專利名稱：人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸－細(xì)胞色素b5還原酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—細(xì)胞色素b5還原酶(human NADH-cytochrome b5 reductase，簡(jiǎn)稱為humNCb5Rh)的cDNA序列，該蛋白是NCb5R家族的成員。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)—細(xì)胞色素b5(cytb5)還原酶(NADH-cytochrom b5 reductare，NCb5R)是細(xì)胞微粒體中電子傳遞體系成員之一。以黃素腺嘌呤核苷酸(FMN)為輔基，催化細(xì)胞色素b5的還原反應(yīng)，參與體內(nèi)重要合成反應(yīng)如不飽和脂肪的形成，7-脫氫膽固醇的合成，還參與高鐵血紅蛋白的還原而調(diào)節(jié)O2的運(yùn)輸?shù)戎匾砉δ堋Ｔ撁赣梢粋€(gè)大的親水性催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小的疏水性膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成(Spatz，L.et al，J.Biol.Chem.248793-799，1973)。
根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)分布不同將NCb5R分為兩種類型一種是分布于紅細(xì)胞質(zhì)中的可溶解型，主要參與紅細(xì)胞高鐵血紅蛋白的還原反應(yīng)(Hultquist，D.E.，et al.Nature New Biol.299252-254，1971)；另一種是與胞質(zhì)膜相結(jié)合的膜結(jié)合型，主要參與脂肪酸的延長(zhǎng)及脫飽和(Oshino，N.，et al.J.Biochem.69155-167，1971；Keyes，S.R.，et al.J.Biol.Chem.25511357-11364)、膽固醇的生物合成(Reddy.V.V.R.，etal.J.Biol.Chem.2522797-2801，1977)、抗自由基、和藥物代謝過程中的氧化還原反應(yīng)(Hildebrandt，A.，et al.Arch.Biochem.Biophys.14366-79，1971)。
已確認(rèn)NADH-cytb5還原酶基因是遺傳型高鐵血紅蛋白血癥的候選基因。I型NCb5R缺陷的特點(diǎn)是紅細(xì)胞中NCb5R缺陷而導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥，引起發(fā)紺(Scott，E.M.et al.Biochem.Biophys.Acta.34584，1959)；II型NCb5R缺陷的特點(diǎn)是所有細(xì)胞中NCb5R缺陷，引起高鐵血紅蛋白血癥，并伴隨智力底下(Lerou，A.，et al.Nature 258619，1975)；III型NCb5R缺陷的特點(diǎn)是白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞中NCb5R缺陷，引起的高鐵血紅蛋白血癥但并不伴隨智力底下(Tanishima.K.，et al.Blood 661288-1291，1985)。
1989年，人NCb5R的cDNA序列及基因組序列通過酶切圖譜及測(cè)序等方法獲得(Shunji.T.et al.Gene 80353-361，1989)。鼠的NCb5R的cDNA和基因組序列是以人NCb5R的cDNA為探針，從鼠的肝cDNA文庫(kù)中克隆獲得(Shuhei.Z.，et al.J.Biochem.107810-816，1990)。其它物種如牛等的NCb5R的全部或部分DNA或氨基酸序列也有報(bào)道。
然而，在本發(fā)明之前還沒有報(bào)道過本發(fā)明的新的人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—細(xì)胞色素b5還原酶或其編碼序列。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—細(xì)胞色素b5還原酶，它是NCb5R家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的NCb5R家族成員被命名為人humNCb5Rh。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的NCb5R家族成員，該蛋白被命名為人humNCb5Rh蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的NCb5R多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的NCb5R核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人humNCb5Rh蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的方法，該方法包括
(a)將編碼具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人humNCb5Rh蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人humNCb5Rh蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人humNCb5Rh蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為1633個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于39-956位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人humNCb5Rh蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中39-956位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框39-956位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中39-956位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人humNCb5Rh相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人humNCb5Rh蛋白多肽”指具有人humNCb5Rh蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人humNCb5Rh相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人humNCb5Rh蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人humNCb5Rh DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人humNCb5Rh多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人humNCb5Rh多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人humNCb5Rh多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人humNCb5Rh多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人humNCb5Rh蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人humNCb5Rh多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人humNCb5Rh保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表 1
本發(fā)明還包括人humNCb5Rh多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人humNCb5Rh的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人humNCb5Rh多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人humNCb5Rh的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人humNCb5Rh核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人humNCb5Rh多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人humNCb5RhDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人humNCb5Rh基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人humNCb5Rh基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人humNCb5Rh蛋白的分子，也包括那些并不影響人humNCb5Rh蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人humNCb5Rh基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人humNCb5Rh基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人humNCb5Rh或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人humNCb5Rh功能的抗體以及不影響人humNCb5Rh功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人humNCb5Rh基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人humNCb5Rh基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人humNCb5Rh核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列。通常，可先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人humNCb5Rh的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人體心、腦、胎盤、肝、腎、骨髓、骨骼肌、外周血白細(xì)胞和睪丸等組織的cDNA分子庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物—A 5′-GTTCGCTGCAGTTGTTCCCCATC-3′為正向引物，寡核苷酸B5′-TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG-3′為反向引物，進(jìn)行PCR，順利地?cái)U(kuò)增出446bp的片段。以該446bp片段為探針，對(duì)睪丸cDNA文庫(kù)進(jìn)行初、復(fù)篩后，我們獲得了7個(gè)克隆。其中，插入片段為1.6kb的克隆3個(gè)，1.2kb的克隆4個(gè)。經(jīng)系列缺失、雙向測(cè)序及拼接后，我們獲得了一個(gè)1633bp的全長(zhǎng)cDNA順序(SEQID NO.3)。
因?yàn)閔umNCb5Rh與不飽和脂肪酸氧化、藥物代謝及細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，因此對(duì)于生物體來說具有重要的生物學(xué)意義。此外，由于本發(fā)明的humNCb5Rh具有源自人的天然氨基酸序列，因此，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有高活性和低副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性很低或沒有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人humNCb5Rh蛋白與人NCB5R(SP|P00387)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人humNCb5Rh的cDNA序列的克隆和測(cè)定1、引物擴(kuò)增以人體心、腦、胎盤、肝、腎、骨髓、骨骼肌、外周血白細(xì)胞和睪丸等組織的cDNA分子庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物—A5′-GTTCGCTGCAGTTGTTCCCCATC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B5′-TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR，PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘，結(jié)果順利地?cái)U(kuò)增出446bp片段。以該446bp序列為探針(經(jīng)α-32P標(biāo)記)，對(duì)睪丸cDNA文庫(kù)進(jìn)行初、復(fù)篩后，我們獲得了7個(gè)克隆。插入片段分別為1.6kb和1.2kb兩種，各3和4個(gè)克隆，其中3個(gè)克隆含有完整ORF。經(jīng)用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)進(jìn)行系列缺失、雙向測(cè)序及拼接后，我們獲得了一個(gè)1633bp長(zhǎng)度的cDNA順序，測(cè)序后得到SEQ ID NO.3的全長(zhǎng)cDNA序列，其中開放閱讀框?yàn)榈?9-956位。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)基因組序列推導(dǎo)出人humNCb5Rh的氨基酸序列，共305個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
2、PCR產(chǎn)物的測(cè)序根據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)PCR引物C5’-ATGGGGATCCAGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.9)和D5’-TCAGTAGGTGAATCGCATC-3’(SEQ ID NO.10)。以人體心、腦、胎盤、肝、腎、骨髓、骨骼肌、外周血白細(xì)胞和睪丸等組織的cDNA分子庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用上述C/D引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約900bp的擴(kuò)增片段。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(EpicentreTechnologies)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得cDNA序列，共約900bp，經(jīng)比較與SEQ ID NO.3的全長(zhǎng)cDNA序列中的對(duì)應(yīng)部分相一致。
3、RH定位用于RH定位的引物與實(shí)施例1中所用的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2相同。RH細(xì)胞株DNA購(gòu)自Research Genetics公司。按G4 Panel法進(jìn)行PCR，條件為93℃變性3min，然后再以93℃1min，62℃1min，72℃1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃溫育5min。結(jié)果送Sanger center和WI處理。分析結(jié)果表明，本發(fā)明的基因定位于1pter-DIS504-NCb5Rg1--WI-9647-1qter之間，經(jīng)STS圖、遺傳圖、物理圖整合分析，最終將humNCb5Rh定位于1q23-32。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人humNCb5Rh的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平上5’端151bp-1006bp分別與人(emb|Y09501，67％)、鼠(dbj|D00636，67％)、牛(gb|M83104，66％)等有較高同源。同源蛋白比較也支持此序列的正確，在氨基酸水平上humNCB5Rh推導(dǎo)蛋白的36-305氨基酸與人(SP|P00387)(圖1)、鼠(SP|P20070)、牛(SP|P07514)等的相同性分別達(dá)到64％、63％、64％，陽(yáng)性率都高達(dá)80％以上。
在PRODOM軟件分析后，確認(rèn)humNCB5Rh推導(dǎo)蛋白具有由黃素(尼克酰胺)腺苷酸(F(N)AD)結(jié)合區(qū)及細(xì)胞色素b5還原酶催化功能域兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成的NCB5R的催化功能域。humNCB5Rh推導(dǎo)蛋白的氨基酸殘基第27位-第303位為細(xì)胞色素b5還原酶功能域，其中第176位-第290位為F(N)AD結(jié)合區(qū)，第27位-第149位為細(xì)胞色素b5還原酶催化功能域，尤其是第55，69，77，117位的四個(gè)組氨酸殘基可能是與細(xì)胞色素b5分子中的血紅素相結(jié)合的位點(diǎn)。因此，humNCB5Rh推導(dǎo)蛋白具有NADH-細(xì)胞色素b5還原酶基本分子結(jié)構(gòu)，并可能具有相似的氧化還原酶功能。
研究表明，NCB5R在人體內(nèi)主要是參與線粒體外氧化還原反應(yīng)，目前，已知NCB5R是高鐵血紅蛋白血癥的遺傳基因，且突變位點(diǎn)不同，所致臨床癥狀輕重不同而分為I、II、III型，基于體內(nèi)存在多種細(xì)胞色素b5的同源體其參與的多種生物化學(xué)反應(yīng)，體內(nèi)可能存在著NCB5R同系物。因此，本發(fā)明humNCb5Rh就是NCB5R同系物之一，是高鐵血紅蛋白血癥的候選基因。
humNCB5Rh推導(dǎo)蛋白N端有疏水性較大的肽段，因而具有與膜結(jié)合的可能，已知人、鼠等NCB5R都可與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜結(jié)合成為膜結(jié)合型，因此humNCB5Rh也可能成為膜結(jié)合型；或也可能經(jīng)蛋白質(zhì)加工后，去掉疏水肽段而成溶解型，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的氧化還原，使得其它類似高鐵血紅蛋白的分子如O-2、氧化脂類等重要物質(zhì)能被還原，從而解除了氧化性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒性作用。所以，humNCB5Rh可能具有不可忽視的生理作用。
另外，也有人認(rèn)為一種多見于荷蘭人家族多發(fā)性痣樣黑色素瘤與黃素蛋白類氧化還原酶類有關(guān)(Gruis.N.A.et al.Bull.Cancer 85627-30，1998)，而黃素蛋白類氧化還原酶蛋白編碼基因富集在1號(hào)染色體的1q，此區(qū)域染色體及基因的突變會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。由于humNCB5Rh定位于1號(hào)染色體1q2.3-3.2，同樣位于該富集區(qū)的附近，因此本發(fā)明humNCB5Rh很可能與這類疾病相關(guān)。
最近，有人發(fā)現(xiàn)，在非O2感受性還原反應(yīng)中，NADH-Cytb5還原酶參與對(duì)毒性物質(zhì)的還原，通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中NCB5R酶活性，發(fā)現(xiàn)一些肝癌細(xì)胞株(Zoeller.R.A.et al. Lipids 19488-91，1984)及腦瘤(Rampling.R.et al.Int.J.Radiat.Onco.Biol.Phys.29427-431，1994)中NCB5R活性很低，提示NCB5R可能在腫瘤的發(fā)生中有作用。因此本發(fā)明humNCB5Rh也可能在腫瘤的發(fā)生中有作用。另外，由于有研究表明絲裂霉素C的生物還原需要NCb5R參與(Mikami.K.etal.Gan To Kagaku Ryoho 241606-10，1997)才能發(fā)揮抗腫瘤作用，提示不能用絲裂霉素C等藥物來治療這類NCB5R酶活性很低的腫瘤。也就是說，本發(fā)明humNCb5Rh有用于抗腫瘤藥物的篩選的前景。
本發(fā)明的人humNCb5Rh除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人humNCb5Rh還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人humNCb5Rh的N端與鼠NCb5R的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人humNCb5Rh的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人humNCb5Rh核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人humNCb5Rh的表達(dá)水平或者抑制人humNCb5Rh的過度表達(dá)。本發(fā)明的人humNCb5Rh蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人humNCb5Rh缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人humNCb5Rh在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中含有ORF的陽(yáng)性克隆或以人體心、腦、胎盤、肝、腎、骨髓、骨骼肌、外周血白細(xì)胞和睪丸等組織的cDNA分子庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人humNCb5Rh cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGTCGAC ATGGGGATCC AGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人humNCb5Rh編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGAAGCTT TCAGTAGGTG AATCGCATC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人humNCb5Rh的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，PstI酶切驗(yàn)證人humNCb5Rh的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人humNCb5Rh。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人humNCb5Rh?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約39KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人humNCb5Rh在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中含有ORF的陽(yáng)性克隆或以人體心、腦、胎盤、肝、腎、骨髓、骨骼肌、外周血白細(xì)胞和睪丸等組織的cDNA分子庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人humNCb5Rh cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTT ATGGGGATCC AGACGAGCC-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人humNCb5Rh編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-TTGGGAATTC TCAGTAGGTG AATCGCATC-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人humNCb5Rh的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，PstI測(cè)序驗(yàn)證人humNCb5Rh的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTrisáHCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM TrisáHCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為39kDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人humNCb5Rh基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白特異性地發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸—細(xì)胞色素b5還原酶及其編碼序列(iii)序列數(shù)目10(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GTTCGCTGCA GTTGTTCCCC ATC 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TGCCATCTCC ATAAGACCAC CTCTG25(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1633bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3GTCGGCTTGT CAGGTGGTGG AGGAAAAGGC GCTCCGTCAT GGGGATCCAG ACGAGCCCCG 60TCCTGCTGGC CTCCCTGGGG GTGGGGCTGG TCACTCTGCT CGGCCTGGCT GTGGGCTCCT 120ACTTGGTTCG GAGGTCCCGC CGGCCTCAGG TCACTCTCCT GGACCCCAAT GAAAAGTACC 180TGCTACGACT GCTAGACAAG ACGACTGTGA GCCACAACAC CAAGAGGTTC CGCTTTGCCC 240TGCCCACCGC CCACCACACT CTGGGGCTGC CTGTGGGCAA ACATATCTAC CTCTCCACCC 300GAATTGATGG CAGCCTGGTC ATCAGGCCAT ACACTCCTGT CACCAGTGAT GAGGATCAAG 360GCTATGTGGA TCTTGTCATC AAGGTCTACC TGAAGGGTGT GCACCCCAAA TTTCCTGAGG 420GAGGGAAGAT GTCTCAGTAC CTGGATAGCC TGAAGGTTGG GGATGTGGTG GAGTTTCGGG 480GGCCAAGCGG GTTGCTCACT TACACTGGAA AAGGGCATTT TAACATTCAG CCCAACAAGA 540AATCTCCACC AGAACCCCGA GTGGCGAAGA AACTGGGAAT GATTGCCGGC GGGACAGGAA 600TCACCCCAAT GCTACAGCTG ATCCGGGCCA TCCTGAAAGT CCCTGAAGAT CCAACCCAGT 660GCTTTCTGCT TTTTGCCAAC CAGACAGAAA AGGATATCAT CTTGCGGGAG GACTTAGAGG 720AACTGCAGGC CCGCTATCCC AATCGCTTTA AGCTCTGGTT CACTCTGGAT CATCCCCCAA 780AAGATTGGGC CTACAGCAAG GGCTTTGTGA CTGCCGACAT GATCCGGGAA CACCTGCCCG 840CTCCAGGGGA TGATGTGCTG GTACTGCTTT GTGGGCCACC CCCAATGGTG CAGCTGGCCT 900GCCATCCCAA CTTGGACAAA CTGGGCTACT CACAAAAGAT GCGATTCACC TACTGAGCAT 960CCTCCAGCTT CCCTGGTGCT GTTCGCTGCA GTTGTTCCCC ATCAGTACTC AAGCACTATA 1020AGCCTTAGAT TCCTTTCCTC AGAGTTTCAG GTTTTTTCAG TTACATCTAG AGCTGAAATC 1080TGGATAGTAC CTGCAGGAAC AATATTCCTG TAGCCATGGA AGAGGGCCAA GGCTCAGTCA 140CTCCTTGGAT GGCCTCCTAA ATCTCCCCGT GGCAACAGGT CCAGGAGAGG CCCATGGAGC 1200AGTCTCTTCC ATGGAGTAAG AAGGAAGGGA GCATGTACGC TTGGTCCAAG ATTGGCTAGT 1260TCCTTGATAG CATCTTACTC TCACCTTCTT TGTGTCTGTG ATGAAAGGAA CAGTCTGTGC 1320AATGGGTTTT ACTTAAACTT CACTGTTCAA CCTATGAGCA AATCTGTATG TGTGAGTATA 1380AGTTGAGCAT AGCATACTTC CAGAGGTGGT CTTATGGAGA TGGCAAGAAA GGAGGAAATG 1440ATTTCTTCAG ATCTCAAAGG AGTCTGAAAT ATCATATTTC TGTGTGTGTC TCTCTCAGCC 1500CCTGCCCAGG CTAGAGGGAA ACAGCTACTG ATAATCGAAA ACTGCTGTTT GTGGCAGGAA 1560CCCCTGGCTG TGCAAATAAA NTGGCTGAGG CCCCTGTGTG ATATTGAAAA AAAAAAAAAA 1620AGTCGAGCAA AAA 1633(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度305個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Gly Ile Gln Thr Ser Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu Gly Val 15Gly Leu Val Thr Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Ser Tyr Leu Val 30Arg Arg Ser Arg Arg Pro Gln Val Thr Leu Leu Asp Pro Asn Glu 45Lys Tyr Leu Leu Arg Leu Leu Asp Lys Thr Thr Val Ser His Asn 60Thr Lys Arg Phe Arg Phe Ala Leu Pro Thr Ala His His Thr Leu 75Gly Leu Pro Val Gly Lys His Ile Tyr Leu Ser Thr Arg Ile Asp 90Gly Ser Leu Val Ile Arg Pro Tyr Thr Pro Val Thr Ser Asp Glu 105Asp Gln Gly Tyr Val Asp Leu Val Ile Lys Val Tyr Leu Lys Gly 120Val His Pro Lys Phe Pro Glu Gly Gly Lys Met Ser Gln Tyr Leu 135Asp Ser Leu Lys Val Gly Asp Val Val Glu Phe Arg Gly Pro Ser 150Gly Leu Leu Thr Tyr Thr Gly Lys Gly His Phe Ash Ile Gln Pro 165Asn Lys Lys Ser Pro Pro Glu Pro Arg Val Ala Lys Lys Leu Gly 180Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Met Leu Gln Leu Ile 195Arg Ala Ile Leu Lys Val Pro Glu Asp Pro Thr Gln Cys Phe Leu 210Leu Phe Ala Asn Gln Thr Glu Lys Asp Ile Ile Leu Arg Glu Asp 225Leu Glu Glu Leu Gln Ala Arg Tyr Pro Asn Arg Phe Lys Leu Trp 240Phe Thr Leu Asp His Pro Pro Lys Asp Trp Ala Tyr Ser Lys Gly 255Phe Val Thr Ala Asp Met Ile Arg Glu His Leu Pro Ala Pro Gly 270Asp Asp Val Leu Val Leu Leu Cys Gly Pro Pro Pro Met Val Gln 285Leu Ala Cys His Pro Asn Leu Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gln Lys 300Met Arg Phe Thr Tyr 305(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGGGATCC AGACGAGCC29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCAGTAGGTG AATCGCATC29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGGGATCC AGACGAGCC29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCAGTAGGTG AATCGCATC29(2)SEQ ID NO.9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.9ATGGGGATCC AGACGAGCC 19(2)SEQ ID NO.10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.10TCAGTAGGTG AATCGCATC 19
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列。
4.一種分離的人humNCb5Rh蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人humNCb5Rh蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸39-956位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人humNCb5Rh蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人humNCb5Rh蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人humNCb5Rh蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的人humNCb5Rh蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人還原型尼克酰胺腺嘌呤核苷酸－細(xì)胞包素b5還原酶(human NADH-cytochrome b5 reductase,簡(jiǎn)稱為humNCb5Rh)的cDNA序列,該序列編碼的蛋白是NCb5R家族的成員。本發(fā)明還提供了由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1276380SQ9910830
公開日2000年12月13日 申請(qǐng)日期1999年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日
發(fā)明者余龍, 屠強(qiáng), 張宏來, 趙勇, 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)