專利名稱：：一種特異和高效的南瓜pp2基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及調(diào)控目的基因在植物韌皮部組織特異和高效表達(dá)的新的DNA序列，包含所說(shuō)的DNA序列與報(bào)告基因的融合構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，以及由所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物外植體所產(chǎn)生的組織特異性表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。韌皮部(phloem)是植物長(zhǎng)距離運(yùn)輸光合產(chǎn)物的重要組織。篩管元件(sieveelement)是由高度?；捻g皮部細(xì)胞組成，是涉及長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)淖钪匾慕M織。韌皮部蛋白(phloemprotein，P蛋白)是篩管細(xì)胞質(zhì)中的主要成分，在韌皮部組織發(fā)育的早期即開始合成，并一直持續(xù)存在到韌皮部老化期。在分化后的篩管細(xì)胞中的P蛋白由篩管細(xì)胞-伴胞細(xì)胞復(fù)合體中的伴胞細(xì)胞合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到篩管細(xì)胞(ThompsonGAandSchulz,ATIPS4:354-360,1999)。1975年，Eschrich等(Eschrich,W.,in:TransportinPlantsI.PhloemTransport.,M.H.ZimmermanandJ.A.Milburn,Eds,pp.39-56,1975)通過(guò)解剖學(xué)觀察及結(jié)合P蛋白的物理學(xué)特征指出，P蛋白可能通過(guò)損傷的封閉機(jī)制，防止植物光合產(chǎn)物從破損的篩管細(xì)胞流失。葫蘆科植物許多種的韌皮部組織由較大直徑的篩管細(xì)胞構(gòu)成，從這些篩管細(xì)胞中可以很容易地收集到富含P蛋白的滲出液。已從葫蘆科植物韌皮部滲出液收集物中分離鑒定到兩種含量極為豐富的P蛋白PP1(韌皮部蛋白1)和PP2(韌皮部蛋白2)。PP1蛋白分子量96千道爾頓(80-136KDa)；Beyenbach等人(Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Koliman,etal.,Planta95:86-94,1970；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)的研究認(rèn)為，PP2蛋白分子量48千道爾頓，是一種二聚體凝集素。此外Beyenbach等(Beyenbach,etal.,Supra；Weber,etal.,Exp.CellRes.87:79-106,1974)認(rèn)為，PP1和PP2都是堿性蛋白質(zhì)(PI9.6-10.4)，有相似的氨基酸組成，富含賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glx)和天冬氨酸(Asx)，是活體(invivo)植物韌皮纖維構(gòu)成成分。對(duì)于PP1蛋白，Beyenbach等(Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983；Sabnisetal.,Planta145:459-466,1979；Walker,Biochem.Biophys.Acta257:433-444,1972)研究表明，PP1單體通過(guò)在半胱氨酸之間形成共價(jià)二硫鍵而相互交聯(lián)形成多聚體。Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem,134:561-569,1983；Walker,Biochem.Biophys.Acta257:433-444,1972；Waller,etal.,AnnBot35:733-790,1971)的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)體外(invitro)氧化，純化的PP1產(chǎn)生明顯的纖絲，因而認(rèn)為PP1作為主要的結(jié)構(gòu)蛋白參與形成在電鏡下可見的在受損傷維管組織處產(chǎn)生的凝集小塊。對(duì)于PP2蛋白，Allen等(Allen,Biochem.J.183:133-137,1979；Beyenbach,etal.,Planta119:113-124,1974；Read,etal.,Eur.J.Biochem134:561-569,1983；Sabnis,etal.,Planta142:97-101,1978)研究揭示PP2是一種凝集素，特異性結(jié)合多聚β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺或幾丁質(zhì)。此外，Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)研究認(rèn)為PP2二聚體由兩種不同的亞單位α(Mr26,500)和β(Mr25,000)構(gòu)成，這兩種亞單位通過(guò)在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵而結(jié)合。但Thompson等(GaryA.Thompson,etal.,US005495007A,1996)研究認(rèn)為PP2是同源二聚體，由相似的亞單位構(gòu)成。Kleinig等(Kleinig,etal.,Planta127:163-170,1975；Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:56l-569,1983:Read,etal.,Planta158:119-127,1983)指出純化的PP2蛋白在避免暴露于空氣中或氧化劑中被氧化的情況下保持可溶性，且與PP1蛋白通過(guò)二硫鍵橋共價(jià)聯(lián)結(jié)構(gòu)成植物韌皮部纖絲的組成成分。Read等(Read,etal.,Eur.J.Biochem.134:561-569,1983)指出P蛋白纖絲中也可能包含第三種共價(jià)交聯(lián)蛋白。這種蛋白是一種堿性蛋白，分子量45kDa，與PP1和PP2蛋白相比其含量很低，目前對(duì)這種蛋白與PP1和PP2蛋白之間的相互關(guān)系知之甚少。此外，葫蘆科植物韌皮部滲出液的SDS-PAGE電泳還呈現(xiàn)出7-10種低分子量的多肽(9-20kDa)，但它們可能不是P-蛋白。Crafts(Crafts,PlantPhysiol.7:183-225,1932)指出葫蘆科植物韌皮部包含不同的類型，由其結(jié)構(gòu)，來(lái)源及其在莖中的分布相區(qū)別。葫蘆科是幾種具有雙韌皮部維管束的植物科之一，其維管束中包含內(nèi)韌皮部和外韌皮部。葫蘆科植物還存在外維管束韌皮部，增加了其韌皮部解剖學(xué)的復(fù)雜性。Blyth等(Blyth,Originofprimaryextraxylarystemfibersindicotyledons.Univ.Cal.BerkeleyPubl.Bot.30:145-232,1958；Crafts,PlantPhysiol.7:183-225,1932)揭示外維管束韌皮部在葫蘆科植物的樹皮中成束產(chǎn)生，弧形鑲鄰于雙韌皮部維管束的兩邊。Evert等(Evert,etal.,Planta109:193～210,1973)認(rèn)為植物長(zhǎng)距離輸送光合產(chǎn)物是在雙韌皮部維管束的篩管細(xì)胞中而不是在外維管束韌皮部細(xì)胞中進(jìn)行。Cornshaw等(Cornshaw,etal.,J.Cell.Biol.38:25-39,1968)從超微結(jié)構(gòu)水平對(duì)葫蘆科植物莖的篩管細(xì)胞在發(fā)育期間的蛋白積累進(jìn)行了描述。在未成熟篩管細(xì)胞中，觀察到P蛋白以原纖絲的小的聚集體形式存在于細(xì)胞質(zhì)之中，與核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體相間混雜在一起。通常，雙韌皮部維管束篩管細(xì)胞中P蛋白體分散存在，然而外維管束篩管細(xì)胞的中P-蛋白體則保持聚集。Kulikova(Kulikova,SovietPlantPhysiol.39:734-739,1992)研究指出，改變篩管細(xì)胞中的環(huán)境特別是改變滲透勢(shì)會(huì)引起P-蛋白體分散而產(chǎn)生P蛋白絲。葫蘆科植物的葉也具有雙韌皮部維管束，包含遠(yuǎn)軸韌皮部和近軸韌皮部。Turgeon等(Turgeon,etal.,Planta129:265-269,1976)認(rèn)為遠(yuǎn)軸韌皮部組織在近軸韌皮部組織之后發(fā)育成熟，似乎是光合產(chǎn)物從葉輸出的初級(jí)途徑，而近軸韌皮部組織可能運(yùn)輸光合同化物到充當(dāng)同化物匯集庫(kù)的正在伸展葉的葉肉組織之中。Turgeon等(Turgeon,etal.,Protoplasma83:217-232,1975)發(fā)現(xiàn)在篩管細(xì)胞發(fā)育期，P蛋白體在遠(yuǎn)軸和近軸韌皮部中聚集。在成熟的遠(yuǎn)軸篩管細(xì)胞中，大多數(shù)P蛋白是分散的，呈纖絲狀，而在成熟的近軸篩管細(xì)胞中P蛋白保持凝聚，類似于莖中的外維管束韌皮部。近些年，由于對(duì)韌皮部的長(zhǎng)距離運(yùn)輸功能的興趣，已鑒定了一些驅(qū)動(dòng)韌皮部組織基因表達(dá)的啟動(dòng)子。然而，在許多情況下，這些啟動(dòng)子也驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)在非韌皮部組織發(fā)生。Benfey等(Benfeyetal.,EMBOJ,9[6],1685-1696,1990)從病毒，Kononowicz等(Kononowiczetal.,PlantCell4:17-27,1992)從土壤農(nóng)桿菌和Liang等(Liangetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9384-9288,1989；KellerandBaumgartner,PlantCell3:1051-1061)從植物中分別克隆、鑒定了一些驅(qū)動(dòng)維管束基因表達(dá)的啟動(dòng)子。從韌皮部積聚的DNA病毒中也分離到韌皮部特異基因表達(dá)的啟動(dòng)子。如Bhattacharyya-Pakrasi等(Bhattacharyya-Pakrasietal.,PlantJ.4[1]71-79,1993)從水稻tungro病毒和Medberry等(Medberryetal.,Plantcell.4:185-192,1992)從竹節(jié)花黃斑駁病毒(commelinayellowmottlevirus)中分別分離到的韌皮部特異啟動(dòng)子。此外，Yang等(YangandRussell,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4144-4148,1990)研究了庶糖合酶，Edwards等(Edwardsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA:3459-3463,1990)研究了谷氨酰胺合成酶和DeWitt等(DeWittetal.,PlantJ.1[1]:121-128,1991)研究了一種細(xì)胞膜H+-ATPase的韌皮部特異異構(gòu)體，分別揭示了這些編碼與韌皮部功能相關(guān)蛋白的植物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在植物韌皮部特異表達(dá)。本發(fā)明涉及本發(fā)明人所首次克隆的具有植物韌皮部特異性的南瓜韌皮部蛋白2基因啟動(dòng)子的DNA序列，包含所說(shuō)DNA序列與GUS基因編碼區(qū)的構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物組織，以及由所說(shuō)的植物組織產(chǎn)生的在韌皮部組織特異表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因植物。韌皮部是植物維管組織的一部分，由于負(fù)責(zé)植物體內(nèi)糖等有機(jī)營(yíng)養(yǎng)從葉到其它組織器官的運(yùn)輸而成為許多植物病原微生物和害蟲，如刺吸式昆蟲蚜蟲、飛虱和葉蟬等的直接侵害目標(biāo)。剌吸式昆蟲不僅嚴(yán)重危害農(nóng)作物，而且是植物病毒在自然界傳播的最重要媒介。據(jù)統(tǒng)計(jì)85％以上的蟲媒病毒由這類昆蟲傳播，如黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、香蕉束頂病毒(RBTV)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)由蚜蟲傳播，水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋葉枯病毒(RSV)、小麥叢矮病毒由飛虱傳播，水稻黃矮病毒(RYSV)、水稻Tungro病毒由葉蟬傳播?？瓜x、抗病基因工程中常用的組成型表達(dá)啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)目的基因在植物體內(nèi)各部位平均表達(dá)，難以在受侵害組織形成較高的作用濃度，而在非侵害部位表達(dá)對(duì)植物本身是一種額外負(fù)擔(dān)和能源及養(yǎng)分的浪費(fèi)；如果利用韌皮部組織特異表達(dá)啟動(dòng)子使抗蟲、抗病基因在韌皮部組織特異地高效表達(dá)，就可以更有效、更經(jīng)濟(jì)地發(fā)揮目的基因的作用，有針對(duì)性地防治從韌皮部入侵的病原微生物和害蟲的危害，還可降低對(duì)害蟲及病原微生物的選擇壓以及可能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的副作用，減輕植物對(duì)抗蟲、抗病基因產(chǎn)物的代謝負(fù)擔(dān)。此外，在雙價(jià)或多價(jià)抗蟲、抗病基因工程中使用與組成型啟動(dòng)子不同的韌皮部組織特異型啟動(dòng)子可避免啟動(dòng)子之間同源序列的相互作用而導(dǎo)致基因沉默。另一方面，研究植物基因組織特異表達(dá)的調(diào)控方式對(duì)于了解植物組織器官分化及基因調(diào)控規(guī)律也具有重要的理論意義。南瓜韌皮部蛋白2(phloemprotein2fromCucurbitamoschataDuch，以下簡(jiǎn)稱為南瓜PP2)是一種定位于南瓜植物韌皮部組織中的纖絲蛋白，表達(dá)量很高。南瓜PP2由南瓜PP2基因編碼，其韌皮部組織特異性表達(dá)是由南瓜PP2基因5’端非編碼區(qū)，即南瓜PP2基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控的。有幾種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子生物學(xué)方法可以用來(lái)獲得南瓜PP2基因啟動(dòng)子的核苷酸序列。例如，可以根據(jù)所知的南瓜PP2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)合成引物，從南瓜基因組文庫(kù)中以基因組DNA步移法擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。也可根據(jù)南瓜PP2cDNA序列制備探針或引物，用雜交的方法或體外多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的合成方式從南瓜染色體組文庫(kù)中“釣”取完整的序列。在未知南瓜PP2cDNA序列情況下可分離南瓜PP2蛋白，制備單克隆或多克隆抗體，與cDNA表達(dá)文庫(kù)雜交從而獲得南瓜PP2cDNA序列，然后依此序列制備探針，從南瓜染色體組文庫(kù)中通過(guò)雜交獲得包含啟動(dòng)子序列在內(nèi)的完整序列。也可測(cè)出所分離的南瓜PP2蛋白的部分氨基酸殘基序列，由此序列設(shè)計(jì)合成寡核苷酸探針用于由雜交方法獲取南瓜PP2啟動(dòng)子序列。本發(fā)明采用基因組DNA步移法，根據(jù)南瓜PP2基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，從南瓜基因組DNA文庫(kù)中克隆了南瓜PP2基因啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子的核苷酸序列見附圖1所示?？紤]到同屬一科的植物種之間基因的核苷酸序列的同源性，也可使用上述根據(jù)南瓜PP2cDNA序列設(shè)計(jì)制備的探針或引物，采用與獲取南瓜PP2啟動(dòng)子序列相類似的方法，從別的葫蘆科植物種，如筍瓜、西葫蘆或瓠果的基因組文庫(kù)中獲得其PP2基因啟動(dòng)子。本發(fā)明下文所要敘述的實(shí)施例揭示本發(fā)明人所首次獲得的南瓜PP2啟動(dòng)子序列1115bp片段(序列如附圖1所示)的部分片段855bp(序列如附圖2所示)完全足以驅(qū)動(dòng)目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物的韌皮部組織特異表達(dá)。分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，小的缺失、增加和少量點(diǎn)突變很可能不會(huì)改變1115bp序列片段的功能，該片段的許多核苷酸殘基可能對(duì)于其獨(dú)特的功能并不重要。為了搞清改變后的序列是否還具有原序列的功能，可以產(chǎn)生一系列缺失，增加或突變改造的片段，將改造片段與目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列構(gòu)建在一起，通過(guò)如下文實(shí)施例所述的在轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)基因組織特異性表達(dá)的方法來(lái)對(duì)此基因構(gòu)建體進(jìn)行研究。如果對(duì)如上所述1115bp序列進(jìn)行缺失分析，設(shè)計(jì)一系列截短了的啟動(dòng)子片段，與報(bào)告基因融合并轉(zhuǎn)化植物，進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定性、定量分析，將能獲知決定韌皮部組織特異性表達(dá)的順式元件以及能最有效地特異轉(zhuǎn)錄目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列的最佳啟動(dòng)子片段。本發(fā)明涉及南瓜PP2啟動(dòng)子的DNA序列，包含所說(shuō)DNA序列的能有效地調(diào)控目的基因在植物韌皮部細(xì)胞特異表達(dá)的部分片段，所述的片段與目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列的融合基因構(gòu)建體，用所述的融合基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物外植體及再生植株的方法，以及由此產(chǎn)生的顯著地在韌皮部特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明要求所述啟動(dòng)子的核苷酸序列的全部或部分片段與目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列相融合產(chǎn)生融合基因構(gòu)建體。在分子生物學(xué)中為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常用方法都可用于對(duì)該啟動(dòng)子的核苷酸序列進(jìn)行操作。本發(fā)明所述的“產(chǎn)生融合基因構(gòu)建體”可使用將啟動(dòng)子序列與目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列相結(jié)合的許多方法中的任何一種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。最典型的方法是將啟動(dòng)子的核苷酸序列連接在目的基因編碼區(qū)核苷酸序列的5′端或“上游區(qū)”。例如，將本發(fā)明所述的南瓜PP2啟動(dòng)子的核苷酸序列的全部或部分片段與目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列在一質(zhì)粒載體或病毒載體上相連接產(chǎn)生重組質(zhì)粒或重組病毒載體。其它一些轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控序列，如35S增強(qiáng)子、Ω序列、分泌信號(hào)肽序列、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽序列、polyA、3′UTR序列、MAR序列和終止序列都可以加到該基因構(gòu)建體上。本發(fā)明所說(shuō)的“目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列”指任何能在mRNA水平表達(dá)的核苷酸序列。所表達(dá)的mRNA被翻譯成蛋白或不翻成蛋白，也就是說(shuō)目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列是有義方向或反義方向的。反義方向的目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列可用于表達(dá)反義RNA。報(bào)告基因的廣泛應(yīng)用極大地促進(jìn)了組織特異性啟動(dòng)子的研究。這一研究方法將組織特異性基因的5’端調(diào)控序列與報(bào)告基因融合，構(gòu)建成嵌合基因?qū)胫参矬w中，通過(guò)研究報(bào)告基因的定性，定量表達(dá)特性來(lái)探知調(diào)控序列的功能。常用的報(bào)告基因有CAT基因、GUS基因、熒光素酶(luciferase,LUC)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因等。GUS基因編碼β-葡萄糖苷酸酶，可以在體外催化裂解人工合成的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)底物，產(chǎn)生深藍(lán)色化合物沉淀于植物組織，由此可對(duì)啟動(dòng)子調(diào)控的外源基因表達(dá)進(jìn)行組織化學(xué)定位；β-葡萄糖苷酸酶還可催化4-MUG(4-甲基傘形酮酰-β-葡萄糖醛酸苷)裂解形成螢光物質(zhì)4-MU(4-甲基傘形酮)，使用熒光光度計(jì)可對(duì)4-MU進(jìn)行定量測(cè)定，由此獲知所研究啟動(dòng)子調(diào)控外源基因表達(dá)的活性。熒光素酶基因編碼的熒光素酶催化熒光素氧化，釋放出熒光，可用液閃計(jì)數(shù)器進(jìn)行定量測(cè)定，由此可定量描述所用的調(diào)控序列的活性。GUS基因和熒光素酶基因在植物細(xì)胞內(nèi)的非特異性本底都很低，因而適合于對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。在本發(fā)明中，發(fā)明人使用GUS、LUC報(bào)告基因?qū)Πl(fā)明人首次克隆的南瓜PP2啟動(dòng)子的功能進(jìn)行了定性和定量分析研究。本發(fā)明將首次克隆的南瓜PP2啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因的編碼區(qū)核苷酸序列相融合產(chǎn)生了可用于植物表達(dá)的重組質(zhì)粒pBNG，并將此重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌和農(nóng)桿菌產(chǎn)生了重組微生物以便于進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，由于轉(zhuǎn)基因整合的位置效應(yīng)，即轉(zhuǎn)基因整合在植物染色體的不同位置，其表達(dá)受到植物染色體不同程度的影響，表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。預(yù)計(jì)在本發(fā)明所涉及的南瓜PP2基因啟動(dòng)子的活性定量研究中，同樣會(huì)有位置效應(yīng)，導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)基因植株具有不同的外源基因表達(dá)水平，從而影響對(duì)啟動(dòng)子的活性作出準(zhǔn)確判斷。在本發(fā)明中，為了消除位置效應(yīng)的影響，發(fā)明人使用了內(nèi)參基因構(gòu)建雙價(jià)植物報(bào)告基因表達(dá)載體。本發(fā)明在前述重組質(zhì)粒pBNG中南瓜PP2基因啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因的編碼區(qū)核苷酸序列相融合產(chǎn)生的基因構(gòu)建體的基礎(chǔ)上，使用CaMV35S啟動(dòng)子與內(nèi)參LUC基因融合得到了另一個(gè)基因構(gòu)建體，并使這兩個(gè)構(gòu)建體以各自相反的轉(zhuǎn)錄方向連接在一起，目的是盡量減少兩者在轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止水平上可能產(chǎn)生的相互影響；這樣產(chǎn)生了一個(gè)新的重組質(zhì)粒，發(fā)明人將其命名為pBL3NG。為了進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化研究，發(fā)明人將重組質(zhì)粒pBL3NG分別轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)DH5α。由于上述GUS基因和內(nèi)參LUC基因皆構(gòu)建在同一個(gè)整合區(qū)之中，在進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化時(shí)它們將整合在植物染色體的同一位置，受同樣的影響，并將具有相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，這樣就可以用內(nèi)參LUC基因的表達(dá)來(lái)校正GUS基因的表達(dá)。即對(duì)于不同的轉(zhuǎn)基因植株，每一植株的GUS表達(dá)活性除以LUC表達(dá)活性后將具有很相近的數(shù)值，這樣就能夠有效地消除位置效應(yīng)，更為準(zhǔn)確地定量描述本發(fā)明所涉及的南瓜PP2啟動(dòng)子的活性。在本發(fā)明中，發(fā)明人使用葉盤轉(zhuǎn)化法在含有重組質(zhì)粒pBL3NG的農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下將含有本發(fā)明所首次克隆的南瓜PP2啟動(dòng)子融合GUS基因編碼區(qū)的核苷酸序列以及以35S啟動(dòng)子融合內(nèi)參LUC基因編碼區(qū)的核苷酸序列的雙價(jià)基因構(gòu)建體導(dǎo)入植物染色體產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明申請(qǐng)人已于1999年8月將本發(fā)明構(gòu)建的含有南瓜PP2啟動(dòng)子855bp片段融合GUS基因編碼區(qū)的核苷酸序列以及以35S啟動(dòng)子融合內(nèi)參LUC基因編碼區(qū)的核苷酸序列的雙價(jià)報(bào)告基因植物中間表達(dá)載體pBL3NG的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化子保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏登記號(hào)為CGMCCNO.0410。本發(fā)明涉及調(diào)控目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列在韌皮部組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子。所說(shuō)的“韌皮部組織特異表達(dá)”指在韌皮部組織的表達(dá)水平顯著高于在其它植物組織部位的表達(dá)。本發(fā)明所克隆的南瓜PP2啟動(dòng)子的序列與Bostwick等人(BostwicketalPlantMolecularBiology26:887-8971994)及蔣浩等人(蔣浩等農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)7(1):63-681999)已發(fā)表的筍瓜PP2啟動(dòng)子的序列相比較，同源性只有50％，并且Bostwick等人未對(duì)他們發(fā)表的那段序列的功能進(jìn)行研究。所以本發(fā)明的啟動(dòng)子應(yīng)是一個(gè)新的韌皮部組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明使用5’RACE分析方法搞清了所克隆的南瓜PP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)時(shí)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，為如附圖1、2中所示的標(biāo)記為“+1”的腺苷酸“A”。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。圖1克隆的南瓜PP2基因啟動(dòng)子的核苷酸序列。圖2亞克隆的南瓜PP2基因啟動(dòng)子855bp片段的核苷酸序列。圖3用于南瓜基因組文庫(kù)構(gòu)建的連接子(adapter)序列的正、負(fù)鏈以及連接子(adapter)序列。圖4用于南瓜PP2基因啟動(dòng)子克隆的連接子引物(AP-1、2)。圖5用于南瓜PP2基因啟動(dòng)子克隆的基因特異性引物(GSP-1、2)。圖6用于南瓜PP2基因啟動(dòng)子855bp片段克隆的引物(NP-1、2)。圖7用于南瓜PP2基因5′RACE分析的基因特異性引物(GSP-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。圖8植物中間表達(dá)載體pBL3NG和的構(gòu)建圖解。圖9轉(zhuǎn)南瓜PP2基因啟動(dòng)子-GUS基因構(gòu)建體在煙草中的GUS活性組織化學(xué)定位。(a．葉片；b．葉柄橫截面；c．莖縱切面)圖10轉(zhuǎn)pBL3NG和pBL3CG煙草的Southern雜交檢測(cè)。(1．陽(yáng)性對(duì)照4.7H/B和GUS1.8f；2．HindⅢ酶解的非轉(zhuǎn)基因煙草DNA；3．HindⅢ酶解的轉(zhuǎn)pBL3NG煙草DNA；4．HindⅢ酶解的轉(zhuǎn)pBL3CG煙草DNA。)實(shí)施例南瓜PP2基因啟動(dòng)子核苷酸序列的克隆及其驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)特點(diǎn)一．采用抑制PCR(SuppressionPCR)作基因組DNA步移，從南瓜基因組文庫(kù)中克隆到南瓜PP2基因啟動(dòng)子核苷酸序列。1．連接物(adapter)的制備用AppliedBiosystemsInc.的380ADNA合成儀(中科院微生物所技術(shù)中心)分別合成連接物的兩條寡核苷酸片段(序列見附圖4)并經(jīng)C18柱純化，然后以氯仿抽提和2.5倍95％的乙醇在-80℃沉淀1小時(shí)，離心(10,000rpm,30min.)收集寡核苷酸沉淀，真空干燥后溶于一定體積的無(wú)菌蒸餾水中，經(jīng)測(cè)在260nm的光密度來(lái)計(jì)算引物的濃度。為了使上述兩條片段復(fù)性，各取1nmol，再加入1ulNaCl(1mol/L)的和2ul10×TE(100mmol/lTris-HCl,pH8.0和1mmol/lEDTA)，以雙蒸水定容至20ul，在80℃加熱5分鐘，離心(10,000rpm,1min.),將混和物在室溫放置(復(fù)性)15分鐘，然后貯存于-20℃。如上制備好的adapter的序列如附圖3所示。2．南瓜基因組DNA的提取使用核抽提裂解法(AndrewH.Paterson,CurtL.Brubaker,andJonathanF.WendelPlantMolecularBiologyReporter,Vol11(2):122-127,1993)制備南瓜基因組DNA。取新鮮幼嫩南瓜(Cucurbitamoschata)葉片約1克，在液氮中研成粉，加入5ml核提取緩沖液(0.35mol/l葡萄糖，0.1mol/lTris-HCl,pH8.0,5mmol/lNa2-EDTA,pH8.0,2％(w/v)polyvinylpyrolidone(PVP40)和0.1％(w/v)diethyldithiocarbamicacid(DIECA)，用前加入0.2％(w/v)巰基乙醇和0.5％(w/v)Triton-x-100)，混勻，4℃離心(5,000rpm,5min.)，棄上清，往沉淀(核)中加入2ml核裂解緩沖液(0.1mol/lTris-HCl(pH8.0),1.4mol/lNaCl,20mmol/lNa2-EDTA(pH8.0),2％(w/v)hexadecyltriammoniumbromide(CTAB),2％(w/v)PVP40和0.1％(w/v)DIECA，用前再加入0.2％(v/v)硫基乙醇和0.5％TritonX-100)，充分懸浮，在65℃水浴保溫30分鐘，加入2.5ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下巔倒離心管10～50次抽提蛋白，4℃離心(6,000rpm,5min.)，吸取上清，在上清中加入0.6倍體積的異丙醇，緩慢地上下巔到離心管10-20次直至DNA沉淀產(chǎn)生，4℃離心(10,000rpm,5min.)沉淀DNA，以70％乙醇洗滌DNA沉淀2次，室溫(或37℃)使DNA干燥。加入500ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0，0.1mmol/lEDTA)溶解DNA，然后65℃保溫30分鐘以滅活可能殘留的脫氧核糖核酸酶，冷卻至室溫后用于酶切或貯存于4℃或-20℃。3．基因組文庫(kù)構(gòu)建取步驟2制備的基因組DNA0.5-1.0ug，在200ul緩沖體系中分別以EcoRⅤ、ScaⅠ、StuⅠ、DraⅠ和PvuⅡ五種限制性核酸內(nèi)切酶在37℃消化12小時(shí)以上，然后加入20ug糖原(glycogen)、20ulNaAc(3mol/L,pH5.2)、100ul0.1mol/LTris-HCl飽和酚(pH8.0)和100ul氯仿，混勻，離心(12,000rpm,10min)，吸取上清液，再以等體積氯仿抽提，吸取上清，加入500ul95％乙醇，混勻，離心(10,000rpm,10min)沉淀DNA，以80％乙醇洗滌沉淀兩次，室溫干燥DNA，加入15ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)溶解DNA。取上述DNA溶液7ul在l7℃進(jìn)行連接。在0.5mlEppendorf管中加入7ul酶解DNA、1ul連接緩沖液(10×)、0.5ul0.2mmol/LATP、0.5ul步驟1制備的adapter(50umol/L)和1ulT4DNA連接酶(lunit),混勻，17℃連接24小時(shí)以上，加入90ulTE(10mmol/lTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/lEDTA)，混勻，70℃滅活連接酶5分鐘。4．基因組DNA步移和擴(kuò)增取1ul步驟3中制備的基因組文庫(kù)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。使用珀金一埃爾默(PerkinElmer)LAPCR系統(tǒng)，在24ul擴(kuò)增體系中含有1ul步驟3中制備的基因組文庫(kù)DNA、2.4ul擴(kuò)增緩沖液、2.4uldNTPs(2mmol/L)、1.2ulMg(Ac)2(2.5mmol/L)、0.5ulAP-1引物(20umol/L)、0.5ulGSP-1引物(20umol/L)、0.3ulTaqpolymerase(2units/ul)和11.7ul重蒸水。手控?zé)釂⑹糚CR，然后執(zhí)行30次循環(huán)，每次循環(huán)由96℃變性7秒，62℃復(fù)性30秒和68℃延伸3分鐘構(gòu)成。從上述擴(kuò)增反應(yīng)物中取1ul稀釋到100ul重蒸水中，然后取1ul作為模板，以AP-2引物和南瓜PP2基因特異性巢式引物GSP-2作巢式PCR，擴(kuò)增條件與上述第一次PCR相同。再取巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1ul稀釋到100ul重蒸水中作為模板進(jìn)行第三次PCR，提高復(fù)性溫度為65℃，減少執(zhí)行循環(huán)數(shù)為25次，其它條件與巢式PCR相同。如上所用AP-1、2引物的序列見附圖4所示，GSP-1、2引物的序列見附圖5所示。分別從StuⅠ和PvuⅡ消化的基因組文庫(kù)中都獲得了約1.2kb片段，純化此1.2kb片段后各克隆到pBluescriptⅡSK(+)載體上，經(jīng)測(cè)序，上述兩片段的核苷酸序列完全相同。此片段的核苷酸序列如附圖1所示。5．南瓜PP2基因啟動(dòng)子片段克隆以步驟4所獲約1.2kb片段為模板，以如附圖6所示的南瓜PP2啟動(dòng)子5’端正鏈引物NP-1和3’端負(fù)鏈引物NP-2在100ul體系中作PCR擴(kuò)增。使用購(gòu)自上海生工公司的TaqplusⅠDNA聚合酶系統(tǒng)，在100ul擴(kuò)增體系中含有10ul擴(kuò)增緩沖液(10x)、10uldNTPs(2mmol/L)、10ulNP-1(10umol/l)、10ulNP-2(10umol/L)、0.3ulTaqplusⅠDNA聚合酶(1.2U)和59.7ul重蒸水。擴(kuò)增過(guò)程為先在94℃預(yù)變性2分鐘，然后執(zhí)行25次擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)。每次循環(huán)反應(yīng)條件為94℃變性30秒，54℃復(fù)性1分鐘，70℃延伸1分鐘。結(jié)果產(chǎn)生了持異性良好的約900bp靶帶。以購(gòu)自上海華舜公司的膠純化回收試劑盒純化回收上述PCR產(chǎn)物中的900bp靶帶，與購(gòu)自Promega公司的克隆載體pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后以質(zhì)粒電泳法(比較轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒與克隆載體質(zhì)粒電泳遷移率，有插入克隆質(zhì)粒遷移率小于無(wú)插入克隆載體質(zhì)粒遷移率)篩選陽(yáng)性克隆。從10個(gè)白斑轉(zhuǎn)化子中篩選到4個(gè)陽(yáng)性克隆(命名為N6、N8、N9和N10)，對(duì)N6,N8兩個(gè)克隆插入片段分別進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果N8克隆含有所需靶片段。該靶片段序列如附圖2所示。二．南瓜PP2基因的5′RACE分析通過(guò)對(duì)南瓜PP2基因的5′RACE分析，確定了南瓜PP2基因啟動(dòng)子3′端的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。1．南瓜總RNA的提取南瓜總RNA的提取采取熱酚法，具體步驟為取萌發(fā)了7天的南瓜下胚軸10克置于液氮中研磨成粉狀，按每克鮮重2ml的量加入預(yù)熱至90℃的RNA提取液∶苯酚(1∶1)混和液(RNA提取緩沖液100mmol/LLiCl、1％SDS、100mmol/LTris-NaOH,PH9.0和10mmo/LEDTA)，振蕩混勻，于90℃加熱至溶液呈乳狀，于室溫300rpm搖動(dòng)5分鐘，按每克鮮重1ml的量加入氯仿，室溫?fù)u動(dòng)15-30分鐘后，在25℃,20,000g離心15分鐘，取上清，加入1/3體和LiCl(8mol/L)，混和后，4℃沉淀16-48小時(shí)；4℃離心(12,000g,30min.)，在4℃度用LiCl溶液(2mol/L)洗滌RNA沉淀，再用80％乙醇洗滌三次，真空抽干，溶于適量經(jīng)DEPC處理的雙蒸水中。2．5′RACE分析從萌發(fā)了7天的南瓜下胚軸中提取RNA，使用GSP-Ⅰ引物(序列如附圖7所示)，按照GIBCOBRL公司的5′RACE分析系統(tǒng)(5′RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds)操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA并經(jīng)純化(使用GlassMAXDNAisolationspincartridgesystem)后作為模板，以GSP-Ⅱ引物(序列如附圖7所示)和5′RACE系統(tǒng)提供的AAP引物(AbridgedAnchorprimer)，在50ul反應(yīng)體系中先94℃預(yù)變性4分鐘，然后以94℃、1分鐘，55℃、1分鐘，72℃、1分鐘的條件進(jìn)行30次循環(huán)反應(yīng)，在1％瓊脂糖膠上電泳檢查PCR產(chǎn)物；將所獲PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板，再以GSP-Ⅲ引物(序列如附圖7所示)和5′RACE系統(tǒng)提供的AUAP引物，在同樣條件下進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量目的片段，將該目的片段從PCR體系中純化，經(jīng)SalI/EcoRⅠ雙酶切并經(jīng)酚仿抽提純化后與SalI/EcoRⅠ雙酶切的pBluescriptⅡSK(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌，重組子經(jīng)酶切和PCR鑒定無(wú)誤后做序列分析。由對(duì)兩個(gè)重組子克隆的序列分析結(jié)果確定了南瓜PP2基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為如附圖1所示的位于“+1”位點(diǎn)的核苷酸“A”。三．轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生1．植物表達(dá)中間載體的構(gòu)建為了定性和定量研究上述實(shí)施例一所克隆的南瓜PP2基因啟動(dòng)子在植物中的功能，對(duì)其進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因植物研究。將該啟動(dòng)子與GUS基因編碼區(qū)核苷酸序列構(gòu)建成在植物中表達(dá)的融合構(gòu)建體，方法是以HindⅢ和BamHⅠ兩種限制酶將實(shí)施例一步驟5中所獲N8克隆中的855bp啟動(dòng)子片段(序列如附圖2所示)從其克隆載體質(zhì)粒上切下，再以此片段與同樣經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ兩種限制酶消化去掉35S啟動(dòng)子片段的pBI121載體大片段相連接，所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒命名為pBNG(構(gòu)建過(guò)程如附圖8所示)。為了消除位置效應(yīng)引起的轉(zhuǎn)基因植株間表達(dá)水平的較大差異，使用了來(lái)源于螢火蟲的螢光素酶(Luciferase,LUC)基因作為內(nèi)參基因。方法是在pBl221載體的基礎(chǔ)上以LUC基因取代了GUS基因，并在NOS基因終止序列的3’端用HindⅢlinker連接產(chǎn)生一個(gè)附加的HindⅢ酶切位點(diǎn)，從而產(chǎn)生如附圖8所示的由35S啟動(dòng)子、螢光素酶基因編碼區(qū)的核苷酸序列和NOS基因終止序列組成的表達(dá)盒(2.9kb)，命名為35S/LUC-HindⅢ盒以HindⅢ切下上述2.9kb表達(dá)盒，回收，純化之，插入前述構(gòu)建的經(jīng)HindⅢ消化并以蝦堿性磷酸酯酶(shrimpalkalinephosphatase,SAP)作脫磷處理的重組質(zhì)粒pBNG的HindⅢ位點(diǎn)，產(chǎn)生的新的含有雙報(bào)告基因構(gòu)建體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌后，通過(guò)EcoRⅠ酶切分析篩選到35S/LUC-HindⅢ盒以與GUS基因表達(dá)框架的轉(zhuǎn)錄方向相反的方向插入的克隆，其所含重組質(zhì)粒命名為pBL3NG(構(gòu)建過(guò)程如附圖8所示)。為了確定本發(fā)明所涉及的南瓜PP2基因啟動(dòng)子的相對(duì)活性，對(duì)一種已知的植物韌皮部特異性強(qiáng)啟動(dòng)子竹節(jié)花黃班駁病毒(commelinayellowmottlevirus,CoYMV)啟動(dòng)子(MedberrySL,etal.,PlantCell4[2]:185-192,1992)作與上述南瓜PP2基因啟動(dòng)子855bp片段構(gòu)建完全相同的構(gòu)建，所產(chǎn)生的新的植物中間表達(dá)載體命名為pBL3CG。所用的CoYMV啟動(dòng)子片段為本實(shí)驗(yàn)室吳標(biāo)(吳標(biāo)等竹節(jié)花黃斑駁病毒啟動(dòng)子的缺失分析及其功能微生物學(xué)報(bào)39卷1期1999年)所作的由原CoYMV啟動(dòng)子全長(zhǎng)1026bp5’端缺失的882bp(-87012)片段。上述兩種構(gòu)建體中的GUS基因和LUC基因兩個(gè)表達(dá)框架的轉(zhuǎn)錄方向皆互為相反，可以更為準(zhǔn)確地比較南瓜PP2基因啟動(dòng)子與CoYMV啟動(dòng)子的相對(duì)活性。2．植物轉(zhuǎn)化以堿變性法(J.Sambrooketal.,Molecularcloning,ALaboratoryManual,2nded,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)制備pBL3NG和pBL3CG質(zhì)粒，用液氮凍融轉(zhuǎn)化法(賈盤興，蔡金科等微生物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)北京科學(xué)出版社1992108-109)轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌LBA4404，然后以PCR和酶切篩選克隆。用葉盤法(Horsch,R.B.etal.,Science227,1229-1231,1985)將pBL3NG及pBL3CG的農(nóng)桿菌克隆分別轉(zhuǎn)化煙草(K326)，通過(guò)卡那霉素抗性篩選獲得了轉(zhuǎn)pBL3NG構(gòu)建體和轉(zhuǎn)pBL3CG構(gòu)建體的煙草再生植株各40余株。四．轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性的組織化學(xué)定位按照顧紅雅等(顧紅雅，瞿禮嘉等植物基因與分子操作1994277-278北京大學(xué)出版社)所述，取轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，葉柄和莖的切片，加入GUS染色液(15.25ml0.2mol/L的Na2HPO4、9.75ml0.2mol/L的NaH2PO4、0.25ml0.1mol/L的K3[Fe(CN)6]、0.25ml0.1mol/L的K2[Fe(CN)6])、0.5ml0.1mol/L的Na2EDTA、50mgX-Gluc[5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷]和24ml重蒸水)，在37℃保溫5-24小時(shí)。用70％乙醇在65℃脫色2小時(shí)或室溫脫色2天，解剖鏡觀察，顯微照像。染色結(jié)果(如附圖9所示)顯示，在轉(zhuǎn)南瓜PP2啟動(dòng)子與GUS融合基因煙草的莖、葉片及葉柄組織的GUS表達(dá)具有顯著的韌皮部特異性。GUS染色檢測(cè)轉(zhuǎn)pBL3NG煙草再生植株共43株，其中GUS染色陽(yáng)性的共22株，占51％。五．轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性分析1．煙草總可溶性蛋白的提取參照J(rèn)efferson等(JeffersonRA,KavanaghTA,BevenMW.EMBOJournal,1987,6:3901-3907.JeffersonRA,PlantMolecularBiologyReporter,1987,5:387～405)和Promega公司的熒光素酶分析系統(tǒng)(LuciferageAssaySystem,E1500,PromegaTeclnicalBulletin)的方法提取煙草葉片或葉脈的總可溶性蛋白取50mg煙草葉片或葉脈組織，經(jīng)液氮冷凍研磨后，加入200ul蛋白提取液(25mmol/LTris-phosphate,pH7.8,2mmol/LDTT,2mmol/L1,2-diaminocyclohexane-N,N,N′,N′-tetraaceticacid,10％glycerol和1％TritonX-100)，混勻，4℃離心(12,000rm,2min.)，取上清液即為煙草總可溶性蛋白提取液。蛋白濃度的測(cè)定采用Bio-RadProteinⅡ測(cè)定液，按廠家提供的方法進(jìn)行。2．熒光素酶(LUC)活性檢測(cè)參照Promega(TechnicalBulletin,LuciferaseAssaySystem,Cat.#E1500,Promega)的方法，取1ul步驟1中制備的蛋白提取液加入含有50ul反應(yīng)底物的Eppendorf管中，24℃反應(yīng)10秒，立即在液閃計(jì)數(shù)器(LKB1209型)中測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，記錄每分鐘產(chǎn)生的熒光計(jì)數(shù)(countsperminute,CPM)。液閃計(jì)數(shù)器參數(shù)設(shè)定為Tritium,Windows0005-1024，時(shí)間30秒。如上所述對(duì)22株GUS染色陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行LUC活性測(cè)定，由于所得CPM數(shù)值與煙草蛋白提取液中總可溶性蛋白的含量成線性關(guān)系，故在本發(fā)明中以單位質(zhì)量的總可溶性蛋白在每分鐘產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度表征轉(zhuǎn)基因煙草的熒光素酶(LUC)活性。LUC活性單位最終確定為“熒光計(jì)數(shù)/分鐘·10皮克總可溶性蛋白”，即“counts/min..10pgtotalprotein”。3．GUS活性檢測(cè)參照顧紅雅等所述(顧紅雅，瞿禮嘉等，植物基因與分子操作，1994,275-276)，取10ul步驟1中制備的煙草葉片或葉脈的總可溶性蛋白提取液與90ulGUS反應(yīng)液(在步驟1所述蛋白提取液中加入lmmol/L4-甲基傘形酮酰-葡萄糖醛酸苷，即4-MUG和10mmol/Lβ-巰基乙醇即為GUS反應(yīng)液)混勻，在37℃保溫反應(yīng)。每一種樣品設(shè)置4個(gè)反應(yīng)時(shí)間，即分別在0′,10′,20′和30′時(shí)各加入900ul0.2mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。以0.2mol/L的Na2CO3溶液制備0.2umol/L的4-甲基傘形酮(4-MU)作為熒光標(biāo)準(zhǔn)物，使用HoeferPharmacia生物技術(shù)公司生產(chǎn)的熒光計(jì)(DyNAQuantTM200Fluorometer)在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm條件下測(cè)熒光。在正式測(cè)量之前，先用系列稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)物4-MU測(cè)量熒光值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定熒光值與4-MU濃度的線性范圍。測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，用每個(gè)樣品的測(cè)量熒光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出生成的4-MU的含量，作出不同時(shí)間對(duì)應(yīng)于4-MU的函數(shù)曲線，求出每分鐘生成的4-MU的含量，再除以每個(gè)樣品的總可溶性蛋白量，即為GUS活性，最后單位為“4-MUpmol./min..mgtotalprotein”。如上所述測(cè)得的GUS活性數(shù)值除以步驟2中測(cè)量的LUC活性，得到校正的相對(duì)GUS活性數(shù)值。4．南瓜PP2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的活性按步驟3所述對(duì)22株實(shí)施例四中所述GUS染色陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBL3NG煙草進(jìn)行活性檢測(cè)，結(jié)果GUS活性最高植株為4312(4-MUpmol./min..mgtotalprotein)，最低為167(4-MUpmol./min..mgtotalprotein)，前者為后者的26倍；對(duì)13株GUS染色陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBL3CG煙草植株作GUS活性檢測(cè)，GUS活性最高植株為2384，最低為126，最高值為最低值的19倍。由上述可見，轉(zhuǎn)基因植株的株間GUS表達(dá)水平差異相當(dāng)大，這可能是由于基因構(gòu)建體整合區(qū)插入植物染色體DNA的不同位置所致。但在本發(fā)明中使用3SS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因作為內(nèi)參基因，有效地消除了位置效應(yīng)的影響。以具有最高、最低和居中GUS表達(dá)活性的各三株轉(zhuǎn)pBL3NG及轉(zhuǎn)pBL3CG植株為例，如表1所示，校正前轉(zhuǎn)pBL3NG煙草最高GUS值為最低值的26倍，校正后前者僅為后者的2.8倍；轉(zhuǎn)pBL3CG煙草最高GUS值為最低值的19倍，校正后前者僅為后者的1.9倍。顯然地，通過(guò)內(nèi)參基因的校正極大地消除了上述轉(zhuǎn)基因植株中外源基因表達(dá)水平的株間差異。表1利用LUC活性對(duì)GUS活性的校正分析<tablesid="table1"num="001"><table>轉(zhuǎn)基因植株GUS活性pmol./min..mgLUC活性counts/min..10pg校正GUS活性pmol./min..mg最大GUS值/最小GUS校正前校正后N1N2N3C1C2C34312410167238420381269.802.001.0713.1910.401.0744020515618119610126192.81.9</table></tables>注N1,N2和N3為三株轉(zhuǎn)pBL3NG基因煙草；C1,C2和C3為三株轉(zhuǎn)pBL3CG基因煙草。以上結(jié)果為每株植株測(cè)3次的平均值。對(duì)22株有GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)pBL3NG煙草及13株轉(zhuǎn)pBL3CG煙草葉片組織GUS活性進(jìn)行校正，分別計(jì)算兩者的平均值，結(jié)果前者為后者的168％?？紤]到在本發(fā)明所涉及的南瓜PP2啟動(dòng)子的韌皮部組織特異性，推測(cè)GUS活性在含有更多韌皮部細(xì)胞的葉脈組織高于葉片組織，故分別對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草葉脈和葉片組織測(cè)定了GUS活性，再以葉脈組織活性除以葉片GUS活性，結(jié)果轉(zhuǎn)pBL3NG煙草葉脈GUS活性為葉片的2-4倍，11株平均為2.6倍；轉(zhuǎn)pBL3CG煙草葉脈GUS活性為葉片的2-8倍，5株平均為5倍。葉脈組織的GUS活性高于葉片組織的結(jié)果從另一個(gè)方面反應(yīng)了南瓜PP2啟動(dòng)子和CoYMV啟動(dòng)子的韌皮部組織特異性。另外，以LUC活性校正葉脈組織GUS活性后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)南瓜PP2啟動(dòng)子855bp片段驅(qū)動(dòng)GUS基因在葉脈組織表達(dá)活性為CoYMV啟動(dòng)子882bp片段的87％。吳標(biāo)等(吳標(biāo)等竹節(jié)花黃班駁病毒啟動(dòng)子的缺失分析及其功能微生物學(xué)報(bào)39卷1期1999年2月)的研究結(jié)果表明，CoYMV啟動(dòng)子882bp片段(-870～+12)驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草葉脈組織表達(dá)活性為35S啟動(dòng)子的70％左右，但考慮到韌皮部細(xì)胞占葉脈總細(xì)胞量的比例不超過(guò)10％，認(rèn)為在韌皮部CoYMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)活性可能會(huì)與35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)活性相當(dāng)或更高，CoYMV啟動(dòng)子在韌皮部是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，由前述可知在葉脈組織南瓜PP2啟動(dòng)子855bp片段驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)活性為CoYMV啟動(dòng)子882bp片段的87％，兩者相差僅13％，故發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明所涉及的南瓜PP2啟動(dòng)子855bp片段也應(yīng)是一個(gè)韌皮部組織特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子。六．轉(zhuǎn)基因煙草的Southern分析由實(shí)施例三步驟1所產(chǎn)生的兩種基因構(gòu)建體pBL3NG和pBL3CG，在其約8.7kb整合區(qū)所含有的GUS基因表達(dá)框架的5’端有-個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，如果用HindⅢ酶解轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA，然后進(jìn)行Southern雜交分析，可以鑒定目的基因是否整合進(jìn)煙草基因組以及整合的拷貝數(shù)情況。按實(shí)施例一步驟1中所述方法制備轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA約30ug，以HindⅢ按如下條件進(jìn)行酶解在500ul反應(yīng)體系中含有30ug基因組DNA、50ul酶解緩沖液(10×)、20ulHindⅢ酶(200units)及2ul無(wú)DNA酶的RNA酶(20ug)，加無(wú)菌重蒸水至終體積為500ul；37℃酶解24小時(shí)后再補(bǔ)加5ulHindⅢ酶(50units)繼續(xù)酶解10小時(shí)。取5ul酶解物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢查，DNA酶解很好。酒精沉淀上述HindⅢ酶解后的DNA，重新溶解到40ulTE(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)里,在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以由HindⅢ和BamHⅠ酶解pBI221質(zhì)粒所產(chǎn)生并回收純化的含有GUS基因的4.7kb片段(命名為“4.7H/B”)10ng和用BamHⅠ及SacⅠ酶解pBI221質(zhì)粒所產(chǎn)生并回收純化的GUS基因編碼區(qū)1.8kb片段(命名為“GUS1.8f”)5ng作為陽(yáng)性對(duì)照，以由HindⅢ酶解的非轉(zhuǎn)基因煙草k326的基因組DNA30ug作為陰性對(duì)照，在40V電壓下電泳12小時(shí)，然后按AmershamLIFESCIENCE公司的雜交尼龍膜操作說(shuō)明(HybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)對(duì)膠進(jìn)行處理以200ml0.25mol/L鹽酸凈化處理膠兩次，每次15分鐘，然后以蒸餾水洗膠30秒；以200ml堿變性溶液(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl)變性處理膠兩次，每次20分鐘，然后蒸餾水洗膠30秒；以200ml中和溶液(0.5mol/LTris-HCl,pH7.2,1.5mol/LNaCl和1.0mmol/LEDTA)處理膠兩次，每次20分鐘，最后再以蒸餾水洗30秒，接著進(jìn)行DNA真空轉(zhuǎn)膜。使用HYBAID公司的真空轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，在40V真空泵電壓下以20×SSC(0.3mol/檸檬酸鈉、3.0mol/L氯化鈉，pH7.0)作轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移DNA2小時(shí)。關(guān)掉真空轉(zhuǎn)膜儀，將膠移下進(jìn)行EB染色，紫外燈下檢查膠中的DNA已轉(zhuǎn)移干凈。以2×SSC溶液洗膜10秒，放濾紙上室溫晾干(30分鐘)后，用美國(guó)SanGobriel公司的紫外交聯(lián)儀(CL-1000ULTRAVIOLETCROSSLINKER,CA91778)進(jìn)行處理，設(shè)定條件能量參數(shù)1200，時(shí)間2分鐘，共處理2次。使用寶靈曼公司的隨機(jī)引物DNA標(biāo)記盒(Cat.No.1004760)，以隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記雜交探針，步驟為取前述的GUS1.8f片段25ng作為模板，100℃變性5分鐘，冰上驟冷后加入含有1uldATP(0.5mmol/L)、1uldGTP(0.5mmol/L)、1uldTTP(0.5mmol/L)、50uCi[α-32P]dCTP、2ul隨機(jī)引物、1ulklenow酶(lunit)溶液和重蒸水若干微升補(bǔ)足剩余體積的20ul標(biāo)記反應(yīng)體系中，混勻，37℃標(biāo)記反應(yīng)1小時(shí)。按AmershamLIFESCIENCE公司的雜交尼龍膜操作說(shuō)明(NybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)中的雜交程序進(jìn)行雜交，步驟為將膜放入雜交杯中，加入25ml預(yù)雜交液(6.25ml20×SSC、2.5ml50×Denhardt′溶液、6.25ml2％SDS、500微克經(jīng)超聲處理并在100℃變性5分鐘后再冰上驟冷的魚精DNA和重蒸水若干毫升定容至25ml)，使用HYBAID公司的MIDIDUAL14雜交箱，65℃預(yù)雜交1小時(shí)；將標(biāo)記好的探針在100℃變性5分鐘，冰上驟冷，加入到雜交液中，65℃雜交16小時(shí)。雜交完畢后洗膜，步驟為以40ml溶液Ⅰ(2xSSC,0.1％SDS)在室溫洗2次，每次10分鐘；用40ml溶液Ⅱ(1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分鐘；用40ml溶液Ⅲ(0.1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分鐘。用同位素探測(cè)器檢查雜交膜放射性，如果背景放射性過(guò)高則再以溶液Ⅲ在65℃洗膜直至背景放射性低于50CPM。取出濾膜于紙巾上吸去大部分液體，用保鮮膜包好，放入曝光夾中壓上X光片(Bio-Rad公司產(chǎn)品，貨號(hào)170-7320)及增感屏，置于-70℃曝光12-36小時(shí)。對(duì)X光片進(jìn)行顯影、定影后得到了Southern雜交的陽(yáng)性結(jié)果(如附圖10所示)。Southern雜交結(jié)果證明，經(jīng)GUS染色和GUS活性檢測(cè)均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pBL3NG煙草植株和轉(zhuǎn)pBL3CG煙草植株的基因組DNA中均含有與探針特異雜交的GUS基因片段，且皆為單拷貝，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA中未檢測(cè)到上述片段?？傊?，本發(fā)明克隆的南瓜PP2基因啟動(dòng)子序列，與報(bào)告基因融合構(gòu)建成植物表達(dá)中間載體后，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，證明該啟動(dòng)子序列能夠驅(qū)動(dòng)目的基因編碼區(qū)的核苷酸序列在植物韌皮部高效、特異地表達(dá)，該啟動(dòng)子可用于植物的抗蟲、抗病等基因工程的研究和開發(fā)利用。權(quán)利要求1．一種新克隆的編碼植物韌皮部蛋白的基因的啟動(dòng)子，其特征在于選自下列的蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子的核苷酸-1078至+37的1115bp序列。-1078GCTGCCTAAAAGTGCAACCCCATATCTACTTGGGTGATTT-1038AAATTAGTTAAATGTATATTTGGATATGTTATGACATATA-998AATATAATTTAAATAAGTTATATCTTAACAAATTAGATAC-958ATTCGACTCATATTCTTGTAAATAAGACTATTGGATGAGT-918CAAAAAGCATCTTGTCTGTCTATGGGAATTCTCCCTAAAT-878ATTTTTTCTAATTTATTAAAAAATTTCTTTAGAGATTTTT-838ACAAACCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAGC-798TAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTCT-758TATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAAT-718AAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATAA-678AGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTTG-638ATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACAT-598CGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATCA-558CATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAAG-518CTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAATA-478GTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAAT-438AAAAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAAAT-398AAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACAA-358AATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGATA-318TACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTTT-278TTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTACA-238AATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTTT-198CAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAAT-158ACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTTC-118ATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACAA-78TTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAGG+1-38GGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCAT+3ATCACAATTCAGTTCATAAAAAGGAAGACACTATA+372．根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于其中所包含的855bp核苷酸序列片段完全足以驅(qū)動(dòng)外源基因編碼區(qū)的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物的韌皮部組織特異性表達(dá)。-839AAGCTTCCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAG-799CTAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTC-759TTATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAA-719TAAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATA-679AAGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTT-639GATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACA-599TCGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATC-559ACATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAA-519GCTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAAT-479AGTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAA-439TAAATAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAA-399AAAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACA-359AAATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGAT-319ATACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTT-279TTTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTAC-239AAATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTT-199TCAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAA-159TACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTT-119CATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACA-79ATTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAG-39GGGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCA+1+2TATCACACGGGATCC+163．重組質(zhì)粒，其特征在于含有權(quán)利要求1和2所述的核苷酸序列的全部或部分片段與所需目的基因的編碼區(qū)核苷酸序列相連接。4．能在植物韌皮部組織特異表達(dá)的一組重組質(zhì)粒，它們含有權(quán)利要求1,2和3所述的核苷酸序列的全部或部分片段。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，它們是pBNG和pBL3NG。6．兩種重組微生物，是由權(quán)利要求5所述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化微生物所獲得的。7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，其特征在于所述微生物是大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)DH5α。8．重組微生物，含有權(quán)利要求4和5所述的質(zhì)粒。9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組微生物，其中所述重組微生物是土壤農(nóng)桿菌。10．根據(jù)權(quán)利要求8和9所述的土壤農(nóng)桿菌，其特征在于可應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化。全文摘要本發(fā)明提供了采用基因組DNA步移法克隆的南瓜韌皮部蛋白2(PP2)基因啟動(dòng)子的序列;包含所述的DNA序列與GUS報(bào)告基因的融合基因構(gòu)建體;用所說(shuō)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物外植體所產(chǎn)生的在韌皮部組織特異性高效表達(dá)GUS轉(zhuǎn)基因的植株。文檔編號(hào)C12N15/63GK1302891SQ9912189公開日2001年7月11日申請(qǐng)日期1999年10月22日優(yōu)先權(quán)日1999年10月22日發(fā)明者田穎川,袁正強(qiáng)申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所