方法使人們能生產(chǎn)可準確確定HA片段濃度(1-15mg/ml)的凝膠。這又使得人們能使用這些凝膠，利用它們對hyaluronan的不同親和力，不僅用于hyaluronan結(jié)合蛋白的純化，而且用于其分離。這種選擇性制備能利用不同長度的HA片段來控制。這種分離可使人們能更好地表征生物學相關(guān)的多種受體(例如在腫瘤學中)。
按照所述方法制備的HA-基質(zhì)能用于1)已知HA-結(jié)合蛋白的純化2)未知HA-結(jié)合蛋白的純化3)新HA-結(jié)合蛋白的鑒定4)透明質(zhì)酸酶的純化用本發(fā)明所述方法獲得的HA-片段能利用現(xiàn)代分析方法(NMR，MALDI-MS)表征，并應(yīng)用于對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究。此外，這些片段也能應(yīng)用于關(guān)于血管生成和新血管生成過程的研究。
附圖簡述圖1蛋白質(zhì)標準、馬尼拉水蛭酶樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE-CBB染色)(在二醇-LiChrospher層析后)。
1-寬范圍蛋白質(zhì)標準2-馬尼拉水蛭酶，4μg3-Orgelase，6μg4-血紅蛋白，40μg圖2a)SDS-PAGE(CBB染色)和b)HA-親和層析后對4種馬尼拉水蛭酶活性樣品的SDS-PAGE-Western印跡(3-6道)。在該實驗中使用兔P3-2A多克隆抗肽抗體。
圖3下列樣品的SDS-PAGE(CBB)1-LW-MM-低分子量標記(BioRad)2-馬尼拉水蛭酶3-N-糖苷酶F(PNGase F)4-用PNGase F處理后的馬尼拉水蛭酶5-用O-糖苷酶處理后的馬尼拉水蛭酶6-用O-糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶處理后的馬尼拉水蛭酶7-O-糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶8-分子量標記(MWM-預染色的，BioRad)圖4下列樣品的反相層析a)核糖核酸酶標準b)馬尼拉水蛭酶樣品(比活140kU/mg)圖5肝素對馬尼拉水蛭酶(-O-)和牛睪丸透明質(zhì)酸酶(-·-)的透明質(zhì)酸酶活性的影響X軸IU肝素；Y軸保留的％活性圖6透明質(zhì)酸酶在緩沖液和血漿中的穩(wěn)定性測定(a)馬尼拉水蛭酶(4℃)，(b)馬尼拉水蛭酶(-20℃)(c)馬尼拉水蛭酶(37℃)(d)牛睪丸透明質(zhì)酸酶(Y)和歐洲醫(yī)蛭透明質(zhì)酸酶(A)
X軸溫育天數(shù)；Y軸WHO(IU)單位圖7通過測定從馬尼拉水蛭中分離并純化的根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的序列而獲得的天然馬尼拉水蛭酶的氨基酸序列(對應(yīng)于SEQ IDNo.1)。
圖8重組馬尼拉水蛭酶克隆(克隆21)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(對應(yīng)于SEQ ID No.2，3)。
圖9重組馬尼拉水蛭酶克隆(克隆31)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(對應(yīng)于SEQ IDNo.4，5)。
圖10重組馬尼拉水蛭酶克隆(克隆31)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(對應(yīng)于SEQ ID No.6，7)。
圖11用于馬尼拉水蛭酶的大腸桿菌表達載體圖12用于馬尼拉水蛭酶的Baculo供體質(zhì)粒圖13用于馬尼拉水蛭酶的酵母表達載體本發(fā)明通過下列實施例詳細描述。然而，這些實施例不將本發(fā)明限制于實驗中使用和在實施例中所述的普通材料、方法、物理參數(shù)、化合物、生物材料、表達載體和宿主等。如果沒有另外提出，使用現(xiàn)有技術(shù)中周知的標準技術(shù)和通?？色@得的材料。
實施例1(一般說明)使用馬尼拉水蛭的粗提物進行多次預實驗，以建立純化方法。
選擇并驗證下列方法硫酸銨沉淀法，陽離子和陰離子交換層析，利用肝素-Fractogel、Con A-Sepharose的親和層析，在辛基-Sepharose、丙基-、苯基-、丁基-Fractogel上的疏水作用層析(HIC)，制備等電聚焦和制備電泳。
結(jié)果顯示，酸和銨沉淀、陽離子交換、Con A-Sepharose、丙基-Fractogel HIC和二醇-LiChrospher和透明質(zhì)酸片段-Sepharose(HA-Sepharose)層析適用于馬尼拉水蛭酶的純化。我們實驗室制備的HA-Sepharose基質(zhì)成功地用于該糖苷酶的純化。
除非另外指出，所有制備都在低溫下進行。
純化按照以上所示的方案進行(表1)。
實施例2用于純化的原材料的制備；水蛭頭的制備。
在孟加拉國收集的馬尼拉水蛭水蛭立即驟凍，然后貯存于-40℃至-80℃中。它們在冷凍狀態(tài)下切下頭部，頭的重量約占體重的5％。
實施例3馬尼拉水蛭酶從水蛭頭的提取方法在典型純化中，1kg冷凍水蛭頭在Waring攪拌器中用2500ml含0.025％硫柳汞和17mg/ml海藻糖的冷0.1M乙酸緩沖液pH4.0(MerckKGaA，Art.No.1.08216)勻漿。輕輕攪拌勻漿，并立即加入下列蛋白酶抑制劑1.PMSF 1.7mg/ml 10.0mM2.亮抑蛋白酶肽 10.0μg/ml 20.0μM3.胃酶抑制劑A 0.7μg/ml 1μM4.EGTA 380.35μg/ml 1.0mM5.p-APMSF 40.0μg/ml 20.0μM在低溫下連續(xù)攪拌4小時，并以4900轉(zhuǎn)/分離心20分鐘。收集上清液溶液(上清液I)，并與隨后通過提取組織沉淀獲得的上清液II合并。
合并的上清液代表階段I物質(zhì)。該方法總結(jié)于下列方案中 *樣品的活性測定和生物化學表征利用活性測定-濁度降低檢測和蛋白質(zhì)含量測定(E280，Pierce BCA方法，SDS-PAGE)進行。
測定水蛭勻漿的酶活性是不可能的，因為血紅蛋白(用血紅蛋白測定試劑盒測定，Merck KGaA，13851)和其他蛋白質(zhì)含量極高。而且，透明質(zhì)酸酶活性在酸沉淀之前的階段不能測定。這些提取物的最終比活(每mg蛋白質(zhì)的活性)約為10-30 WHO單位。根據(jù)SDS-PAGE，粗提物含有大量不同的蛋白質(zhì)，主要的分子量為～120、55～60、45、31、28、22、15和14-10。
實施例4階段I物質(zhì)的硫酸銨沉淀步驟然后，選擇硫酸銨沉淀步驟作為馬尼拉水蛭酶純化的第一步，這導致該酶富集～5倍。
通過在+4℃下緩慢加入固體硫酸銨(Merck KGaA)至36％w/v，從階段I的粗提物中沉淀酶學惰性的物質(zhì)。攪拌該混合物1小時并離心。棄去沉淀物。上清液對流動的去離子水透析過夜，并對20mM磷酸緩沖液pH6.0透析24小時。這些提取物的終比活約為40-150 WHO單位。根據(jù)SDS-PAGE，階段II提取物含有大量不同的蛋白質(zhì)。
實施例5陽離子交換層析以分批吸附方式使用陽離子交換劑。富含酶的透析樣品(階段II)與1升Fractogel EMD SO3-650(S)陽離子交換劑，Merck KGaA，Art.No.16882溫育過夜。在通過離心結(jié)束溫育后，用緩沖液洗滌陽離子交換劑，再次離心，并使HPLC-Superformace柱充滿凝膠。用20mM磷酸緩沖液pH4.9洗滌該柱后，用含有0-1M線性NaCl梯度的相同磷酸鈉緩沖液pH6.0從該柱上洗脫下結(jié)合的蛋白質(zhì)。每3分鐘收集級分(9ml)，監(jiān)測280nm的吸光度。馬尼拉水蛭酶在0.15-0.18M NaCl濃度時被洗脫。測定所有級分的活性和蛋白質(zhì)含量，合并級分，并對含有疊氮鈉和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸緩沖液pH6.0透析過夜。
進行蛋白質(zhì)濃度、“合并液”的比活的測定和SDS-PAGE分析。盡管有極高的產(chǎn)量(活性)和高比活(每mg蛋白質(zhì)的WHO活性單位，相當于IU)，樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果仍顯示許多蛋白質(zhì)的混合物。利用Fractogel EMD SO3-650(S)_(Merck KGaA，德國)的陽離子交換層析導致約10-50的極高的純化倍數(shù)。該步驟在減少血紅蛋白雜質(zhì)上極其有效。而且，我們發(fā)現(xiàn)，分批方法是處理大體積階段II上清液(5-16升)的極有用的初始步驟。
實施例6伴刀豆球蛋白A-Sepharose親和層析利用Con A凝集素親和層析在陽離子交換后進行對富含酶的合并液的進一步純化。可從Pharmacia Biotech，Art.17-0440-01購得的Con A-Sepharose_用乙酸緩沖液0.1M+0.5M NaCl pH8.0；0.1M硼酸+0.1％Triton×100 pH6.0，最后用0.1M乙酸緩沖液+0.5M NaCl pH6.0洗滌。樣品對20mM乙酸緩沖液+0.5M NaCl+1mM CaCl2+1mM MgCl2pH6.0+1mM MnCl2透析過夜，在室溫下加于1000ml ConA柱上，并用510ml 100mM乙酸緩沖液+0.5M NaCl+1mM CaCl2+1mM MgCl2pH6.0+1mM MnCl2洗脫2小時。
隨后利用含有0.5M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的相同緩沖液解吸。在280nm下連續(xù)監(jiān)測洗脫。測定已收集的3ml級分的透明質(zhì)酸酶活性。合并活性級分，對含有疊氮鈉和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸緩沖液pH6.0透析過夜。
進行蛋白質(zhì)濃度、“合并液”的比活的測定和SDS-PAGE分析。該步驟在除去剩余血紅蛋白上極有效。ConA層析導致4-10的純化倍數(shù)。該倍數(shù)因原材料的質(zhì)量而不同。
實施例7丙基Fractogel疏水作用層析向透明質(zhì)酸酶活性Con A-合并液中加入硫酸銨至2M的終濃度。然后將樣品與150ml丙基-Fractogel EMD丙基650(S)_，Merck KGaA，德國，Art.No.1.10085在室溫下溫育1小時，用含有2M硫酸銨的0.1M磷酸緩沖液pH7.0平衡。待溫育結(jié)束后，用相同緩沖液洗滌凝膠兩次，制備HPLC-Superformance(2.6cm×60cm)柱。用0.1M磷酸緩沖液pH7.0洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。每3分鐘收集6ml級分，直接對去離子水透析(2-3小時)，然后對20mM磷酸緩沖液pH6.0透析。測定級分的透明質(zhì)酸酶活性。合并活性級分，并對含有疊氮鈉和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸緩沖液pH6.0透析過夜。進行合并液的蛋白質(zhì)和活性測定。
該層析步驟的純化倍數(shù)約為3-5。前一步驟中從載體凝膠中釋放的少量Con A以及其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)被去除。
實施例8透明質(zhì)酸寡糖親和柱的制備(a)用牛睪丸透明質(zhì)酸酶對hyaluronan(HA)的水解通過在甲苯存在下在4℃下混合過夜，將透明質(zhì)酸7g溶解于1.25升含0.15 NaCl和0.5mM EDTA的0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.2中。之后將含HA溶液的pH調(diào)節(jié)為5.2，并在升溫到37℃后加入牛睪丸透明質(zhì)酸酶(Merck KGaA；700 WHO單位/mg)。對于7g HA，使用在用前立即溶解于50ml上述緩沖液的210mg酶。使水解在恒定攪拌下在37℃下進行30分鐘，通過在沸水浴中100℃加熱5分鐘終止。通過以10000g離心30分鐘澄清反應(yīng)混合液，棄去含有變性蛋白質(zhì)的沉淀，上清液通過上面放置有一個玻璃纖維預過濾器的0.2μm濾膜。利用通過如下具有不同分子截斷值的樹Diaflo超濾膜(Amicon)過濾，分級分離含有HA寡糖(HAOS)的澄清溶液。
(b)通過超濾對HAOS的分級分離由上一步獲得的含HAOS溶液通過30YM Diaflo超濾膜過濾。保存存留液用于其他研究，而濾過液通過10YM Diaflo超濾膜進行第二次超濾。再保存存留液用于其他研究，而通過10YM的溶液通過3YM Diaflo膜進行最后一次超濾。之后，含HA-OS的存留液，約10ml溶液，用于進一步的純化。該級分HAOS 3-10如下純化并進一步用于與Sepharose偶聯(lián)。
(c)HAOS 3-10的純化HA-OS 3-10用Biogel P2_柱純化(脫鹽)。該柱(4cm×100cm)用Biogel2基質(zhì)_裝填，200-400目(BioRad)，用5倍柱體積的水洗滌(Milli Q，Millipore)。由前一步獲得的HAOS 3-10級分(15ml；1.5g寡糖)加于該柱上。該柱用水洗脫，收集15ml級分，分析HA寡糖的存在。合并在鹽(用AgNO3檢測)之前洗脫的含寡糖級分，并再次用3 YM Diaflo膜濃縮。
(d)HAOS 3-10的分析為了確定Sepharose的偶聯(lián)效率，洗滌凝膠(同一批)并懸浮于水中以制備50％漿液。從用作對照的Sepharose HAOS 3-10結(jié)合物和Sepharose懸液中一式三份取出100μl等份，加入在蓋有特氟隆螺旋帽的管中的2.5ml 2.2N三氟乙酸(TFA，Merck KgaA)中。為了水解，用氬沖洗該混合液，并在100℃下溫育16小時。在水解結(jié)束時，樣品在氮氣下干燥，重懸浮于水中，用于測定葡糖胺和糖醛酸。為了確定每次水解糖醛酸和葡糖胺分解的程度，包括含有已知量UA或GIcNAc的對照樣品，并在相同條件下溫育。
在上述條件下，在兩次獨立實驗中每1ml排出的Sepharose凝膠偶聯(lián)5、8、9、11和15mg HAOS 3-10。該結(jié)果基于UA和葡糖胺測定。
(e)使用的測定分析樣品中糖醛酸的含量按照Bitter T.和Muir H.M.，分析生物化學，1962，4，330-334測定。
己糖胺含量用Rondle C.J.M.和Morgan W.T.J.，生物化學雜志，1995，61，586-593的方法分析。
實施例9透明質(zhì)酸片段Sepharose層析(HA-Sepharose層析)含有8-10mg/ml的層析基質(zhì)如下所述制備。含酶樣品對20mM乙酸緩沖液+0.15M NaCl pH4.0透析，并加于25ml HA-Sepharose柱上。在用相同緩沖液洗滌后，用含0.15-1M NaCl梯度的20mM乙酸緩沖液進行洗脫。
1ml級分在透明質(zhì)酸酶活性測定試驗中檢測，合并，對含有疊氮鈉和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸緩沖液pH6.0透析過夜。進行合并液的蛋白質(zhì)和活性測定。該層析步驟的純化因數(shù)約為3。
實施例10二醇-LiChrospher層析對Milli-Q-H2O透析的20ml活性樣品加于二醇-LiChrospher柱上。然后用15ml Milli-Q-H2O平衡該柱，用2ml水洗滌5分鐘。用20mM乙酸緩沖液pH5.9(梯度，0-5mM NaCl)進行活性樣品洗脫15分鐘，用含5mM NaCl的梯度20mM-100mM乙酸緩沖液pH5.5進行35分鐘。測定級分的透明質(zhì)酸酶活性。合并活性級分并對含有疊氮鈉和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸緩沖液pH6.0透析過夜。進行合并液的蛋白質(zhì)和活性測定。純化因數(shù)3。
實施例11RP 18e層析該純化步驟只能用作最后一步，其目的在于獲得不含鹽和其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)(例如肽蛋白酶抑制劑)的樣品。透明質(zhì)酸酶活性完全喪失，因為馬尼拉水蛭酶對該步驟中使用的有機溶劑沒有抗性。馬尼拉水蛭酶樣品加于RP 18e柱上。收集0.25mg/min級分。在0.1％TFA存在下進行洗脫，使用水到99％乙腈的梯度。RP純化的樣品能直接用于氨基酸測序、MALDI測定、糖結(jié)構(gòu)分析，和作為標準用于其他批次馬尼拉水蛭酶的純化。
實施例12活性測定——濁度降低檢測用濁度降低測定進行透明質(zhì)酸酶活性測定。可購得的hyaluronan(分離自不同的動物組織和液體，如人臍帶、公雞冠)和透明質(zhì)酸酶(來源于牛睪丸、豬睪丸、蜂毒的內(nèi)切-β-氨基葡糖苷酶；來源于Streptomyceshyalurolyticus的裂合酶)制劑用于建立合適的活性測定條件。我們實驗室中部分純化了來源于歐洲醫(yī)蛭的內(nèi)切-β-葡糖醛酸糖苷酶。
通過將HA溶解于0.3M磷酸緩沖液pH5.3中制備hyaluronan貯存液(濃度為2mg/ml)。該溶液在測試前直接用相同緩沖液稀釋至0.2mg/ml的濃度。含酶樣品用含0.01％牛白蛋白和77mM NaCl的20mM磷酸緩沖液(酶稀釋緩沖液)稀釋為適量的酶(0.5-5 WHO單位)。向0.1ml這些樣品中加入0.1ml hyaluronan(0.2mg/ml)溶液，混合并在37℃下溫育45分鐘。測試一式兩份進行。通過用1.0ml白蛋白試劑(溶于80mM乙酸/40mM乙酸鈉緩沖液pH3.75中的0.1％白蛋白)稀釋終止該反應(yīng)。在室溫或37℃溫育10分鐘后，讀取600nm的光密度，活性通過與標準比較(SLT-程序)表示為WHO(IU)單位。牛睪丸透明質(zhì)酸酶的WHO制劑(HumphreyJ.H.，世界衛(wèi)生組織公告(Bull.World Health Org.)1957，16，291-294)用作標準。
實施例13蛋白質(zhì)估測通過測量溶液在280nm的紫外吸光度確定柱洗脫液的蛋白質(zhì)含量。合并級分的蛋白質(zhì)濃度利用Pierce微量測定法測定。BSA溶液用作參照蛋白質(zhì)。
實施例14SDS-PAGE電泳按照Laemmli方法進行電泳(自然，1970，227，680-685)。使用下列凝膠4-20％梯度或12.5％分離膠及4％積層膠。樣品在十二烷基硫酸鈉和β-巰基乙醇存在下進行電泳。在用考馬斯亮藍染色和/或銀染(按照Pharmacia說明)后顯示蛋白質(zhì)。
實施例15等電聚焦為了對馬尼拉水蛭酶制劑進行等電聚焦研究，采用供應(yīng)商(Pharmacia)提供的方法。聚焦后，固定凝膠并進行銀染(按照Pharmacia方案)。
實施例16由兔免疫血清制備免疫球蛋白(抗-ConA、抗血紅蛋白和抗-肽兔抗體)利用下列免疫原產(chǎn)生兔血清伴刀豆球蛋白A凝集素、血紅蛋白與肽-KLH偶聯(lián)物的混合物。肽序列與馬尼拉水蛭酶的14氨基酸N端部分相同(KEIAVTIDDKNVIA)。
按照標準Pharmacia說明用蛋白A Sepharose(Pharmacia，17-0780-01)柱純化血清。利用SDS-PAGE和ELISA試驗核實IgG樣品的純度。
實施例17Western-免疫印跡測定合適的樣品等份和預染色的已知分子量的蛋白質(zhì)標記如上所述進行SDS-PAGE。使用預染色的BioRad分子量標記。在轉(zhuǎn)移緩沖液存在下將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠向固定的聚二氟乙烯(PVDF)膜電泳轉(zhuǎn)移(0.8mA/cm2)100分鐘。PVDF膜與封閉液(PBS，pH7.5+2％脫脂奶)在室溫下溫育1小時。然后，該膜與用封閉液適當稀釋的抗體在室溫下溫育2小時。該膜用TBS+0.05％吐溫20，pH7.5洗滌，并與BioRad的山羊抗兔堿性磷酸偶聯(lián)物(第二抗體)在室溫下溫育2小時。該膜用TBS+0.05％吐溫20洗滌兩次，并與BCIP堿性磷酸酶底物液溫育10分鐘。加入終止緩沖液終止反應(yīng)。
實施例18氨基酸測序馬尼拉水蛭酶的N端33個氨基酸殘基的序列通過Edman降解獲得。在馬尼拉水蛭酶活性樣品進行SDS-PAGE后，將條帶轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，用考馬斯藍染色，切下并測序。對于利用RP-柱層析在最后一個純化步驟后獲得的樣品，發(fā)現(xiàn)有相同的氨基序列。
實施例19酶活性的pH依賴性(對于從馬尼拉水蛭和歐洲醫(yī)蛭頭中分離的透明質(zhì)酸酶)在本實驗中使用的透明質(zhì)酸酶樣品從馬尼拉水蛭或歐洲醫(yī)蛭頭中提取，并利用硫酸銨沉淀和陽離子交換層析部分純化。含有500 WHO單位/ml的每一樣品在-20℃、+4℃和37℃和pH 2.6-9.0下溫育(對于pH2.6-5為20mM乙酸；對于pH5-9為20mM磷酸緩沖液)。酶活性在1、2和7天溫育期后測定。在酸性和堿性極端pH時，對于兩種透明質(zhì)酸酶觀察到相同程度的活性抑制。然而，在較長的溫育期間，馬尼拉水蛭酶比歐洲醫(yī)蛭透明質(zhì)酸酶更穩(wěn)定例如在pH7.0和4℃和37℃下溫育7天后，馬尼拉水蛭酶分別保留初始活性的75％和60％。在相同條件下溫育的歐洲醫(yī)蛭透明質(zhì)酸酶在1天后已經(jīng)失活。
實施例20在狗血清存在下透明質(zhì)酸酶的穩(wěn)定性測定(對于從馬尼拉水蛭和歐洲醫(yī)蛭頭中分離的透明質(zhì)酸酶)
5kU/ml馬尼拉水蛭酶樣品、歐洲醫(yī)蛭和牛睪丸透明質(zhì)酸酶用狗或大鼠檸檬酸化血漿稀釋至250U/ml的終濃度。然后，這三種溶液在-20℃、+4℃和37℃下溫育0-7天。在該實驗中包括用緩沖液稀釋的含相同透明質(zhì)酸酶的對照。最后，測定透明質(zhì)酸酶活性。
實施例21污染酶活性在水蛭透明質(zhì)酸酶純化過程的每一階段，都按照Twining S.S.(分析生物化學，1984，143，30-34)利用通用蛋白酶底物(BoehringerMannheim，目錄號1080 733)檢測制劑中能降解蛋白質(zhì)的其他酶。
實施例22肝素對透明質(zhì)酸酶活性的影響透明質(zhì)酸酶切割hyaluronan導致還原糖的釋放。釋放的糖的量通過改進的Park法(Park J.和Johnson M.；生物化學雜志1949，181，149)比色測定。為了確定肝素對馬尼拉水蛭酶和牛睪丸透明質(zhì)酸酶活性的影響，進行兩種活性測定一種在肝素存在下，第二種不含肝素。透明質(zhì)酸酶樣品25μl(3.2 WHO單位)與含有0-24單位肝素的25μl肝素(Liquemin，F(xiàn)a.Hoffmann LaRoche)溶液在37℃下溫育30分鐘。然后，加入50μl hyaluronan(2.5mg/ml)，在37℃下繼續(xù)溫育30分鐘。通過在100℃下加熱2分鐘終止反應(yīng)。然后，向滅活的消化液中加入100μl碳酸鹽-氰化物和100μl鐵氰酸鉀溶液。樣品在沸水浴中加熱15分鐘，然后在冰浴中冷卻。之后，向反應(yīng)混合液中加入0.75μl硫酸鐵銨溶液。在室溫下溫育15分鐘后，用Shimadzu分光光度計測量690nm的顯色。在每次試驗中包括合適的空白和無酶對照。對于所分析的樣品類型，用希望的還原糖(葡萄糖醛酸或N-乙酰-葡糖胺)作為標準。
實施例23馬尼拉水蛭酶的去糖基化利用PNGase F酶(BioLabs Art.No.701L)按照使用說明書使馬尼拉水蛭酶樣品去糖基化。去糖基化在變性和自然條件下進行。O-聚糖酶、神經(jīng)氨酸酶和神經(jīng)氨酸酶+O-聚糖酶處理根據(jù)Boehringer Mannheim標準要求進行。所有樣品都用SDS-PAGE和活性測定試驗表征。
實施例24大腸桿菌表達載體的構(gòu)建(圖11)為了在大腸桿菌中表達，我們使用一種修飾形式的質(zhì)粒pASK75，其攜帶tet啟動區(qū)。{Skerra，基因151，(1994)，131-135頁}。通過在XbaI與HindIII位點之間克隆一個新接頭進行修飾。該新接頭含有ompA前導序列、另一個多克隆位點和6×His尾代替strep-尾。
在pAsK75中克隆的接頭序列。Xbal119CTAGATAACG AGGGCAAAAA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTGTATTGC TCCCGTTTTT TACTTTTTCT GTCGATAGCG CTAACGTCAC CGTGACCGAC 179 GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GC AT CGA TGA ATT CGA GCT CGG TAC CCG GGGCAAAGCGATG GCATCGCGTC CG TA GCT ACT TAA GCT CGA GCC ATG GGC CCC 230ATC CCT CGA GGT CGA CCT GCA GGC AGC GCTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATAG GGA GCT CCA GCT GGA CGT CCG TCG CGATACTCTCCTAGCGTAGTGGTAGTGGT 286TCACTAATAGAAGTGATTATCTTCGA 為了構(gòu)建馬尼拉水蛭酶的表達載體，利用PCR方法導入5’ClaI和3’Ec047III限制位點是必要的。因此使用兩條引物5’ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC和5’GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CTPCR產(chǎn)物首先克隆到PCRII載體系統(tǒng)(Invitrogen)中并測序。
第二步，利用限制位點5’ClaI和3’Eco47III將馬尼拉水蛭酶基因克隆到修飾的pASK75載體中。
在第二次PCR反應(yīng)中表達并證明該重組馬尼拉水蛭酶的活性后，除去His尾，將馬尼拉水蛭酶基因的起始密碼子與ompA前導序列直接融合。該PCR反應(yīng)的引物是5’ACC GTA GCG CAG GCC AAA GAG ATT GCC GTG和3’CAC GGC AAT CTC TTT GGC CTG CGC TAC GGT。
實施例25Baculo供體質(zhì)粒的構(gòu)建(圖12)為了在Baculo病毒表達系統(tǒng)中表達馬尼拉水蛭酶，使用來自GibcoLife Technologies的Bac-To-BacTM桿狀病毒表達系統(tǒng)。為了得到分泌系統(tǒng)，將蜜蜂蜂毒肽前導序列與馬尼拉水蛭酶基因融合，并引入限制位點5’BamHI和3’KpnI。進行一次PCR反應(yīng)。
5’引物CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAA CGT TGC CCT TGTTTT TAT GGT CGT ATA CAT TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGAGAT TGC CGT GAC3’引物AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC將PCR產(chǎn)物克隆到PCRII載體(Invitrogen)中并測序。然后利用限制位點5’BamHI和3’KpnI將蜂毒肽-馬尼拉水蛭酶融合體克隆到pFastBac載體中(圖12)。
實施例26酵母表達載體的構(gòu)建(圖13)為了在酵母中表達，我們使用畢赤酵母(Pichia)多拷貝表達載體(Invitrogen)。為了構(gòu)建用于馬尼拉水蛭酶的表達系統(tǒng)，我們使用對馬尼拉水蛭酶基因的PCR擴增法，這樣產(chǎn)生相容的限制末端(5’EcoRI，3’NotI)，用于向合適的載體(pPIC9K)中連接。因此使用下列引物5’GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACA3’GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC在轉(zhuǎn)化畢赤酵母原生質(zhì)球之前，表達載體必須用SalI線性化。
實施例26在大腸桿菌中的表達用含有與ompA前導序列融合的sarastatin結(jié)構(gòu)基因的表達載體pRG72轉(zhuǎn)化W3110感受態(tài)細胞。細胞生長至對數(shù)中期，然后加入200μg aTC/l誘導啟動子。1小時后能清楚地檢測到重組馬尼拉水蛭酶。
實施例27重組桿狀病毒和馬尼拉水蛭酶的產(chǎn)生利用Bac-To-Bac表達系統(tǒng)的表達用供體質(zhì)粒pTD13轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，該細胞含有具有一個mini-attTn7靶位點的桿粒和輔助質(zhì)粒。供體質(zhì)粒上的mini-Tn7元件在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座蛋白存在下能轉(zhuǎn)座到桿粒上的mini-attTn7位點上。根據(jù)lacZ基因的破壞鑒定含有重組桿粒的集落。由選擇的含有重組桿粒的大腸桿菌克隆制備高分子量mini-prep DNA，然后用該DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。
在表達試劑盒說明手冊中能見到詳細敘述。
實施例28在酵母中的表達為了確定已經(jīng)整合馬尼拉水蛭酶基因，必須對His+Mut+-突變體篩查菌落。
用單菌落接種1升搖瓶中的100ml培養(yǎng)基。生長條件是28-30℃，250轉(zhuǎn)/分，可達OD 2-6。為了誘導表達，首先離心培養(yǎng)物，傾棄上清液，將細胞沉淀重懸浮于1/5原始培養(yǎng)體積的新培養(yǎng)基中。每24小時加入100％甲醇至0.5％的終濃度以保持誘導。最多6天后，通過SDS-PAGE和活性測定分析上清液。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>來源于馬尼拉水蛭的透明質(zhì)酸酶，分離、純化和重組生產(chǎn)方法<130>馬尼拉水蛭酶<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>488<212>PRT<213>水蛭<400>1Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser Val1 5 10 15Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro20 25 30Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys35 40 45Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe50 55 60Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp65 70 75 80Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr Arg85 90 95Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp100 105 110Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp115 120 125Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met Thr130 135 140Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val145 150 155 160Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro165 170 175Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp180 185 190Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys195 200 205Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val210 215 220Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu225 230 235 240His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu245 250 255Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys260 265 270Asp Val Leu Lys Asn Ser Gln His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly275 280 285Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg290 295 300Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala305 310 315 320Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr Tyr325 330 335Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu340 345 350Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp355 360 365Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys370 375 380Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr385 390 395 400Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys Ile Asp405 410 415Gln Tyr Gly Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu Gly420 425 430Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Lys435 440 445Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asn Glu Ser Lys Thr450 455 460Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp465 470 475 480Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys485<210>2<211>1464<212>DNA<213>水蛭<220><221>CDS<222>(1)..(1464)<220><221>變化<222>(667)..(669)<223>Xaa ＝ Tyr或Asn<400>2aaa gag att gcc gtg aca att gac gat aag aat gtg att gca tct gcc 48Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser Ala1 5 10 15agt ggg tct ttc ctt gga gtt gcc ttt gat gcg tct cta ttt tcg ccc 96Ser Gly Ser Phe Leu Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro20 25 30aag ggt ctt tgg agc ttt gtt gat att acc tct cca aaa ttg ttc aaa 144Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys35 40 45ttg ctg gaa gga ctt tct cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe50 55 60gcc aat tgg ctg ttt ttt gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aag gat 240Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp65 70 75 80tat tgg gct ttt aaa gac aaa acc ccc gaa act gcg aca ata aca agg 288Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr Arg85 90 95aga tgg ctg ttc aga aaa caa aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp100 105 110aat tta gtg aaa cta aca aag gga agc aag atg aga ttg tta ttc gat 384Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp115 120 125ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag atg aca 432Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met Thr130 135 140tcc act tgg gat tca tcg gag gct gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val145 150 155 160tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt gga aat gaa ccg 528Ser Lys Gly 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Gly Asn Xaa Ser Asp Val Ser Ile Tyr Leu245 250 255Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys260 265 270Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Glu Pro Leu Trp Leu Gly275 280 285Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Asp Arg290 295 300Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala305 310 315 320Asn Asn Val Lys Val Val Ile Arg Gln Thr Ile Tyr Asn Gly Tyr Tyr325 330 335Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu340 345 350Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp355 360 365Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys370 375 380Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr385 390 395 400Ile Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Gly Asp Val Thr Leu Lys Ile Gly405 410 415Gln Tyr Ser Gly Lys Lys Ile Tyr Ser Tyr Ile Leu Thr Pro Glu Gly420 425 430Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn435 440 445Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu 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1.一種從水蛭種馬尼拉水蛭中分離的純化的蛋白質(zhì)，其具有透明質(zhì)酸酶的生物活性，其活性不受肝素影響，其特征在于根據(jù)糖基化其分子量為53-60。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的糖基化蛋白質(zhì)，其分子量為58(±2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的非糖基化蛋白質(zhì)，其分子量為54(±2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的蛋白質(zhì)，其等電點為7.2-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的蛋白質(zhì)，其具有圖7和SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的蛋白質(zhì)，其酶比活＞100kU/mg蛋白質(zhì)。
7.一種分離并純化如權(quán)利要求1-6所述蛋白質(zhì)的方法，其包括下列步驟(i)用酸性緩沖液勻漿馬尼拉水蛭種的水蛭的頭和離心，(ii)硫酸銨沉淀步驟(i)的上清液，(iii)陽離子交換層析，(iv)伴刀豆球蛋白A親和層析，(v)疏水作用層析，(vi)在用透明質(zhì)酸片段包被的基質(zhì)上親和層析，(vii)凝膠滲透層析，和任選地，(viii)純化蛋白質(zhì)的酶促或化學去糖基化。
8.一種具有透明質(zhì)酸酶生物活性的蛋白質(zhì)，其活性不受肝素影響，根據(jù)糖基化其分子量為53-60，可通過權(quán)利要求7的步驟獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其酶比活＞100kU/mg蛋白質(zhì)。
10.一種編碼權(quán)利要求1和9的蛋白質(zhì)的DNA序列。
11.一種編碼權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)的DNA序列，其含有圖8(SEQ IDNo.2)、圖9(SEQ ID No.4)和圖10(SEQ ID No.6)所示的任一核苷酸序列。
12.一種重組蛋白，其具有透明質(zhì)酸酶生物活性，由權(quán)利要求11的任一DNA序列編碼。
13.一種重組蛋白，其具有透明質(zhì)酸酶生物活性，根據(jù)糖基化其分子量為55-59，含有圖8、9和10(SEQ ID No.3、5、7)所示的任一氨基酸序列或與該序列至少80％同源的序列。
14.含有權(quán)利要求10或11的DNA序列的一種表達載體。
15.用權(quán)利要求14的載體轉(zhuǎn)化的一種適于表達權(quán)利要求12或13的蛋白質(zhì)的宿主細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-6、8、9、12和13任一項的一種蛋白質(zhì)，作為一種藥物。
17.一種藥用組合物，其含有權(quán)利要求16的蛋白質(zhì)和藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
18.一種藥用組合物，其還含有一種藥理活性化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的一種藥用組合物，其中藥理活性化合物是肝素。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-6、8、9、12和13任一項的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)可治療心肌、心血管和血栓疾病和腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于熱帶水蛭馬尼拉水蛭(Hirudinariamanillensis)的新型透明質(zhì)酸酶的分離、純化和表征。因此,根據(jù)本發(fā)明,這種新酶被稱為“馬尼拉水蛭酶(manillase)”。本發(fā)明還涉及馬尼拉水蛭酶的重組生產(chǎn)方法,包括DNA和氨基酸序列以及表達載體和宿主系統(tǒng)的公開。最后,本發(fā)明涉及馬尼拉水蛭酶用于治療目的的用途,例如,用于治療心肌疾病、血栓事件和腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK1355850SQ00808873
公開日2002年6月26日 申請日期2000年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月12日
發(fā)明者M·科多維茨, D·古索, U·霍夫曼, T·帕庫茨卡, A·加達斯 申請人:默克專利股份有限公司