專利名稱：氧化胸腺素β4的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從類固醇處理過(guò)的單核細(xì)胞中分離出來(lái)的肽因子。尤其是，本發(fā)明涉及用于替代類固醇治療的肽因子。
類固醇被有效地用于抗炎癥性疾病，例如哮喘、濕疹、過(guò)敏反應(yīng)和風(fēng)濕性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。然而，類固醇具有嚴(yán)重的副作用，因而僅在非類固醇抗炎藥物不能奏效的情況下使用。
單核細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。除了其在炎癥部位的抗原呈遞和吞噬活性外，外周血單核細(xì)胞還參與多種與調(diào)節(jié)嗜中性白細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的炎性酶原和多肽細(xì)胞因子的合成和釋放。這些成分的產(chǎn)生可被糖皮質(zhì)激素抑制，因此，認(rèn)為這即是糖皮質(zhì)激素抗炎反應(yīng)的基礎(chǔ)。
關(guān)注類固醇誘導(dǎo)的因子對(duì)嗜中性白細(xì)胞遷移的影響，最初是為了闡明抗炎機(jī)制。皮質(zhì)類固醇使許多前炎癥介質(zhì)下調(diào)(Lew等，1988；Almawi等1991:Standford等1992)，而有些作用則可以解釋為使抗炎介質(zhì)上調(diào)。
嗜中性白細(xì)胞遷移刺激類固醇誘導(dǎo)的因子的活性，提示分散移動(dòng)旨在防止細(xì)胞聚集在一個(gè)部位，而這對(duì)于終止炎癥反應(yīng)是很重要的。
Stevenson(1973,1974,1978)證實(shí)人單核細(xì)胞在與抗炎皮質(zhì)類固醇一起孵育時(shí)釋放蛋白酶敏感因子，后者增加嗜中性白細(xì)胞從短毛細(xì)管中的細(xì)胞團(tuán)遷移。
后來(lái)的研究證實(shí)，用采集自接受類固醇治療的患者的白細(xì)胞也觀察到刺激嗜中性白細(xì)胞遷移的現(xiàn)象。
最近，Chettibi等(1993,1994)使用能夠研究細(xì)胞在蛋白包被的玻璃蓋玻片上遷移過(guò)程的自動(dòng)細(xì)胞跟蹤分析法研究了類固醇誘導(dǎo)的對(duì)嗜中性白細(xì)胞遷移行為的刺激作用。這些研究是如下測(cè)定的1．類固醇-處理的單核細(xì)胞上清液(STMS)使得人嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)速度顯著增加，而使人嗜中性白細(xì)胞對(duì)蛋白包被的玻片的粘附顯著下降。相反，對(duì)照單核細(xì)胞上清液對(duì)嗜中性白細(xì)胞的移動(dòng)速度影響較小，但是粘附性大大增加。
2．在有或沒(méi)有血清的條件下，37℃與10-6M地塞米松孵育24 h后制得的上清液的活性相同。
3．類固醇-處理的單核細(xì)胞上清液對(duì)人外周血嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)速度的作用不受兔抗脂蛋白1-6多克隆抗血清的影響。
4．能夠阻斷IL-8對(duì)人嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)速度作用的兔抗白介素-8抗體，并不能拮抗類固醇-處理的單核細(xì)胞上清液的移動(dòng)刺激作用。
5．人單核白細(xì)胞胞外釋放的因子提示它可能是糖皮質(zhì)激素體內(nèi)抗炎作用的介質(zhì)。
然而，尚未揭示STMS中該活性物質(zhì)到底是什么。
HuffT．等(1995)和Heintz D．等(1994)描述涉及β-胸腺素的研究，和生物分子絡(luò)合物中β-胸腺素如何與G-肌動(dòng)蛋白相互作用及抑制F-肌動(dòng)蛋白在高鹽條件下的聚合。氧化形式的胸腺素β4是作為抑制肌動(dòng)蛋白聚合反應(yīng)而被披露的，然而，其抑制作用只是在高于胸腺素β4 20倍的濃度時(shí)才會(huì)出現(xiàn)。沒(méi)有文獻(xiàn)推斷氧化胸腺素β4的任何醫(yī)療作用。事實(shí)上，文章似乎教導(dǎo)人們不要去考慮氧化胸腺素β4的積極作用。
US5578570(Goldstein等)公開了施用胸腺素β4治療感染性休克的方法。然而，其中沒(méi)有披露氧化胸腺素β4，也沒(méi)有提示氧化胸腺素β4具有治療感染性休克的作用。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供類固醇治療的替代療法。
本發(fā)明部分基于本發(fā)明者的觀察與嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)有關(guān)的因子是氧化形式的胸腺素β4。
本發(fā)明首先是提供氧化胸腺素β4或其生理活性變體在治療中的應(yīng)用。
代表性的氧化胸腺素β4是胸腺素β4的一種，胸腺素β4中的一個(gè)蛋氨酸殘基(距N-末端6個(gè)氨基酸)(Met6)被氧化，從而該殘基轉(zhuǎn)化為硫氧蛋氨酸。而且，蛋氨酸殘基(Met6)可進(jìn)一步氧化為砜蛋氨酸，后一形式也包括在本發(fā)明之內(nèi)。還可涉及(evisaged)蛋氨酸殘基的其它修飾，如硫與金屬絡(luò)合，從而產(chǎn)生類似于本文描述的氧化胸腺素β4的活性形式的胸腺素β4。
氧化胸腺素β4可以通過(guò)天然胸腺素β4在氧化條件下反應(yīng)而獲得，例如，與過(guò)氧化氫反應(yīng)形成氧化胸腺素β4。這樣，首先得到天然胸腺素β4，然后將其氧化成氧化形式。
已經(jīng)觀察到，天然胸腺素β4含有認(rèn)為是自動(dòng)氧化結(jié)果的少量如10％氧化胸腺素β4。然而，本發(fā)明者首先將此氧化形式胸腺素β4與生理活性聯(lián)系起來(lái)。因此，總體上講，本發(fā)明提供純化的氧化胸腺素β4的應(yīng)用。具有代表性地，本發(fā)明提供含有占?xì)埢囱趸叵偎卅?至少30％，優(yōu)選60％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％的純化氧化胸腺素β4的制劑的應(yīng)用。然而，氧化胸腺素β4制劑優(yōu)選地含有大體上全部是氧化胸腺素β4(即，基本上不含有未氧化胸腺素β4)。
氧化或未氧化胸腺素β4可以從任何適宜來(lái)源獲得，例如，由類固醇處理的單核細(xì)胞中得到。此外，胸腺素β4可以來(lái)自任何適宜種屬，但是通常來(lái)源于哺乳動(dòng)物，如牛、馬、鼠和人。注意到牛、馬、鼠、大鼠和人胸腺素β4在序列上完全相同。因此，例如，牛胸腺素β4可以作為胸腺素β4的適宜來(lái)源以便進(jìn)一步氧化并施用于其它種屬如人。
氧化胸腺素β4的生理活性變體理解為那些顯示出氧化胸腺素β4相同或相似生理特性的變體。含有氧化氮氨酸的變體是優(yōu)選的，但是變體可以是截短的、缺失的或變異的形式。
應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本文所涵蓋的特定氧化胸腺素β4而言，可以存在變異體(天然或其它)。通過(guò)全序列氨基酸差異或通過(guò)所述序列中氨基酸缺失、取代、插入、反轉(zhuǎn)或增加可以證實(shí)這些變異體。只要變異體具有生理活性(即，顯示出本文所定義的氧化胸腺素β4的活性)，那么所有這些變異體均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，為達(dá)到本發(fā)明目的，可以在下列組的氨基酸之間進(jìn)行保守替換(Ⅰ) 丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；(Ⅱ)谷氨酸和天冬氨酸；(Ⅲ)精氨酸和賴氨酸；(Ⅳ)天冬酰胺和谷胺酰胺；
(Ⅴ)異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸；(Ⅵ)苯丙酰胺、酪氨酸和色氨酸；(Ⅶ)蛋氨酸和其它蛋氨酸同系物；(Ⅷ)蛋氨酸和硫被ⅥB組元素(如，硒、碲、釙)取代的其它蛋氨酸同系物。
(Ⅸ)氧化蛋氨酸和其它氧化蛋氨酸同系物(如，ⅥB組同系物，硫氧蛋氨酸)(Ⅹ)蛋氨酸和包括含硫氨基酸(如，半胱氨酸)氧化同系物在內(nèi)的其它含硫氨基酸。
早期分子模型研究提示，蛋氨酸殘基(met-6)在肽的三個(gè)螺旋之一的項(xiàng)部。分子模型應(yīng)當(dāng)有助于確定那些可能具有觀測(cè)到的STMS和氧化胸腺素β4活性并且將是用于制備具有抗炎活性藥物的優(yōu)選分子的短肽。
的確，這將有助于開發(fā)具有氧化胸腺素β4相同生理功能的肽模擬物。
另外，通過(guò)利用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾(如乙酰化)或使用D氨基酸來(lái)增加氧化胸腺素β4或其生理活性變體的半衰期是可能的。
分離的氧化胸腺素β4可以具有封閉的N-末端。
本發(fā)明也提供合成的氧化胸腺素β4，其中含有氧化胸腺素β4或其生理活性變體的肽序列。
如上所述，合成的氧化胸腺素β4可以被修飾和/或被氨基酸取代，只要其仍保留生理活性即可。例如，可以引入硒基蛋氨酸來(lái)代替蛋氨酸并以同樣的方式氧化。
本發(fā)明進(jìn)一步提供本文描述的氧化肽在制備治療慢性或急性炎性病癥的藥物中的應(yīng)用。該炎性病癥包括炎性關(guān)節(jié)病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、結(jié)晶性(crystal)關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、感染性關(guān)節(jié)炎、Ouvenile慢性關(guān)節(jié)炎；結(jié)締組織病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫氏綜合征、多肌痛風(fēng)濕、顱動(dòng)脈炎；結(jié)節(jié)性綜合征，如韋格內(nèi)氏肉芽腫病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、Churg Strauss綜合征；呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病、纖維性小泡炎、過(guò)敏性肺炎、肉樣瘤病、變應(yīng)性曲霉病、起因不明的肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、毛細(xì)支氣管炎閉塞性組織性肺炎；皮膚病，如炎癥性皮炎包括牛皮癬、濕疹、蕁麻疹；胃腸道疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎、克隆病、狼瘡性肝炎；血液病，如溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤/白血病；移植術(shù)/修復(fù)術(shù)，如移植排斥，對(duì)宿主疾病的移植，與植入假體的組織反應(yīng)；以及感染，如結(jié)核、瘧疾、卡氏肺囊蟲肺炎、麻風(fēng)。
此外，氧化胸腺素β4可以與其它藥物聯(lián)合給藥，例如細(xì)胞因子如具有可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)副作用的干擾素進(jìn)行聯(lián)合。因此，一方面，氧化胸腺素β4可以作為減少或降低以不適當(dāng)?shù)难装Y為特征的生理或疾病狀態(tài)。
另外，應(yīng)當(dāng)理解上述氧化胸腺素β4的應(yīng)用不僅僅用于人類病癥。所以，氧化胸腺素β4可以用于治療患有上述類似病癥的動(dòng)物如貓、狗、馬、牛、羊、豬和山羊。
本發(fā)明進(jìn)一步提供氧化胸腺素β4在制備治療感染性休克的藥物中的應(yīng)用。通常，氧化胸腺素β4呈上述的提純形式。
本發(fā)明還提供含有本文所述氧化胸腺素β4的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供具有能夠編碼本文所述胸腺素β4的核苷酸分子序列在為后續(xù)制備氧化胸腺素β4中的應(yīng)用。
本發(fā)明特別實(shí)施方案中，提供含有核苷酸分子的載體在制備氧化胸腺素β4和本文所述的截短、缺失或變異形式的氧化胸腺素β4中的應(yīng)用。
另外，本發(fā)明提供含有核苷酸分子的載體在制備含有氧化胸腺素β4和其截短、缺失或變異形式用于治療炎癥性病癥的藥物中的應(yīng)用。
用本文所述氧化胸腺素β4代替類固醇治療，將減輕那些通常與使用類固醇有關(guān)的副作用。
氧化胸腺素β4可用于治療那些為避免類固醇副作用而在目前使用非類固醇抗炎藥物的病人。
使用高度純化的氧化胸腺素β4，或者使用合成的或表達(dá)的胸腺素β4然后進(jìn)行氧化而得到的氧化胸腺素β4，是安全可靠的，因?yàn)楫?dāng)把它施用于機(jī)體后，它通常不是機(jī)體的異物。
可以施用精確的量。
誠(chéng)然，有效治療所需的氧化胸腺素β4的量是不同的，而且最終任憑醫(yī)師或獸醫(yī)處理。應(yīng)當(dāng)考慮的因素包括治療的病癥，給藥途徑和制劑的性質(zhì)，接受治療者的體重、表面積、年齡和體質(zhì)，以及所施用的特定化合物。適宜的有效劑量范圍為約0.001～約120mg/kg體重，例如，0.01～約120 mg/kg體重，優(yōu)選范圍為約0.01～約50mg/kg，如0.05～20mg/kg。每日總劑量，可以按單次劑量給藥或按多次劑量如每日2到6次給藥，或者按照選定的期間經(jīng)靜脈注射方式施用。例如，對(duì)于一個(gè)75kg雄性哺乳動(dòng)物(例如，人)，劑量范圍可以是每日約8～9000mg，代表劑量可以是每日約50mg。如果指明用分散的多劑量給藥方式，那么有代表性的治療可能是氧化胸腺素β4 15mg，每日4次。
盡管將活性化合物單獨(dú)給藥是可能的，但是，優(yōu)選將本發(fā)明活性化合物以藥物制劑形式給藥。本發(fā)明制劑，用于醫(yī)療的目的，包括氧化胸腺素β4或其鹽與一種或多種可藥用載體和任選的其它治療成分在一起。載體應(yīng)當(dāng)是可藥用的，為的是與制劑的其它成分相容并且對(duì)受治療者沒(méi)有損害作用。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供含有氧化胸腺素β4或其可藥用鹽或其生理功能衍生物與可藥用載體在一起的藥物制劑。
本發(fā)明還提供制備藥物制劑的方法，所述藥物制劑含有生成的有關(guān)氧化胸腺素β4或其可藥用鹽或其生理功能衍生物和其可藥用載體。
本發(fā)明制劑包括biolistic如Powderject給藥在內(nèi)的適宜于口服、鼻腔、局部、陰道、直腸或非腸道(包括皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))給藥的那些劑型。優(yōu)選的制劑是那些適宜于口服、局部用或非腸道給藥的劑型。
制劑可以方便地呈單位劑量規(guī)格并使用藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備。所有方法均包括將活性化合物與載體相摻合的步驟，所述載體組成一種或多種輔料。通常，制劑是這樣制備的將活性化合物均勻和緊密地與液態(tài)載體或微細(xì)粉碎的固體載體或者液態(tài)與固體兩種載體進(jìn)行摻合，然后，如果必要，將產(chǎn)品制成所需形狀制劑。
適宜口服給藥的本發(fā)明制劑，可以是分散單位規(guī)格如膠囊、扁囊劑、片劑、錠劑，活性成分包含在調(diào)味基中，調(diào)味基通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；潤(rùn)喉糖錠，活性成分含在惰性基如明膠、甘油、蔗糖或阿拉伯膠中；漱口液，活性成分含在適宜的液體載體中。每種制劑一般含有預(yù)定劑量的活性化合物；粉末或顆粒形式；或者在含水或不含水液體中的溶液或懸浮液形式，如糖漿劑、酏劑或飲劑等。
片劑，通過(guò)壓片或模制而制得，任選地與一種或多種輔料一起壓片或模制。壓片，在適宜機(jī)器中通過(guò)壓制自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)的活性化合物來(lái)制備，任選地與粘合劑(如，聚乙烯吡咯酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如，羥乙酸淀粉鈉，交聯(lián)的聚乙烯吡咯酮，交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑混合。模制片，在適宜機(jī)器中把用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀化合物模塑來(lái)制備?？梢匀芜x地將片劑包衣或刻痕，以及可以制成能夠提供緩慢或控制釋放活性成分的片劑，例如，使用不同比例的羥丙基甲基纖維素以提供所需的釋放模式。
糖漿劑，將活性化合物加入到濃縮的糖水溶液中而制得，如蔗糖溶液，還應(yīng)當(dāng)向蔗糖溶液中加入任何輔料。所述輔料包括調(diào)味劑、阻止糖結(jié)晶的試劑或增加任何其它成分溶解性的組分，例如聚多元醇(如甘油或山梨醇)。
直腸給藥的制劑，可以是與適宜載體(如，椰子油)一起制成的栓劑。
適宜非腸道給藥的制劑，通常為含有活性化合物的最好與接受治療者的血液等滲的無(wú)菌含水制劑。該非腸道制劑適宜含有與受治療者血液等滲的藥學(xué)上和藥理學(xué)上可接受的氧化胸腺素β4鹽溶液。
適宜的制劑也包括含有氧化胸腺素β4的濃縮溶液或固體，將濃縮溶液或固體用適當(dāng)溶劑稀釋后即可得到上述非腸道給藥用溶液。
本文公開的氧化胸腺素β4或其生理活性變體，可以通過(guò)任何適宜方式施用于受治療者的肺部，但是優(yōu)選通過(guò)產(chǎn)生由可吸入微粒組成的氣霧劑的方式給藥，所述可吸入微粒由活性化合物組成，受治療者吸入這些微粒(即，吸入給藥)。可吸入顆?？梢允且簯B(tài)的，也可以是固態(tài)的。
用于本發(fā)明的氧化胸腺素β4組成的微粒，應(yīng)當(dāng)包括可吸入大小的微粒，這就是，微粒要足夠小以便吸入時(shí)通過(guò)口腔和咽喉并進(jìn)入支氣管和肺的肺泡。通常，約0.5～10微米(尤其是小于約5微米)大小的微粒是可吸入的。氣霧劑中非吸入大小的微粒將會(huì)沉積在咽喉部并被吞咽下去，優(yōu)選將氣霧劑中的非吸入微粒的量減至最小。對(duì)于鼻內(nèi)投藥，優(yōu)選微粒大小范圍在10-500μm以確保滯留在鼻腔。
用于產(chǎn)生氣霧劑的液體藥物組合物或氧化胸腺素β4，可以通過(guò)將氧化胸腺素β4與適宜載體結(jié)合來(lái)制備，所述載體例如無(wú)菌的無(wú)致熱原水。含有可吸入的微?；趸叵偎卅?干微粒的固體微粒組合物，可以通過(guò)使用臼和杵將干燥的氧化胸腺素β4研磨來(lái)制備，然后將微?；慕M合物過(guò)400目篩以破碎或分離出較大團(tuán)塊。含有氧化胸腺素β4的固體微粒組合物，可以任選地含有作為促進(jìn)氣霧劑形成的分散劑。適宜的分散劑是乳糖，乳糖可以與氧化胸腺素β4以任何適宜比例(如，以1∶1的重量比)混合。
含有氧化胸腺素β4的液態(tài)微粒氣霧劑，可以通過(guò)任何適宜方式來(lái)制備，例如噴霧器。參見(jiàn)例如美國(guó)專利4501729號(hào)。噴霧器是由市售途徑可以得到的裝置，它通過(guò)加速壓縮氣體(代表性地是空氣或氧氣)通過(guò)狹窄的文氏口(Venturi rifice)或者通過(guò)超聲振蕩而將氧化胸腺素β4的溶液或懸浮液轉(zhuǎn)化為治療氣霧劑煙霧。用于噴霧器的適宜組合物由液體載體中的氧化胸腺素β4組成，氧化胸腺素β4在組合物中所占比例可高達(dá)40％w/w，但是，優(yōu)選小于20％w/w，代表性載體是水或稀釋的含水醇溶液，優(yōu)選地，通過(guò)加入例如氯化鈉而制成與機(jī)體體液等滲。如果組合物不是無(wú)菌制備的話，任選的添加劑包括防腐劑如羥基苯甲酸甲酯，抗氧劑、調(diào)味劑、揮發(fā)油、緩沖劑和表面活性劑。
類似地，含有氧化胸腺素β4的固體微粒氣霧劑，可以使用固體微粒醫(yī)藥氣霧劑發(fā)生器來(lái)制備。在把固體微粒藥物對(duì)受治療者給藥的氣霧劑發(fā)生器中產(chǎn)生如上面所解釋的可吸入微粒，并且按照適宜人給藥的速度產(chǎn)生一定體積的含有用計(jì)量器計(jì)量的預(yù)定劑量藥物的氣霧。
對(duì)于外周組織(如皮膚)感染，制劑優(yōu)選是含有活性成分的局部用軟膏或霜，其中活性成分的量是，例如0.075～20％w/w，優(yōu)選0.2～15％w/w，更優(yōu)選0.5～10％w/w。當(dāng)制成軟膏時(shí)，活性成分可以使用石蠟基或水混溶性軟膏基?；蛘撸瞥苫钚猿煞趾谒退械乃?jiǎng)?br> 如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30％w/w的多元醇，即含有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醇，如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它們的混合物。局部用制劑可以根據(jù)需要而含有增加活性成分經(jīng)皮膚或其它受累及區(qū)域吸收和穿透力的的化合物。此類透皮增強(qiáng)劑的實(shí)例包括二甲基硫氧(dimethylsulphoxide)和相關(guān)的同系物。
本發(fā)明乳劑的油相可以用已知方式由已知成分組成。盡管油相可以僅含有一種乳化劑，但是，期望含有至少一種乳化劑與脂或油或者與脂、油二者的混合物。優(yōu)選地，同時(shí)含有親水乳化劑與起穩(wěn)定劑作用的親脂乳化劑。也優(yōu)選同時(shí)包括油和脂。乳化劑(一個(gè)或多個(gè))一起或與穩(wěn)定劑一起構(gòu)成所謂的乳化蠟，而蠟與油和/或脂一起構(gòu)成所謂的乳化軟膏基，軟膏基形成霜制劑的油性分散相。
適用于本發(fā)明制劑的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑包括吐溫60、司盤80、鯨蠟硬脂醇、肉豆蔻醇、甘油一硬脂和十二烷基硫酸鈉。
為制劑選擇適宜油或脂是基于達(dá)到所需的潤(rùn)膚特性而定的，因?yàn)榛钚曰衔镌诳赡軙?huì)在藥物乳液制劑中使用的大多數(shù)油中的溶解度是非常低的。因此，優(yōu)選地，霜應(yīng)當(dāng)是不油膩、不染色和可清洗的產(chǎn)品，并且具有適宜的粘稠度以避免從管或其它容器中滲漏。可以使用直鏈或支鏈單-或雙烷基酯如二-isoadipate、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆寇酸異丙酯、油酸癸基酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯或稱作Crodamol CAP的支鏈酯混合物。優(yōu)選的酯是硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己基酯、稱作Crodamol CAP的支鏈酯混合物。根據(jù)所需的特性，可以單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用這些酯?；蛘撸梢允褂酶呷埸c(diǎn)酯如軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
除了上述提到的組分之外，本發(fā)明制劑可以進(jìn)一步包括一種或多種輔料，所述輔料選自稀釋劑、緩沖劑、調(diào)味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑(包括抗氧劑)等。
下面的實(shí)施例描述肽因子的純化及部分純化因子和類固醇-處理的單核細(xì)胞上清液的特性。后面的實(shí)施例描述按氧化胸腺素提純的因子的特性和氧化胸腺素β4的活性。
結(jié)合附圖描述實(shí)施例，其中

圖1描述STMS對(duì)人嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)的作用。使用微機(jī)化示蹤分析法跟蹤細(xì)胞2分鐘。按照5秒的間歇進(jìn)行測(cè)定，細(xì)胞速度平均值為15.2μm/分，外推擴(kuò)散系數(shù)和存留時(shí)間分別為1.02μm2/秒和63秒。
圖2描述37℃培養(yǎng)24小時(shí)的人單核細(xì)胞上清液在有或沒(méi)有10-6M地塞米松存在時(shí)對(duì)人嗜中性白細(xì)胞對(duì)于牛主動(dòng)脈單層內(nèi)皮細(xì)胞粘附作用的影響。(a)培養(yǎng)基中不含地塞咪松；(b)培養(yǎng)基中含有10-6M地塞咪松；(c)對(duì)照單核細(xì)胞上清液(CMS)；(d)類固醇處理的單核細(xì)胞上清液(STMS)。均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(垂直棒)，n=3。p＜0.001用**表示。
圖3描述使用掃描電子顯微鏡對(duì)用STMS和不同嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)刺激劑處理后的人嗜中性白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行的比較。(a)10-8M fMLP；(b)IL-8和(c)STMS。棒2μm。
圖4描述使用掃描電子顯微鏡對(duì)用STMS和不同嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)刺激劑處理并接種在牛主動(dòng)脈單層內(nèi)皮細(xì)胞上的人嗜中性白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行的比較。(a)10-8M fMLP；(b)STMS。棒2μm。
圖5描述用STMS和不同嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)刺激劑處理后的人嗜中性白細(xì)胞內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白分布的比較。(a)培養(yǎng)基含有和不含有10-6M地塞咪松；(b)10-8MfMLP；(c)TNF；(d)STMS。棒2μm。
圖6描述使用改良的Boyden室分析法測(cè)得的STMS對(duì)fMLP-誘導(dǎo)的人中性粒趨化的抑制。(a)上室一培養(yǎng)基含有地塞咪松；下室-10-8M fMLP；(b)上室-STMS；下室-10-8M fMLP；(c)上室-10-8M fMLP；下室-10-8M fMLP；(d)上室-培養(yǎng)基含有地塞咪松；下室-STMS。計(jì)數(shù)那些遷移距離達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照(a)的平均遷移距離一半的細(xì)胞數(shù)?！跫?xì)胞-前遷移距離。對(duì)于每一濾膜隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)值用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(垂直棒)表示。p＜0.001用**表示。
圖7表示肽1的數(shù)據(jù)，顯示出觀察到的用SPA衍化后低-能CID的離子序列。鍵Coff Collision offset(伏特)；Xle亮氨酸(Leu)或異亮氨酸(Ile)；Kpy亮氨酸ε-N-(3-吡啶基)醋酸酯；Mso硫氧蛋氨酸；和*代表在CID譜中觀察到的離子。
圖8a-c描述(a)嗜中性白細(xì)胞對(duì)胸腺素β4(Tβ4)和氧化胸腺素β4(Tβ4so)反應(yīng)而發(fā)生的分散移動(dòng)；(b)在改良的Boyden室中，fMLP誘導(dǎo)的人嗜中性白細(xì)胞趨化被Tβ4so抑制的程度大于未修飾肽。觀察到Tβ4和Tβ4so抑制趨化的劑量依賴效應(yīng)，氧化肽的抑制作用是天然肽的10倍；(c)在樣本刮痕分析中硫氧胸腺素β4促進(jìn)傷口愈合。證明蛋氨酸殘基(met 6)的氧化增加刮痕愈合速度，刮痕是在組織培養(yǎng)塑膜上的單層內(nèi)皮細(xì)胞上制造的。
圖9a-9c顯示在角叉菜膠誘導(dǎo)的水腫實(shí)驗(yàn)中Tβ4和Tβ4so的測(cè)定結(jié)果。
實(shí)施例材料與方法試劑IL-8和TNF購(gòu)自Genzyme，溶解于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)并以1μg/ml貯存于-70℃。地塞米松和fMLP購(gòu)自Sigma化學(xué)公司。用乙醇配制10-2M的地塞米松貯液，用二甲亞砜(DMSO)配制10-2M的fMLP貯液。嗜中性白細(xì)胞純化按照Chettibi等描述的方法獲取嗜中性白細(xì)胞。簡(jiǎn)要講，全血樣本與5％葡聚糖1∶1 v/v混合，于37℃沉降1小時(shí)。此富含白細(xì)胞血漿經(jīng)Nycoprep 1.077分層并用750 g離心15分鐘。用低滲溶解法除去離心沉淀中的紅細(xì)胞，平衡鹽溶液(BSS)洗滌嗜中性白細(xì)胞兩遍。用臺(tái)盤蘭排除法檢測(cè)細(xì)胞活力(一般大于96％)。細(xì)胞跟蹤分析按照前述文獻(xiàn)[Chettibi等，1993]描述的方法制作自動(dòng)細(xì)胞跟蹤遷移室，將該遷移室放置在控溫(37℃)透明箱中的倒置相差顯微鏡的平臺(tái)上，通過(guò)與黑白監(jiān)視器以及與配有Watford數(shù)字轉(zhuǎn)換器的Acorn A5000計(jì)算機(jī)連接的電視攝相機(jī)來(lái)觀察移動(dòng)，所述數(shù)字轉(zhuǎn)化器已被編程以便每5秒鐘捕獲和分析信息圖像一次。從最多80個(gè)精選細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)用于計(jì)算瞬時(shí)速度、2-二維擴(kuò)散系數(shù)和移動(dòng)停留時(shí)間，使用文獻(xiàn)描述的程序消除系統(tǒng)漂移的影響[Chettibi等，1994]。粘附測(cè)定在直徑13mm玻璃蓋玻片的多孔盤中的Dulbecco’s改良的Eagles培養(yǎng)基中培養(yǎng)并融合牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)基含有10％胎小牛和10％馬血清。通過(guò)將懸浮于BSS 0.1％牛血清蛋白(BSA)中的人嗜中性白細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml與鉻酸鈉[51Cr]培養(yǎng)1小時(shí)，20μCi/ml定期攪拌，而將嗜中性白細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。用BSS 0.1％BSA洗滌三次以除去游離的51Cr。200μl嗜中性白細(xì)胞與800μl STMS肽因子或其它測(cè)試物質(zhì)混合，加到孔中，于37℃孵育10分鐘。用BSS 0.1％BSA輕輕洗滌三次除去未-附著細(xì)胞，將蓋玻片放進(jìn)Wiljγ計(jì)數(shù)儀中。電子顯微鏡用各種激動(dòng)劑刺激嗜中性白細(xì)胞20分鐘，然后在2％緩沖的gluteraldehyde中固定1小時(shí)并用PBS洗滌兩次。在四氧化鋨中進(jìn)行后-固定后，蒸餾水洗滌。接著向樣本中加入醋酸雙氧鈾并在暗處停放至少1小時(shí)，然后再用水洗滌。細(xì)胞通過(guò)30％至純干品范圍的梯度丙酮(或乙醇)，然后臨界點(diǎn)干燥并封固。
可供選擇的替代臨界點(diǎn)干燥的方法是冷凍干燥。使用冷凍干燥時(shí)，在已將四氧化鋨從細(xì)胞洗滌后，將細(xì)胞投進(jìn)液氮(僅適用于粘著在固體物質(zhì)上的細(xì)胞)。之后，標(biāo)本在金中包埋并使用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行觀察。肌動(dòng)蛋白染色和共焦顯微鏡將純化的嗜中性白細(xì)胞放在白蛋白-包被的玻璃蓋玻片上，然后用各種刺激物處理并于37℃孵育30分鐘。室溫下，細(xì)胞在1％低聚甲醛溶液中固定30分鐘，用BSS洗滌，用1％Triton x-100通透(permeabilised)15分鐘。室溫下，細(xì)胞用BSS中洗滌三次并用標(biāo)記毒傘素(phalloidin)的0.1mg/ml TRITC處理20分鐘。以5分鐘的間隔在BSS中洗滌細(xì)胞3次，用50％甘油將細(xì)胞封固在玻片上。使用共焦顯微鏡分析結(jié)果。趨化實(shí)驗(yàn)切下濾膜(Sartorius膜濾器3μm孔)并膠接改良的1ml注射針筒。300μl2×106/ml嗜中性白細(xì)胞中加入300μl拮抗劑，200μl懸浮液加入到上室(注射針筒)。下室(5ml燒杯)含有3.6ml激動(dòng)劑。45分鐘后，在70％乙醇中固定細(xì)胞5分鐘。還要通過(guò)溶解膠而將濾膜從注射針筒中取出。濾膜放在多孔盤中，并進(jìn)行如下處理蒸餾水2分鐘，Harris蘇木精1分鐘，蒸餾水1分鐘，Scotts自來(lái)水(0.7％碳酸氫鈉4％硫酸鎂，1∶1(v/v))5分鐘，70％乙醇3分鐘，95％乙醇3分鐘和80％∶20％的乙醇∶丁醇(v/v)5分鐘。在二甲苯中清洗濾膜5分鐘，然后將濾膜封固在DEPEX上，于40倍接物鏡的明場(chǎng)照明下檢測(cè)。每一濾膜中隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。刮傷實(shí)驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在多孔盤(Coming)上生長(zhǎng)并融合，用無(wú)菌吸管尖橫跨每一孔的直徑制造刮痕。在加入Tβ4或Tβ4so之前(約1mm)和之后測(cè)量所制作的傷口，間隔為45分鐘。誘導(dǎo)對(duì)角叉菜膠的炎癥反應(yīng)在各組小鼠的一只后爪皮下注射300μg角叉菜膠與胸腺素β4(天然或硫氧化的)的混合物，終體積為50μl。對(duì)照動(dòng)物注射相同體積的生理鹽水。使用彈簧刻度卡尺測(cè)量腳掌腫脹程度，并用注射角叉菜膠爪與未注射、對(duì)照對(duì)面爪的腫脹差表示。用同樣劑量的胸腺素β4(天然或硫氧化的)給動(dòng)物腹腔注射(i.p)，于6、24、48和72小時(shí)測(cè)量腳掌。實(shí)施例1制備類固醇處理的單核細(xì)胞上清液(STMS)并部分純化STMS肽因子類固醇處理的單核細(xì)胞上清液是這樣獲取的以每ml 5×107細(xì)胞的濃度在含有熱滅活的10％胎小牛血清(FCS)的Hams F-10培養(yǎng)基上鋪板培養(yǎng)人單核細(xì)胞60分鐘，用磷酸緩沖液鹽水(PBS)漂凈，然后在含有10-6M地塞米松而不含有FCS的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。STMS肽因子制備STMS基本上按照Chettibi等描述的方法得到以大約每ml 5×107細(xì)胞的濃度在含有熱滅活的10％胎小牛血清(FCS)的Hams F-10培養(yǎng)基上培養(yǎng)人單核細(xì)胞60分鐘，用PBS漂凈，然后在含有10-6M地塞米松而不含有FCS的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。用作制備對(duì)照單核細(xì)胞上清液(CMS)的平行培養(yǎng)基中不含有地塞米松。通過(guò)使用2-二維擴(kuò)散系數(shù)確定活性成分來(lái)進(jìn)行STMS肽因子的純化。使用凝膠過(guò)濾和單-Q樹脂離子交換色譜完成部分純化。通過(guò)另外使用反相HPLC來(lái)得到高度純化的產(chǎn)品。
由于假定加帽N-末端，所以最初的肽因子序列分析未能成功。
這些觀察提示，STMS處理的嗜中性白細(xì)胞誘導(dǎo)極不尋常模式的細(xì)胞架組織(附圖5d)，但是對(duì)于持續(xù)移動(dòng)的發(fā)生基礎(chǔ)并未預(yù)示任何直接線索。于是，對(duì)于光學(xué)顯微鏡下行為與粘附之間的關(guān)系，使用EM和共焦顯微鏡進(jìn)行了進(jìn)一步研究。實(shí)施例2STMS肽因子的生物學(xué)研究對(duì)STMS肽因子的生物學(xué)興趣建立在其作為糖皮質(zhì)激素的某些或所有抗炎作用的介質(zhì)的潛在角色上。使用與肽因子相對(duì)的上清液的許多初步觀察均支持這一角色，但是，其它的，如分散性移動(dòng)現(xiàn)象，不是明顯的抗炎反應(yīng)。然而，低粘附性(似乎是引起分散移動(dòng)的原因之一)則具有清楚的抗炎涵義。嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)的趨化使用其濃度能夠引起類似于基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)次最大刺激的激動(dòng)劑。前面實(shí)驗(yàn)的粗或部分純化的STMS肽因子顯示出在始終如一的濃度梯度時(shí)能夠刺激嗜中性白細(xì)胞發(fā)生高度分散移動(dòng)。這明顯與對(duì)其它試劑尤其是對(duì)fMLP的反應(yīng)相反，對(duì)fMLP的移動(dòng)特性提示盡管細(xì)胞是高度能動(dòng)的，但是不能打破細(xì)胞對(duì)底物的最初粘附。這里表明，部分純化的STMS在引起類似于10nm fMLP自發(fā)速度的濃度時(shí)也產(chǎn)生分散反應(yīng)(圖1,2)。
除了定量測(cè)定移動(dòng)參數(shù)，在實(shí)驗(yàn)期間還對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了觀察，表明當(dāng)用不同刺激劑處理細(xì)胞時(shí)，顯示出非常清晰的活動(dòng)特征。嗜中性白細(xì)胞暴露于STMS，很快變成與變平和附著相一致的暗-相，但是，然后又恢復(fù)明亮相狀態(tài)并變成能動(dòng)的。相反地，IL-8誘導(dǎo)細(xì)胞呈可逆性暗相和明相的周期性活動(dòng)特征，而用fMLP處理的細(xì)胞則保持明相。STMS處理的細(xì)胞也顯示出極具特色的現(xiàn)象，給人的主觀印象是細(xì)胞附著于底物的單個(gè)位點(diǎn)上，同時(shí)上面的細(xì)胞體在動(dòng)態(tài)活動(dòng)。所有其它刺激劑實(shí)驗(yàn)顯示引起嗜中性白細(xì)胞形成數(shù)個(gè)底物附著點(diǎn)。該觀察與先前粘附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，先前粘附實(shí)驗(yàn)表明STMS處理的嗜中性白細(xì)胞極易從蛋白包被的玻璃表面洗脫下來(lái)。嗜中性白細(xì)胞極化和膜形態(tài)學(xué)用部分純化的STMS肽因子處理的嗜中性白細(xì)胞，在相-差顯微鏡下看起來(lái)是伸長(zhǎng)的，它們對(duì)蛋白包被的玻璃表面的粘附特性表明它們可能是附著于單個(gè)位點(diǎn)。通過(guò)洗滌細(xì)胞相對(duì)容易被分離開，這種表現(xiàn)也提示大部分未附著細(xì)胞體以其伸長(zhǎng)的突起連接于玻璃表面。掃描電子顯微鏡研究結(jié)果證實(shí)，fMLP或IL-8處理的細(xì)胞顯示出典型的極化，即具有豐富的波狀膜區(qū)域而沒(méi)有清晰的前沿(圖3a,b,c)。除了由與基層接觸的清晰可見(jiàn)點(diǎn)所顯示的皺褶，細(xì)胞體上面的膜高度卷曲。雖然fMLP和IL-8誘導(dǎo)的膜上的差異清晰可見(jiàn)，但是很難定義。相反，STMS誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)是獨(dú)特的并便于描述(圖3c)。
細(xì)胞是伸長(zhǎng)的雙極形狀，但是，可能涉及與基層接觸粘附的兩個(gè)末端卻不完全相同。膜相對(duì)光滑具有無(wú)數(shù)小突起，細(xì)胞體和明顯的偽足間的表面觀無(wú)特別明確的差異。
嗜中性白細(xì)胞接種在單層牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上30分鐘，并用于制備SEM。這種處理使膜表面表觀出現(xiàn)微小的差異，對(duì)IL-8和fMLP反應(yīng)時(shí)膜表面是皺褶的，而對(duì)STMS反應(yīng)時(shí)相對(duì)光滑。最明顯的差異是當(dāng)fMLP和IL-8處理的嗜中性白細(xì)胞幾乎全是在內(nèi)皮細(xì)胞接點(diǎn)處被發(fā)現(xiàn)時(shí)，STMS處理的嗜中性白細(xì)胞卻傾向于在內(nèi)皮細(xì)胞胞體處被發(fā)現(xiàn)(圖4a,b)。共焦顯微鏡為研究形狀差異的發(fā)生機(jī)制和弄明白分散移動(dòng)的性質(zhì)，我們檢測(cè)了細(xì)胞中聚合的肌動(dòng)蛋白的分布。對(duì)照非激活嗜中性白細(xì)胞顯示出弱的、相當(dāng)點(diǎn)狀的熒光分布，但是沒(méi)有相當(dāng)于皮層肌動(dòng)蛋白相對(duì)平均分布的主要極化灶的跡象(圖5a)。由fMLP得到的結(jié)果與其他工作者[Coates等，1992]提供的結(jié)果相似，并且與肌動(dòng)蛋白聚合較對(duì)照細(xì)胞明顯致密以及肌動(dòng)蛋白聚合與活躍移動(dòng)聚集的粘附接觸點(diǎn)有關(guān)的解釋一致(圖5b)。對(duì)CMS或?qū)NF反應(yīng)而高度擴(kuò)散的細(xì)胞顯示出F-肌動(dòng)蛋白非常典型的點(diǎn)分布(圖5c)。STMS-處理的細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白染色的現(xiàn)象極不尋常并且清晰。染色僅僅出現(xiàn)在雙極細(xì)胞的極端，而對(duì)于這似乎是粘附接觸點(diǎn)的兩個(gè)末端，始終如一地是一端較另一斷更致密地染色(圖5d)。嗜中性白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)部分純化的肽因子減少嗜中性白細(xì)胞對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。嗜中性白細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的掃描EM研究顯示與其它刺激物顯著不同，上清液肽因子阻止粘附和內(nèi)皮細(xì)胞接點(diǎn)處的侵入。抑制嗜中性白細(xì)胞分泌部分純化的肽因子抑制細(xì)胞松弛素處理的嗜中性白細(xì)胞分泌彈性蛋白酶(未顯示數(shù)據(jù))。實(shí)施例3STMS和肽因子的詳細(xì)生物學(xué)研究嗜中性白細(xì)胞與牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附前面的數(shù)據(jù)表明STMS減少嗜中性白細(xì)胞與蛋白包被的玻璃的粘附[Chettibi等，1993]，使用更為生理性底物-牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究(圖2)。趨化性使用改良的Boyden室對(duì)嗜中性白細(xì)胞趨化性的初步觀察揭示了對(duì)STMS和fMLD反應(yīng)之間的驚人差異。然而，當(dāng)用前沿方法檢測(cè)濾膜時(shí)卻清楚地顯示僅少量STMS-處理過(guò)的細(xì)胞能夠成功浸潤(rùn)，與預(yù)測(cè)的持續(xù)移動(dòng)保持一致。這些觀察提示需要更適宜的分析法來(lái)測(cè)量總浸潤(rùn)或測(cè)定處于前沿和濾膜表面之間的細(xì)胞數(shù)量。圖6表示使用前沿和平均浸潤(rùn)兩種方法分析趨化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明STMS本身不是趨化性的，但當(dāng)存在于上室時(shí)則戲劇性地抑制對(duì)fMLP的反應(yīng)。在均一濃度的fMLP時(shí)(即，在兩個(gè)室均含有)顯著降低浸潤(rùn)。
由于STMS是經(jīng)抗炎類固醇誘導(dǎo)而產(chǎn)生的，因此，沒(méi)有理由相信該分子會(huì)是真正的抗炎介質(zhì)。迄今顯示的大多數(shù)特性與是嗜中性白細(xì)胞的前-炎癥反應(yīng)抑制因子的作用一致，然而，其最大特性-在靶細(xì)胞誘導(dǎo)持續(xù)移動(dòng)，決不是預(yù)期的抗炎反應(yīng)。前-炎癥細(xì)胞因子具有高、低劑量效應(yīng)的復(fù)雜程序，當(dāng)細(xì)胞暴露于此類分子的梯度濃度時(shí)，高、低劑量產(chǎn)生極為不同的程序反應(yīng)。例如，fMLP的許多動(dòng)力效應(yīng)主要地被解釋為對(duì)濃度梯度的反應(yīng)。相反，STMS對(duì)嗜中性白細(xì)胞的效應(yīng)并沒(méi)有表明在低和高濃度梯度時(shí)將會(huì)觀察到數(shù)量上的顯著不同。用均一濃度激動(dòng)劑的研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)濃度梯度對(duì)于趨化反應(yīng)的關(guān)鍵作用，因此，盡管用均一濃度的fMLP或IL-8處理的嗜中性白細(xì)胞具有高度活躍的運(yùn)動(dòng)突起，但是細(xì)胞不能產(chǎn)生有效的移位。相反，STMS處理細(xì)胞顯示出的相似程度的運(yùn)動(dòng)活性則引起了非常有效的移動(dòng)。
已經(jīng)確認(rèn)肌動(dòng)蛋白聚合是fMLP刺激嗜中性白細(xì)胞的早期反應(yīng)。Coates等已經(jīng)提供證據(jù)表明肌動(dòng)蛋白聚合是測(cè)定形狀變化和描述極化特異現(xiàn)象的早期和主要事件。據(jù)信fMLP受體和這些早期膜事件之間的聯(lián)系是由蛋白激酶C(PKC)激活提供的，蛋白激酶C激活后能導(dǎo)致小的胞質(zhì)GTP-結(jié)合蛋白激活[Ridley,1994]。
另外，最近Janme綜述了PKC在MARCKs磷酸化中的作用以及磷酸化和鈣結(jié)合在決定肌動(dòng)蛋白與質(zhì)膜之間的相互作用中的作用。目前的觀察提示以肌動(dòng)蛋白為基礎(chǔ)的移動(dòng)突起是在細(xì)胞外周競(jìng)爭(zhēng)，如果激動(dòng)劑梯度造成位于細(xì)胞前沿的此類突起不均勻活動(dòng)時(shí)，僅導(dǎo)致生產(chǎn)性位移。另一模式是梯度作用主要導(dǎo)致細(xì)胞尾端的粘附減弱。
在許多重要方面對(duì)STMS的反應(yīng)模式是不同尋常的。肌動(dòng)蛋白池看起來(lái)是高度活力的，但是F-肌動(dòng)蛋白的分布主要強(qiáng)制在一個(gè)末端，從而在雙極細(xì)胞中造成肌動(dòng)蛋白的單極分布。覆蓋大部分胞體的膜保持相對(duì)光滑，在懸浮液中的細(xì)胞和粘附于內(nèi)皮的細(xì)胞垛(盡管松弛)細(xì)胞的表面均觀察到這種缺乏皺褶。有趣的是，缺乏皺褶可能是這些嗜中性白細(xì)胞本身不能識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞間隙的表現(xiàn)，因而抑制炎癥反應(yīng)。
傾斜實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞移動(dòng)被引力場(chǎng)高度極化)得到的數(shù)據(jù)顯示，激活細(xì)胞總是保持一個(gè)點(diǎn)與底物穩(wěn)定粘附。因此，接下來(lái)為了保持此極性，肌動(dòng)蛋白聚合塊必須循環(huán)重復(fù)地從細(xì)胞的一個(gè)末端向另一末端移動(dòng)。此激活方式的確趨向于提示細(xì)胞的雙極性是由預(yù)先存在的至今尚未被描述的結(jié)構(gòu)特征所決定的。
作為抗炎介質(zhì)的STMS肽因子的行為的最重要方面之一是其調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)前-炎癥介質(zhì)的反應(yīng)。這在上述使用運(yùn)動(dòng)性刺激作為活性比較的基礎(chǔ)參數(shù)的工作中已被驗(yàn)證過(guò)。在STMS和fMLP或IL-8作為移動(dòng)刺激因子是等效的條件下，對(duì)STMS反應(yīng)的形態(tài)學(xué)、粘附和移動(dòng)傾向于占優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞保持明相、雙極和發(fā)生分散移動(dòng)。
更為顯著的是，STMS肽因子本身不是趨化性的，但它能夠抑制對(duì)fMLP反應(yīng)的趨化。有趣的是這里討論趨化中持續(xù)性的作用。根據(jù)概念的本來(lái)含義，任何定向移動(dòng)均具有持續(xù)性。這在傾斜實(shí)驗(yàn)[Chettibi等，1994]中看的更清楚，實(shí)驗(yàn)中對(duì)STMS的反應(yīng)顯示出大于90％的定向運(yùn)動(dòng)，而持續(xù)性盡管無(wú)限但是基本上變成毫無(wú)疑義的概念。對(duì)于在均一濃度STMS中的移動(dòng)，持續(xù)性反映移動(dòng)系統(tǒng)中的某種惰性。請(qǐng)記住在低雷諾氏數(shù)(Reynold’s number)條件下，此惰性必然與組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，在移動(dòng)期間細(xì)胞骨架作用于組織結(jié)構(gòu)或者其本身重新分布。
對(duì)在內(nèi)皮層上的STMS處理的細(xì)胞的電子顯微鏡觀測(cè)證實(shí)細(xì)胞不去尋找內(nèi)皮細(xì)胞間的接點(diǎn)，而且即使遇到間隙的話，也不具有穿透這種間隙的適宜的探測(cè)引導(dǎo)板。
可以得出這樣的結(jié)論類固醇誘導(dǎo)的因子所引起的嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)的持續(xù)性是對(duì)肌動(dòng)蛋白分布和聚合作用影響的結(jié)果。這種類型的移動(dòng)看起來(lái)致使嗜中性白細(xì)胞抵抗趨化刺激以及阻止嗜中性白細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞和經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞接點(diǎn)遷移。由于該因子表現(xiàn)為抗炎糖皮質(zhì)激素作用的重要介質(zhì)，那么純化的肽因子就可能被有效地用于替代類固醇來(lái)治療慢性炎癥性病癥。實(shí)施例4活性因子的鑒定STMS(類固醇處理的單核細(xì)胞上清液)定義為從類固醇處理的單核細(xì)胞的培養(yǎng)基中提取的活性物質(zhì)，它影響人嗜中性白細(xì)胞的移動(dòng)，特別是引起以高度2-二維擴(kuò)散系數(shù)為特征的分散或持續(xù)移動(dòng)。
使用離子交換和凝膠過(guò)濾步驟相結(jié)合的方法，將Chettibi博士等描述的物質(zhì)進(jìn)行高度純化，但是，關(guān)鍵步驟是使用一個(gè)HPLC柱和下述組成的梯度洗脫液的反相HPLCA)0.1％三氟醋酸B)在50％乙腈中的0.1％三氟醋酸。活性物質(zhì)在34％B或其附近洗脫。
涉及極端pH或離子強(qiáng)度的分離方法極大地影響劑量-效應(yīng)曲線。
由該方法制備的最具活性物質(zhì)的濃縮溶液呈淺粉紅色，物質(zhì)的特征在于洗脫分析顯示吸收峰在214nm處并具有清楚的肩峰。進(jìn)一步的拆分是不可能的，而且并不能將活性與峰或肩峰聯(lián)系起來(lái)。質(zhì)譜顯示1331 Da質(zhì)量的單個(gè)主組分和裂解分析得到1186Da和991Da的組分。全長(zhǎng)分析(Dr PappinICRF)確認(rèn)主峰是acyanocobalmin-維生素B12的衍生物。推測(cè)維生素B12事實(shí)上是污染物或起遮蓋真正的肽因子的作用。因此，制備STMS和接下來(lái)純化肽因子時(shí)省略維生素B12。此時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)從HPLC洗脫下來(lái)的物質(zhì)的反應(yīng)最適濃度至少較培養(yǎng)基中含有的濃度低104倍。該觀察提示活性因子是小分子與載體蛋白的復(fù)合物。
由培養(yǎng)基中制備省略維生素B12的STMS得到高產(chǎn)率的活性物質(zhì)。使用加壓透析(在真空中)純化將100ml培養(yǎng)基濃縮到少于20ml。用蒸餾水洗滌dialisand 2次。然后，通過(guò)從Mono Q陰離子交換樹脂吸收和洗脫及在高鹽濃度時(shí)在Pharmacia肽柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾來(lái)純化樣本。接著，使用上述反相HPLC對(duì)樣本進(jìn)行純化。最高度純化的物質(zhì)以單個(gè)峰洗脫下來(lái)而不含有色素。
現(xiàn)在質(zhì)譜儀分析揭示單個(gè)主峰平均質(zhì)量為4980 Da(+/-2Da)。肽物質(zhì)少部分酯化后進(jìn)行的質(zhì)譜測(cè)量表明含有11個(gè)酸性氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)。
然后，于25℃在含有15％v/v正-丙醇和0.5％己基-B-吡喃葡萄糖(HBG)的6μl 50mM碳酸氫銨(pH 7.8)中的100ng胰蛋白酶(Boenringer，改良的)對(duì)肽進(jìn)行過(guò)夜消化。然后，將消化的肽與N-琥珀酰亞胺基-2(3-吡啶)醋酸鹽(SPA)反應(yīng)以增強(qiáng)b-離子豐度和便于串聯(lián)質(zhì)譜儀(Sherman等，1995)進(jìn)行序列分析。在冰浴中，用在含有15％v/v乙腈的0.5M HEPES(用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.8)中的1％w/v N-琥珀酰亞胺基-2(3-吡啶)醋酸鹽7μl來(lái)處理干燥的肽成分20分鐘。用1μl七氟丁酸(HFBA)終止反應(yīng)，立即將溶液注入用POROS R2/H物質(zhì)(Perseptive Biosystems,MA)填充的毛細(xì)管反相柱(300μm×15cm)中，用2％v/v乙腈/0.05％v/v TFA平衡，流速為3μl/min。用10％v/v乙腈/0.05％v/v TFA以3μl/min的流速無(wú)梯度洗脫吸收的肽30分鐘，以洗脫出過(guò)量試劑和HEPES緩沖液。然后，用單階梯度75％v/v乙腈/0.1％v/v甲酸洗脫衍生肽并按每份4μl收集。接下來(lái)，通過(guò)使用配有納電噴射源的Finnigan MAT TSQ7000三聯(lián)四極MS(Hunt等，1986；Wilm和Mann,1996)用低能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)對(duì)5種衍生肽進(jìn)行全序列分析。進(jìn)行CID操作時(shí)使用碰撞偏移電壓-13V～-33V的2-3mTorr氬。以500amu/秒Q3掃描采集產(chǎn)物-離子光譜。
得到的5個(gè)序列為1)Ac-SDKPDMAE[LI]EKFDK Ac-乙?；?；Met氧化為Met-硫氧(+16Da)2)TETQEK3)NP[LI]PSK4)ET[LI]EQEK5)QAGES游離酸在C-末端鑒定肽1并確定蛋氨酸氧化為硫氧蛋氨酸的數(shù)據(jù)示于圖7。
注意不能分辨Leu和Lie[LI]，因?yàn)樗鼈兪峭之悩?gòu)體。序列精確地與人胸腺素β4的胰蛋白酶消化片段相對(duì)應(yīng)。
現(xiàn)在從人嗜中性白細(xì)胞制備胸腺素β4使用的方法是用HPLC純化高氯酸上清液。用質(zhì)譜分析得到的四個(gè)主峰。其中兩個(gè)主峰被確定為在37％B洗脫出來(lái)的胸腺素β4(主峰)和在34％B洗脫出來(lái)的氧化胸腺素β4。另外兩個(gè)峰沒(méi)有給出MW。
Pappin博士還合成了胸腺素β4，但是終產(chǎn)物具有不同的修飾，認(rèn)為發(fā)生在在C-末端的絲氨酸。
目前，我們?cè)噲D使用過(guò)氧化氫將胸腺素β4氧化并且使用測(cè)定所用HPLC洗脫方式。室溫下用HO(50vol.)處理胸腺素β45分鐘產(chǎn)生足量的轉(zhuǎn)化。
Pappin博士證明分子的平均質(zhì)量為4980Da(+/-2Da)。實(shí)施例5Tβ4so的活性，在嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)實(shí)驗(yàn)中顯示出在低濃度時(shí)是分散性運(yùn)動(dòng)，而在高于最適濃度時(shí)是刺激性非分散性移動(dòng)，圖8a。在這些實(shí)驗(yàn)中，天然Tβ4確實(shí)不引起明顯的分散性移動(dòng)。眾所周知嗜中性白細(xì)胞移動(dòng)實(shí)驗(yàn)難以標(biāo)準(zhǔn)化，因此，我們?cè)噲D使用獨(dú)立分析一趨化抑制來(lái)確定因子的身份。早期的工作已經(jīng)證實(shí)STMS抑制嗜中性白細(xì)胞對(duì)fMLP的趨化(Young等，1997)?，F(xiàn)在，我們?cè)贐oyden室實(shí)驗(yàn)中測(cè)定Tβ4和Tβ4so的活性，證明二者均無(wú)趨化性，但是二者抑制對(duì)fMLP的趨化，而且氧化形式Tβ4具有一個(gè)數(shù)量級(jí)的更大效力，圖8b。這些結(jié)果支持Tβ4so可能是Tβ4的細(xì)胞外生物活性形式的觀點(diǎn)，對(duì)此我們通過(guò)比較二者在內(nèi)皮細(xì)胞層傷口閉合實(shí)驗(yàn)中的活性而作了研究，內(nèi)皮細(xì)胞傷口閉合實(shí)驗(yàn)是分析Tβ4活性的更接近的生物分析實(shí)驗(yàn)(Malinda等)。Tβ4作用的結(jié)果與公開的數(shù)據(jù)完全吻合，但是Tβ4so的活性高于天然肽至少有一個(gè)數(shù)量級(jí)，圖8c。用更多氧化產(chǎn)物污染天然Tβ4(此例中是7％)，得到的結(jié)果與Tβ4so是唯一生物活性形式的假說(shuō)一致。進(jìn)一步研究使用的是用HPLC純化的干燥Tβ4，貯存于-20℃液氮下，使用前即時(shí)溶解。這些結(jié)果，尤其是抑制趨化，使得有理由相信Tβ4so能夠減弱與嗜中性白細(xì)胞有關(guān)的炎癥過(guò)程，于是，將體外觀測(cè)進(jìn)一步擴(kuò)展到使用角叉菜膠誘導(dǎo)炎癥模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上，所述模型的特征是大量嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有水腫形成(Ianaro,1994)。在將角叉菜膠注射到BALB/c小鼠后足掌前30分鐘、注射同時(shí)和注射后6小時(shí)時(shí)施用Tβ4so，明顯減輕腫脹，6小時(shí)后效果顯著并且作用持續(xù)高達(dá)24小時(shí)(圖9a)。抑制是劑量應(yīng)答性的和特異的，因?yàn)槭┯?0或100ng Tβ4so，或PBS或Tβ4(1000ng)沒(méi)有效果(圖9b)。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的800ng Tβ4so和Tβ4的比較清楚地顯示只有氧化肽顯著降低角叉菜膠誘導(dǎo)的腫脹(圖9c)。這些數(shù)據(jù)表明要達(dá)到Tβ4so的體內(nèi)抗炎活性，蛋氨酸氧化是關(guān)鍵，而且強(qiáng)力地支持體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的生物推論。
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權(quán)利要求
1．一種藥物制劑，含有氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽、和其可藥用的載體。
2．按照權(quán)利要求1所述藥物制劑，其中氧化胸腺素β4是胸腺素β4在其距離N-末端6個(gè)氨基酸的蛋氨酸殘基氧化為硫氧蛋氨酸。
3．按照權(quán)利要求1所述藥物制劑，其中氧化胸腺素β4是胸腺素在其距離N-末端6個(gè)氨基酸的蛋氨酸殘基與金屬絡(luò)合。
4．按照權(quán)利要求1所述藥物制劑，其中生理活性變體是由氧化胸腺素β4截短的氧化肽。
5．按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物制劑，其中氧化胸腺素來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
6．按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的藥物制劑，其中氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽占制劑中所含任何胸腺素β4的至少30％。
7．按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述藥物制劑，其中氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽基本上不含有未氧化的胸腺素β4。
8．按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述藥物制劑，包括其它藥物，其中所述其它藥物的副作用是發(fā)炎。
9．按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述藥物制劑，適宜于口腔、鼻腔、局部、直腸、陰道或非腸道給藥。
10．氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽在治療中的應(yīng)用。
11．氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽在制備治療炎性病癥的藥物中的應(yīng)用。
12．按照權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中炎性病癥是起因于炎性關(guān)節(jié)病、結(jié)締組織病、結(jié)節(jié)性綜合征、呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病、胃腸道疾病、血液病、移植/修復(fù)的排斥或感染。
13．按照權(quán)利要求11所述應(yīng)用，其中炎性病癥是由其它藥物治療所引起的。
14．氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽在制備治療感染性休克的藥物中的應(yīng)用。
15．按照權(quán)利要求14所述應(yīng)用，其中氧化胸腺素β4、其生理活性變體或鹽以提純的形式存在。
16．制備氧化胸腺素β4的方法，包括獲得胸腺素β4和然后將獲得的胸腺素β4進(jìn)行氧化。
17．按照權(quán)利要求16所述方法，其中使用過(guò)氧化氫進(jìn)行氧化。
18．通過(guò)合成胸腺素β4然后將合成的胸腺素β4氧化來(lái)獲得合成的氧化胸腺素β4。
19．含有胸腺素β4序列一部分的合成氧化肽，其中至少含有蛋氨酸并且呈氧化形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及氧化胸腺素β4在治療中的應(yīng)用,尤其是在治療與炎癥反應(yīng)或感染性休克有關(guān)的病癥中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供含有氧化胸腺素β4和適宜賦型劑的藥物制劑。
文檔編號(hào)C12N15/67GK1308543SQ9980595
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月28日
發(fā)明者羅伯特·鄧肯·史蒂文森, 安東尼·約翰·勞倫斯, 約翰·揚(yáng), 達(dá)里爾·約翰·塞西爾·帕皮寧 申請(qǐng)人:格拉斯哥大學(xué)董事會(huì), 皇家腫瘤研究院, 羅伯特·鄧肯·史蒂文森