專利名稱：：用腈水解酶制備2－羥基－4－甲硫基丁酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(HMTBA)和/或其銨鹽(HMTBS)的一種新制備方法。長期以來2-羥基-4-(甲硫基)丁酸和其鹽已代替甲硫氨酸用于動物飼料。與甲硫氨酸相比，其優(yōu)點是呈液態(tài)，便于食品生產(chǎn)商的利用。通過化學途徑制備2-羥基-4-(甲硫基)丁酸是人們長久以來已知的。例如可舉出專利EP142488、EP-143000，其中描述了一種水解2-羥基-4-甲硫基羥丁腈(HMTBN)的兩步法。第一步是將2-羥基-4-甲硫基丁腈與強無機酸如鹽酸或硫酸接觸。第二步，用水稀釋后，升溫完全水解。然后用與水溶混性差的有機溶劑如酮(優(yōu)選甲基異丁基酮)萃取2-羥基-4-(甲硫基)丁酸，再蒸發(fā)除去溶劑。但此類方法用于工業(yè)規(guī)模存在一些缺陷。其中產(chǎn)生至少與所引入腈的摩爾量相等的硫酸銨，后者要被除去，這產(chǎn)生了與環(huán)境保護政策相違背的工業(yè)消耗。該方法還需要使用大量絕對需要回收再利用的溶劑。如在專利US3773927和4353924中描述的其他方法是用鹽酸水解2-羥基-4-甲硫基丁腈，然后濃縮介質(zhì)，分離所形成的氯化銨。所得的鹽與前述鹽一樣難以除去，另外所得的酸具有強著色現(xiàn)象。專利EP330521中也描述了甲硫基羥基丁腈的一種化學水解方法，如前述方法，該水解是在硫酸介質(zhì)中進行。用氨部分中和反應混合物，兩相分離。有機相含有大部分2-羥基-4-甲硫基丁酸，水相含有大部分所產(chǎn)生的硫酸銨。蒸發(fā)所含的水后，過濾有機溶液以回收溶解的硫酸銨。然后用少量水稀釋2-羥基-4-甲硫基丁酸，用少量硫酸穩(wěn)定化。除去水后，從水溶液可獲得可以直接出售的硫酸銨。該方法部分解決了現(xiàn)有技術關于使用有機溶劑的缺點，但沒有解決與丟棄無機鹽有關的任何問題。在與2-羥基-4-甲硫基丁酸鹽相關的專利中，可舉出涉及其鈣鹽和/或銨鹽的專利US2745745、2938053和3175000。2-羥基-4-甲硫基丁腈水解得到的混合物用氫氧化鈣或碳酸鈣處理。然后硫酸鈣沉淀并釋放出氨，后者形成2-羥基-4-甲硫基丁酸的銨鹽。這里同樣有要除去生成的硫酸鈣的問題。在專利申請WO96/01808中也描述了一種方法，同所引的第一篇現(xiàn)有技術文件中那樣進行水解和有機溶劑萃取，然后用氨中和有機溶液。與前述大部分方法一樣，該方法導致每摩爾引入的腈形成至少一摩爾的硫酸銨或氯化銨，并且必須回收大量的有機溶劑。該方法不能以有利的工業(yè)價格獲得2-羥基-4-甲硫基丁酸的銨鹽溶液。另外還在WO96/09403中描述了一種腈水解酶作為催化劑用于將腈基團水解成羧基。但在該文獻中描述的方法不能用于工業(yè)規(guī)模，因為合成這些腈水解酶的微生物活性不足。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，由于本發(fā)明的可實施多個特異步驟的方法，可以在工業(yè)規(guī)模上通過酶途徑以高收率獲得2-羥基-4-甲硫基丁酸和/或其銨鹽，而不使用溶劑且不同時產(chǎn)生無機鹽。本發(fā)明的主題是一種通過酶水解2-羥基-4-甲硫基丁腈制備2-羥基-4-甲硫基丁酸和/或其銨鹽的方法，其特征在于a)第一步，制備具有腈水解酶活性的生物材料，b)第二步，將其固定化，c)第三步，將2-羥基-4-甲硫基丁腈與如此固定化的生物材料接觸，以獲得2-羥基-4-甲硫基丁酸的銨鹽，d)第四步，必要時將c)步所得鹽轉(zhuǎn)變成相應的酸，及e)第五步，濃縮c)或d)步中所得產(chǎn)物。在以下的說明中將詳細解釋本發(fā)明，其中將參照附圖-圖1是用于非必需步驟d)的電透析池的示意圖；圖1A是有雙極膜和三個室的電透析池；圖1B是有雙極膜和兩個室的電透析池。-圖2是用于實施本發(fā)明方法的一種設備的示意圖。-圖3是質(zhì)粒pRPA-BCAT1至5的限制性酶切圖譜。-圖4是含編碼本發(fā)明腈水解酶活性多肽的DNA序列(圖中稱為nitB)的1130pb片段的測序策略。圖中數(shù)字及M13FWD和M13REV代表用于測序的引物。-圖5是質(zhì)粒pRPA-BCAT12和pRPA-BCAT13的限制性酶切圖譜。-圖6表示在10％SDS-PAGE凝膠上的電泳，表明本發(fā)明DNA序列在菌株大腸桿菌BL21(DE3)/pRPA-BCAT12、BL21(DE3)/pRPA-BCTA13、BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231、BL21(DE3)/pRPA-BCAT13+pXL2231中的表達。每個泳道相應于10μg量的可溶性蛋白和相當體積的粗提物和不溶物。-圖7表示在10％SDS-PAGE凝膠上的電泳，表明本發(fā)明DNA序列在菌株大腸桿菌DH5α/pRPA-BCAT3、DH5α/pRPA-BCAT6、DH5α/pRPA-BCAT6+pXL2035、RPA-BIOCAT76中的表達。每個泳道相應于10μg量的可溶性蛋白和相當體積的粗提物和不溶物。-圖8是質(zhì)粒pRPA-BCAT14的限制性酶切圖譜。-圖9表示在10％SDS-PA凝膠上的電泳，表明本發(fā)明DNA序列在菌株惡臭假單胞菌G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)、糞產(chǎn)堿菌ATCC8750(pRPA-BCAT14)、糞產(chǎn)堿菌ATCC8750(pRPA-BCAT23)、糞產(chǎn)堿菌ATCC8750(pRPA-BCAT24)中的表達。每個泳道相應于10μg量的可溶性蛋白和相當體積的粗提物和不溶物。-圖10是質(zhì)粒pCGL1087的限制性酶切圖譜。-圖11是質(zhì)粒pOS48.7的限制性酶切圖譜。第一步是制備具有腈水解酶活性的生物材料。這種生物材料可以是酶本身的溶液或具有腈水解酶活性的完整或破碎的細胞。有利的是使用表達一種腈水解酶的微生物。這種腈水解酶特別來自一種微生物，尤其是產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、紅球菌屬(Rhodococcus)、或Gordona屬的微生物，特別是糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)、紅球菌HT29-7、Gordonaterre，優(yōu)選WO96/09403中描述的菌株。有利的是使用如下獲得的表達腈水解酶活性的微生物將親代微生物編碼腈水解酶的遺傳信息轉(zhuǎn)移至宿主微生物中。特別在大腸桿菌中，可以利用陪伴蛋白GroESL的共表達來改善重組菌株的性能。為此，可以使用任何適當?shù)谋磉_載體，特別是質(zhì)粒載體。此時所使用的核苷酸序列將被置于允許其在細胞宿主中表達的信號控制之下。所用的細胞宿主可選自原核系統(tǒng)，如革蘭氏陽性或陰性菌，或真核系統(tǒng)，如酵母、真菌，或其他系統(tǒng)?？刂贫嚯谋磉_的信號根據(jù)所用的細胞宿主選擇。為此，編碼腈水解酶的DNA可插入在所選宿主中自主復制的載體中，或所選宿主的整合性載體中。這些載體按本領域技術人員常用的方法制備，并用標準方法如電穿孔將生成的構建體引入適當?shù)乃拗髦?。作為微生物宿主，特別可以舉出糞產(chǎn)堿菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、大腸桿菌(Escherichiacoli)或芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)的微生物。用于大腸桿菌中表達的優(yōu)選載體是質(zhì)粒pRPA-BCAT6。本方法的第二步是將生物材料固定化。這種固定化有利地在一種固體載體存在下進行，使得能夠得到其大小、形狀和機械抗性可控制的顆粒。該步中還可以同時使用聚氮雜環(huán)丁烷聚合物和其他交聯(lián)劑。該固定化方法可以使用完整的或通透化的細胞。還可以應用無細胞的酶溶液。用于固定化的酶是腈水解酶。固定化方法是通過化學試劑與生物材料和載體的胺官能團(NH2,NH)、羧基(COOH)、羥基(OH)、巰基(SH)或酰胺(CONH2)反應將活性生物材料固定在固體載體上，固體載體的粒度特別為1μM-3mm，優(yōu)選10μM-2mm。這些化學試劑還可以使生物材料和載體變得在水中不溶。所得的物團很有可塑性(maleable)，可成形以獲得具有理想形狀和大小的顆粒。然后通過干燥獲得這些顆粒的內(nèi)聚力和硬度。待固定的生物材料可以任選性地另外含有0～200％(重量)的無活性生物材料。這些無活性的生物材料可以是蛋白質(zhì)(白蛋白、明膠)或多糖(脫乙酰殼多糖、k-角叉菜膠、藻酸)。用于在其上沉集生物材料和聚合物的隋性載體可以是有機或無機的、多孔或無孔的、親水或疏水的顆粒。在這些顆粒中，可以非限制性地舉出-離子交換樹脂，-氧化鋁，-合成二氧化硅或硅藻類及硅膠，-沸石，-炭，-在水中不溶的蛋白質(zhì)，如谷蛋白，-多糖，如淀粉。隋性載體可以以生物材料的0.01～500％(重量)，優(yōu)選10～200％的比例加入。用于固定生物材料的化學試劑可以是與官能團胺(NH2,NH)、羧基(COOH)、羥基(OH)、巰基(SH)、酰胺(CONH2)反應的雙官能團聚合物或分子?？膳e出-聚氮雜環(huán)丁烷聚合物，-聚乙烯亞胺聚合物，-異氰酸酯聚合物，-藻酸鹽膠體，-k-角叉菜膠，-諸如六亞甲基二胺的胺，-諸如戊二醛的醛，-諸如己二酸的羧酸，及-異氰酸酯。固定化方法可以使用這些化學試劑中的一種或多種?；瘜W試劑按生物材料和載體的1～50％(重量)的濃度加入。優(yōu)選的是在5～30％(重量)之間，以獲得足夠堅固、保留大部分活性并且不帶來太多內(nèi)部擴散問題的顆粒。交聯(lián)處理的持續(xù)時間為0.5～24小時。該方法的溫度一般在4～65℃。優(yōu)選的溫度在20～40℃。所采用的固定化溫度很大程度上還取決于所用生物材料的穩(wěn)定性。固定化期間的pH保持在5～11。優(yōu)選的pH在6～10，更優(yōu)選偏堿的pH。還要根據(jù)生物材料的耐受性選擇pH值，本領域技術人員易于確定這種pH。這種生物催化劑的成形應適于其在任何系統(tǒng)中的應用，如在固定床中。一種成形方法是擠出。為此，加入一種或多種化學試劑交聯(lián)生物材料和載體。處理后，過濾回收不溶性物質(zhì)，或絮凝后過濾收集。優(yōu)選干物質(zhì)的百分率為至少10％。然后將該物團擠出。通過這種方法，優(yōu)選得到直徑0.3～0.5mm，長1～10mm的細長絲。這些細長絲然后可制成球狀。然后干燥所得顆粒。成形的另一方法是噴霧包衣。為此，將生物材料與一種或多種化學試劑混合。反應后，將混合物噴霧于載體上形成一薄層。通過這種方法，可得到平均直徑0.1～2mm的顆粒。所得的顆粒然后可視情況浸入還原劑的溶液中，如硼氫化鈉，以還原在交聯(lián)中形成的亞胺官能團。所得的顆粒足夠堅固并耐磨耗，以便用于固定床、流化床或帶攪拌的反應器中。本發(fā)明方法的第三步是在一個或多個柱或反應器中使用固定化的生物材料。該步驟的目的是從2-羥基-4-甲硫基丁腈連續(xù)地產(chǎn)生2-羥基-4-甲硫基丁酸的銨鹽。向該柱或反應器中提供2-羥基-4-甲硫基丁腈的純?nèi)芤夯蛳♂屓芤?，或含?-羥基-4-甲硫基丁腈和2-羥基-4-甲硫基丁酸銨鹽的混合物。該柱或反應器優(yōu)選在10-60℃間的溫度和pH5-9下進行反應。按本發(fā)明的第一種實施方式，實施系統(tǒng)可由兩個或多個相互串聯(lián)的柱組成，在第一個柱的柱頭上提供2-羥基-4-甲硫基丁腈的水溶液，而同時對其他柱供給其量以在反應混合物中的溶解度為限的2-羥基-4-甲硫基丁腈的溶液；該系統(tǒng)稱為多級系統(tǒng)。按本發(fā)明的第二種實施方式，使用在一循環(huán)環(huán)路中的一個或相互并聯(lián)的多個柱。按此系統(tǒng)，2-羥基-4-甲硫基丁腈水溶液被連續(xù)供給該回路，以保持回路中體積恒定的方式連續(xù)泵入反應介質(zhì)；該系統(tǒng)稱為環(huán)形系統(tǒng)。本發(fā)明中所用反應器的類型可以是固定床型、流動床型或連續(xù)的攪拌型。優(yōu)選使用固定床型反應器，因為它減少了固定化細胞可能遇到的磨耗問題。如果使用微生物本身，優(yōu)選使用與超濾組件偶聯(lián)的攪拌型反應器，以便以連續(xù)方式將微生物與目標產(chǎn)物分離。第四步是一個非強制性步驟，為2-羥基-4-甲硫基丁酸的銨鹽轉(zhuǎn)變成相應的酸。該步可按下列兩種方法實施-用具有兩個或三個室的電透析器進行電透析，-或加熱該水溶液，然后可進行液/液萃取。按電透析法，其中使用具有兩個或三個室的電透析器?！笆摇敝竷蓚€膜之間的空間，即一個雙極膜和一個無極膜之間或兩個相鄰的無極膜之間的空間。“池”指兩個或三個室的總和。一“堆”包含5～300個池?！半娡肝銎鳌庇梢粋€堆組成，當然包括一個陰極和一個陽極?？捎糜诒景l(fā)明的無極膜根據(jù)其制造方式分成兩大類。例如，可使用那些從離子交換樹脂制得的非均一性膜，與諸如聚氯乙烯、聚乙烯等的粘合劑混合。所形成的混合物可搽在諸如聚酯或聚丙烯腈織物的緯紗上。也可以使用通過化學或放射化學接枝將功能團引入惰性載體上而獲得的均一性膜。最常用的化學方法一般是將含有芳核(如苯乙烯/二乙烯苯或苯乙烯/丁二烯)的聚合物乳膠官能化。如此官能化的乳膠隨后可用于搽在如非均一性膜所用的緯紗上。放射化學方法一般包括在一種射線影響下將一種芳香化合物如苯乙烯接枝在惰性載體上，如聚乙烯或聚四氟乙烯膜上。然后，將芳核如在化學方法中那樣官能化。陽離子交換膜包含強酸基團(最常見的是磺酸基團)或弱酸基團(常為羧酸基團)。比較少見的是，以PO32-、HPO2-、AsO32-、SeO3-作為酸基團。陰離子交換膜包含強堿基團(最常見的是季銨基團)或弱堿基團(最常見的是胺基團)。比較少見的可用季鏻基團或锍基團作為堿性基團。在本發(fā)明的方法中，陽離子膜優(yōu)選含有強酸基團，其中優(yōu)選磺酸基團；陰離子膜優(yōu)選包含強堿性基團，其中有季銨基團。雙極膜是兩種膜(一個陽離子膜，一個陰離子膜)的組合。當該膜被置于足夠的電場中時，膜介面的溶劑化水解離成H+和OH-離子，它們分別穿過陽離子面向陰極遷移，穿過陰離子面向陽極遷移。作為雙極膜的實例，可舉出由Aqualytics、TokuyamaSoda或FuMaTech公司出售的膜。電透析器的陽極可由常規(guī)用于電透析的材料構成，例如包覆有貴金屬或貴金屬氧化物的石墨、鎳或鈦，特別是鍍鉑的鈦。陰極也可以由常規(guī)用于電透析的材料構成，例如石墨、不銹鋼或鎳。向電透析器中供入待處理的水溶液。還需要向陽極循環(huán)陽極電解液、向陰極循環(huán)陰極電解液。還可以使用單一電解質(zhì)溶液。在本方法中，電解質(zhì)的單一環(huán)路特別適合。電解質(zhì)溶液的作用是保證足夠的電導率。優(yōu)選，該電導率等于或大于20毫西門子/厘米(mS/cm)，但該上限不應認為對實施本方法是關鍵的。所用的電解質(zhì)是可電離的化合物，如鹽、酸或堿。電解質(zhì)優(yōu)選選自非電解活性的化合物。例如，優(yōu)選使用中性鹽如硫酸鹽、酸如硫酸、堿如氫氧化鈉。施加的電流密度一般在0.2～1.5kA/m2，優(yōu)選在0.4～1kA/m2。實施本發(fā)明方法的溫度位于與膜穩(wěn)定性相適應的范圍內(nèi)。優(yōu)選在30～60℃間的溫度下操作。電透析器可以按不同的方式運行。首先可以連續(xù)運行，待處理的溶液連續(xù)穿過“堆”；如果由于所達到處理率的需要，可以串聯(lián)設置多個階段。也可以不連續(xù)地運行，待處理的溶液在一容器中循環(huán)直到獲得所希望的處理率。最后還可以用直接通道加上部分循環(huán)來運行。按照本發(fā)明的第一種方案，可以在如圖1A所示的具有雙極膜和三個室的電透析池中進行銨鹽向2-羥基-4-(甲硫基)丁酸和氨的解離。適于實施本發(fā)明方法的電透析器由不同的室構成，這些室分別由陽離子膜(MC)、雙極膜(MB)和陰離子膜(MA)間隔而成。這些室分成鹽室(S)、堿(B)和酸(A)室，鹽室中待分離化合物逐漸減少，堿和酸室中分別濃集從鹽生成的酸和堿。銨鹽被引入在鹽室中。在電場的作用下，銨離子從其所在的室(S)出發(fā)穿過陽離子交換膜(陽離子膜)向陰極遷移，并與來自雙極膜陰離子面的OH-結合，在雙極膜中在電場的作用下進行水的解離。同時，2-羥基-4-甲硫基丁酸根離子從其所在的室(S)出發(fā)穿過陰離子交換摸(陰離子膜)向陽極遷移。在經(jīng)過下一個室(A)后，它們被來自雙極膜陽離子面的H+離子質(zhì)子化。相鄰的三個室(B)、(A)、(S)形成了一個電透析池。在本發(fā)明的第二個實施方案中，2-羥基-4-甲硫基丁酸的再生可以在如圖1B所示的具有雙極膜和兩個室的電透析池中進行。這兩個室分別由陽離子膜和雙極膜間隔而成。這些室分成鹽/酸室(S/A)和堿室(B)。將銨鹽引入在鹽/酸室中。在電場的作用下，銨離子從其所在的室(S/A)出發(fā)穿過陽離子交換膜(陽離子膜)向陰極遷移，并與來自雙極膜陰離子面的OH-離子結合，在雙極膜中在電場的作用下進行水的解離。同時，S/A室被來自雙極膜陽離子面的H+離子酸化。相鄰的兩個室(B)和(S/A)形成一個電透析池。這種形式具有耗能少和能改變所希望的鹽/酸比例的優(yōu)點。為了很好地發(fā)揮電透析器的功能，堿室(及三室形式中的酸室)的電導率應足夠，并可通過加入支持電解質(zhì)來調(diào)節(jié)。例如，氨溶液的電導率可通過加入銨鹽(如硫酸銨)來提高。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用2-羥基-4-甲硫基丁酸銨。本發(fā)明的一種可預見的具體實施方案是，在三室電透析池的鹽室中加入2-羥基-4-甲硫基丁酸銨鹽和2-羥基-4-甲硫基丁腈的混合物。鹽將如前所述被解離成2-羥基-4-甲硫基丁酸根和銨離子，前者向陽極遷移并被轉(zhuǎn)變成2-羥基-4-甲硫基丁酸，后者向陰極遷移并被轉(zhuǎn)變成氨，在鹽室中有水和未轉(zhuǎn)化的2-羥基-4-甲硫基丁腈繼續(xù)存在，并被再循環(huán)至水解柱。按照加熱方法，通過加熱富含HMTBS的水溶液使銨鹽-游離酸的平衡遷移并放出所釋放的氨，從而回收酸。這可以通過在真空下或大氣壓下加熱并加或不加汽提處理來實現(xiàn)。為了有利于平衡的遷移，可預見使用一定壓力的CO2。這樣得到HMTBA和HMTBS的混合物，按HMTBA和HMTBS的總量計，其中有5～99％的HMTBA，優(yōu)選10～50％的HMTBA。這些溶液25℃的粘度為1200～30mm2/s(1200～30cSt)，優(yōu)選為200～50mm2/s(200～50cSt)。這些水溶液可以通過用與水部分溶混或不溶混的溶劑萃取酸而被分解。存在大量的可用于這種分離的溶劑。優(yōu)選的溶劑中C5-C8的酮，特別是甲基異丁基酮；醚如異丙基醚；醇如異丙醇；酯；叔胺如三辛胺。在本發(fā)明中，優(yōu)選的溶劑是丙酮、MIBK、異丙醇、乙酸異丙酯、異丙基醚或丙基醚或THF、三辛胺。水相和有機相的比例不是關鍵。但出于效率的原因，不應低于1/1的最低比，為了收率的原因，不應超過1/3的比例。優(yōu)選為1/1.5-2.0的比例。這種萃取可以在任何類型的液/液萃取工藝中分批或連續(xù)進行。例如可以舉出共流或逆流的混合器一傾析器級聯(lián)、離心萃取器、裝填柱或塔板柱等。已減少了游離酸的水溶液可重新處理，可重復任何次，如果希望可直到徹底耗盡氨。處理有機相以分離HMTBA。這優(yōu)選經(jīng)溶劑蒸發(fā)或熱水萃取來實現(xiàn)。為避免對HMTBA可能的破壞，可以通過施加真空將熱刺激保持在最低。在這兩種銨鹽的解離方法中，都生產(chǎn)了一種氨水溶液?？商幚砗笳咭员銤饪s氨。優(yōu)選用蒸餾法，經(jīng)一步或多步在加壓或不加壓下濃縮氨?？深A見一種汽提的預處理步驟。濃縮的氨溶液可以返回到氫氰酸的合成中，后者重新在2-羥基-4-甲硫基丁腈的合成中起作用。第五步，濃縮HMTBS和/或游離酸的水溶液。這優(yōu)選通過蒸發(fā)水來實現(xiàn)。本發(fā)明還涉及用于實施本發(fā)明方法的設備。在圖2中描繪了一種這樣的設備，其包括用于向反應器3中分別導入羥基腈AMTP和水的導管1、2。反應器3是一個裝有固定化菌株或酶的循環(huán)固定床。部分溶液從反應器3中放出，并被運送至第二反應器4中。第二反應器4是裝有固定化菌株或酶的固定床。通過導管5從反應器4的出口回收富含HMTBS的溶液。該富含HMTBS的溶液根據(jù)所希望的終產(chǎn)物類型可接受兩種完全獨立的處理。如果想回收含有高比例HMTBS的產(chǎn)物，將來自導管5的溶液引入蒸發(fā)器6中，它能濃縮該產(chǎn)物并在導管8中回收一種主要由HMTBS組成并含少量游離酸的濃縮溶液。多余的水及部分氨通過導管7排出。如果想回收含有高比例游離酸的產(chǎn)物，將來自導管5的富含HMTBS的溶液引入雙極電透析系統(tǒng)9中。在此儀器中，通過電透析氨或多或少與酸分離。減少了銨的混合物收集在導管11中，然后在蒸發(fā)器12中濃縮，以獲得主要由游離酸組成并含少量或不含HMTBS的濃縮溶液。富含氨的溶液通過導管10排出。通過汽提器15回收氨。這種氨流出液可經(jīng)蒸餾器16濃縮，水收集在18中。濃縮的氨溶液17可返回HCN的合成中。下列實施例說明本發(fā)明。實施例實施例1腈水解酶的純化和氨基末端測序用四步純化了腈水解酶。純化概要示于下表1中。30℃下在含芐腈(0.5g/l)的基本培養(yǎng)基中將糞產(chǎn)堿菌細胞培養(yǎng)24小時。離心培養(yǎng)物后，將沉淀重懸在TG緩沖液(25mMTris-HCl,10％(w/v)甘油，pH7.5)中。將細胞懸液超聲處理，然后離心，以獲得粗提物。然后粗提物用硫酸銨處理直到30％的飽和度。所得沉淀重懸在TG緩沖液中，然后對2升相同緩沖液透析過夜。然后將所得溶液上樣于用TG緩沖液預平衡的QSepharoseFastFlowHR26/10陰離子交換柱上。然后用0-1MNaCl的梯度洗脫活性成分。將活性流份上樣于用TG緩沖液預平衡的MonoQHR5/5陰離子交換柱上。用0～1MNaCl的梯度洗脫腈水解酶。最后，合并含有活性的流份，將硫酸銨的濃度調(diào)至1M。然后將該溶液上樣于用加有1M硫酸銨的TG緩沖液預平衡的PhenylSuperoseHR5/5疏水作用柱上。用1M-0M的硫酸銨梯度洗脫活性成分。表1腈水解酶純化的概要<操作條件[腈]=50mM；100mM磷酸緩沖液，pH7.0；30℃。通過凝膠過濾測定蛋白質(zhì)的分子量，其為約260kDa。在SDS-PAGE凝膠上，觀察到43kDa的單一帶(純度為95％)。這可能是一種重43kDa的具有α6結構的蛋白質(zhì)。實施例2糞產(chǎn)堿菌ATCC8750腈水解酶的克隆實施例1中給出的氨基末端序列與糞產(chǎn)堿菌JM3腈水解酶的N-末端序列(Kobayashi等，1993，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:247-251)完全一致，而細菌腈水解酶的N-末端在14個殘基上有35-57％的一致性。發(fā)明人提出了這樣的假定從ATCC8750菌株純化的本發(fā)明腈水解酶與Kobayashi等(前文引述)描述的酶相同。因而克隆策略是在ATCC8750菌株的DNA基因組上用兩個按Kobayashi等(前文引述)給出的序列確定的核苷酸探針進行PCR反應，擴增該腈水解酶的基因。合成了這兩個探針，一個可與Kobayashi等(前文引述)所給序列的5’部分雜交，另一個與3’部分雜交5’部分(PCRAF1):CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC3’部分(PCRAF2):TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT引物PCRAF1含有能在起始密碼子ATG上游引入EcoRⅠ和NdeⅠ限制酶切位點的5’端12個核苷酸。引物PCRAF2能引入BamHⅠ酶切位點。按Ausubel等(分子生物學現(xiàn)代方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology),John&amp;SonsInc.Ed.2.4.1-2.4.5)描述的CTAB方法提取了糞產(chǎn)堿菌ATCC8750菌株的基因組DNA，每個PCR反應使用100ng。為了調(diào)節(jié)擴增的特異性，如Ausubel等(如上引述)所示在樣品總體積100μl中利用2.5單位TaqDNA聚合酶(PerkinElmer)試驗了不同的MgCl2濃度。在1.5mMMgCl2和5％DMSO或5％甲酰胺中進行了兩個額外的反應。設定PerkinElmer9600熱循環(huán)儀的程序如下95℃5分鐘，30個循環(huán)的(95℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)和72℃4分鐘。在0.8％瓊脂糖凝膠上分析各種擴增產(chǎn)物。在所有反應中都擴增出了具有預期大小1.15kb的主帶，但用1.5mMMgCl2和5％DMSO時特異性更高。這些條件下的反應產(chǎn)物用于下步。已用蛋白酶K處理了樣品，用苯酚-氯仿萃取后用乙醇沉淀。將沉淀重懸，在37℃與40單位EcoRⅠ酶和40單位BamHⅠ酶培養(yǎng)2小時。在0.7％瓊脂糖凝膠上遷移后，切下1.15kb的帶并提取，以按常規(guī)方法克隆在用EcoRⅠ-BamHⅠ打開的載體pBSK-(Stratagene,LaJolla，美國)中。稱為pRPA-BCAT1至5的5個獨立克隆通過質(zhì)粒DNA用NdeⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、BspMⅠ和BglⅡ酶消化進行分析(圖3)。所得圖譜與用該方法得到的具有Kobayashi等(前文引述)所述序列的質(zhì)粒的理論限制圖譜相符。XL1Blue菌株(pRPA-BCAT3)已以CBS998-96保藏在CBS。實施例3含腈水解酶活性多肽編碼DNA的1130pb片段的測序GenomeExpressS.A.公司(Grenoble，法國)已用實驗室制備的DNA制劑(kitWizzardMidi-prep,Promega)對克隆在質(zhì)粒pRPA-BCAT3中的插入片段進行了測序。該片段的測序策略示于圖4中，并按本領域技術人員已知的常規(guī)方法實現(xiàn)。根據(jù)糞產(chǎn)堿菌JM3的腈水解酶序列(Kobayashi等，前文引述)合成了10個內(nèi)部核苷酸引物(在圖4中標為623-629和681-682的標號)。全長序列用通用引物“反向”(Reverse)和“M13正向”(M13Forward)完成。每個區(qū)在每條DNA上至少被讀一次。所得序列與已公開的序列有兩處差異一個在作為轉(zhuǎn)錄終止子的假定結構中，另一個在腈水解酶的基因(稱為nitB)中，導致Asn279→Asp的替換。因而在質(zhì)粒pRPA-BCAT1、2、4、5上對這兩個區(qū)域用兩個特異性引物710和682(參見圖4)進行了實驗室測序。在所有這幾個克隆中都找到了終止子中1412位(根據(jù)Kobayashi的編號，如上引述)C→T的改變。這是一種區(qū)別這兩個糞產(chǎn)堿菌菌株的突變。1138位A→G的改變只在質(zhì)粒pRPA-BCAT3中存在。因而它是用TaqDNA聚合酶進行PCR反應時引入的一個突變。實施例4腈水解酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達為了證實帶有純化腈水解酶基因的已克隆DNA序列的正確性，按下述操作方法將nitB基因置于φ10噬菌體T7(PT7)基因的啟動子的控制之下將pRPA-BCAT3和pRPA-BCAT4的1.13kb的NdeⅠ-BamHⅠ插入片段克隆在載體pXL2432中，分別得到圖5中所示的載體pRPA-BCAT12和pRPA-BCAT13。親本載體pXL2432是質(zhì)粒pET9(Studier等，1990，酶學方法(MethodsInEnzymol.)185,60-89)AccⅠ和EcoRⅠ位點間的區(qū)域與質(zhì)粒pET11a(NovagenInc.,MadisonWI，美國)EcoRⅠ和AccⅠ位點間的區(qū)域的雜合體，前者包括復制起始區(qū)(ORI)和帶有卡那霉素抗性(Kan)的選擇標志，后者包括表達盒、抑制子lacⅠ基因和拷貝數(shù)調(diào)節(jié)子ROP基因。按以下操作方法在誘導條件下進行了培養(yǎng)在含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中(Milller,1972，分子遺傳學實驗(ExperimentsinMolecularGenetics)-冷泉港實驗室，紐約冷泉港)將含有質(zhì)粒pRPA-BCAT12的菌株BL21(DE3)(NovagenInc.,MadisonWI，美國)、含有質(zhì)粒pRPA-BCAT13的菌株BL21(DE3)及含有質(zhì)粒pXL2432的菌株BL21(DE3)于37℃培養(yǎng)16小時。然后用相同培養(yǎng)基在相同溫度下稀釋100倍。當培養(yǎng)物的OD600達到0.5～1時，加入了終濃度1mM的IPTG。培養(yǎng)6小時后收集細菌。采用相似的操作方法，在培養(yǎng)基中加入12μg/ml四環(huán)素，培養(yǎng)了含有質(zhì)粒pRPA-BCAT12和pXL2231的菌株BL21(DE3)、含有質(zhì)粒pRPA-BCAT13和pXL2231的菌株BL21(DE3)及含有質(zhì)粒pXL2432和pXL2231的菌株BL21(DE3)。從載體pXL1635(1990年4月24日的專利申請FR90/05185)衍生的質(zhì)粒pXL2231屬于IncP不相容組，因而與質(zhì)粒pRPA-BCAT12和13相容，后兩者具有質(zhì)粒ColE1的復制起始區(qū)。該質(zhì)粒的選擇標志是四環(huán)素抗性，其帶有一個2.2kb的EcoRⅠ-HindⅢ片段，該片段中含有編碼大腸桿菌陪伴分子的基因GroES和GroEL(Fayet等，1986，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)202:435-445)。對細胞超聲處理后的粗提物、離心后的沉淀和上清液在10％SDS-PA中分析了腈水解酶的表達。結果示于圖6中，結果顯示其質(zhì)粒至少PA中分析了腈水解酶的表達。結果示于圖6中，結果顯示其質(zhì)粒至少含有nitB插入片段的細胞，在提取物中有高水平的腈水解酶(NitB)表達；但該蛋白基本以不溶的形式存在，盡管質(zhì)粒pXL2231的存在可提高可溶級分中腈水解酶多肽的量。在圖6中，M代表分子量標志；它們以kDa表示。另外，各泳道的意義如下-A、D、G分別代表BL21(DE3)+p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432的粗提物；-B、E、H代表分別獲自上述相同菌株的上清液；-C、F、I代表分別獲自上述相同菌株的離心沉淀；-J、N、Q代表分別獲自BL21(DE3)+pXL2231+p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432的粗提物；-K、O、R代表分別從這些菌株獲得的上清液；-L、P、S代表分別從這些菌株獲得的離心沉淀。菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT12+pXL2231被稱為RPA-BIOCAT126。菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT13+pXL2231被稱為RPA-BIOCAT127。按如下測定了RPA-BIOCAT126、RPA-BIOCAT127和RPA-BIOCAT66(相當于BL21(DE3)/pXL2432)的培養(yǎng)物的腈水解酶活性按上述方法進行培養(yǎng)，只是培養(yǎng)體積改為50ml,IPTG終濃度改為0.1mM。將培養(yǎng)物離心，將細胞沉淀重懸于10mlpH7的100mM磷酸鉀緩沖液中。用500μl的該懸液進行HMTBN的水解，其中加入500μlpH7200mM的HMTBN溶液。將100μl的該混合物與900μl0.1N磷酸混合，在1-4小時內(nèi)以規(guī)則的間隔測定了水解的動力學。如專利申請WO96/09403中所述用HPLC分析產(chǎn)生的HMTBA的量。結果綜合在下表2中。表2菌株RPA-BIOCAT66、126和127的活性縮寫Km:500μg/ml卡那霉素；Tc:12μg/ml四環(huán)素；h小時；U每小時每公斤干重形成的HMTBA的公斤數(shù)。為了改善所表達腈水解酶多肽的溶解性，按如下方法構建了質(zhì)粒pRPA-BCAT37。通過連接用klenow聚合酶處理的質(zhì)粒pDSK519(Keen等，1988，基因70:191-197)的5.9kbEcoRⅠ-PvuⅡ片段和來自質(zhì)粒pHP45ΩSp(Prentki和Krisch,1984，基因29:303-313)用MungBean核酸酶處理的2056bpHindⅢ片段，得到質(zhì)粒pXL2391。該質(zhì)粒然后用SmaⅠ和SacⅠ消化，得自HindⅢ消化的質(zhì)粒pXL2231并用Klenow處理及SacⅠ消化的含GroESL操縱子的2.3kb的插入片段被引入其中。質(zhì)粒pRPA-BCAT37因而是比質(zhì)粒pXL2231有更多拷貝數(shù)的質(zhì)粒RSF1010的一種衍生物，與攜帶ColE1起始區(qū)的質(zhì)粒相容并帶有抗鏈霉素的抗性標志。已將該質(zhì)粒引入菌株BL21(DE3)/pRPA-BCAT12中，得到菌株RPA-BIOCAT171。按與上所述相似的操作方法進行培養(yǎng)，但用100μg/ml鏈霉素代替四環(huán)素，測定了培養(yǎng)物的活性并報告在下表3中。表3菌株RPA-BIOCAT171的活性簡寫Km:50μg/ml卡那霉素；Sm:100μg/ml鏈霉素；h小時；U每小時每公斤干重所形成的HMTBA的公斤數(shù)。實施例5腈水解酶在大腸桿菌DH5α中的表達將含有Ptrp啟動子和RBScⅡ核糖體固定位點(Levy-Schill等，1995，基因161:15-20)的pXL2158的0.6kbScaⅠ-NdeⅠ片段克隆在pBCAT3(參見圖3)中，構建了質(zhì)粒pRPA-BCAT6。按如下操作方法用含有質(zhì)粒pRPA-BCAT6和/或質(zhì)粒pXL2035(Levy-Schill等，同前)的菌株DH5α進行了表達在含有0.4％酪蛋白氨基酸、100μg/ml色氨酸、100μg/ml羧芐青霉素的M9葡萄糖培養(yǎng)基(Miller,J.H.1972，分子遺傳學實驗(ExperimentsinMolecularGenetics),ColdSpringHaborLaboratory，紐約冷泉港)中37℃下預培養(yǎng)16小時。對于含pXL2035的菌株，加入50mg/l的卡那霉素。用不含色氨酸的相同培養(yǎng)基將飽和培養(yǎng)物稀釋至1/100后進行表達，37℃下培養(yǎng)8-16小時。按上一個實施例中所述方法對不同菌株的提取物進行SDS-PAGE分析，并報告在圖7中。在該圖中，M代表分子量標記，它們以kDa表示。另外，這些泳道具有如下含義-L、I、F、C代表分別得自菌株DH5α+pRPA-BCAT/3、/6、/6+pXL2035、RPA-BIOCAT76的粗提物；-K、H、E、B代表分別得自上述菌株的上清液；-J、G、D、A代表分別得自上述菌株的沉淀物。以質(zhì)粒pRPA-BCAT6得到的43kDa多肽的積累少，主要為不溶物。用質(zhì)粒pXL2035共表達GroE減少了過量表達，但在菌株DH5α(pRPA-BCAT6+pXL2035)的三次連續(xù)傳代后，挑選的菌株RPA-BIOCAT76重新恢復腈水解酶多肽的起始表達水平，該多肽幾乎是完全溶解的。按上文及上一實施例中所述相似的操作方法進行培養(yǎng)物的活性測定，并示于下表4中。表4菌株DH5α(pRPA-BCAT3)、DH5α(pRPA-BCAT6)、DH5α(pRPA-BCAT6+pXL2035)、RPA-BIOCAT76的活性簡寫Km:50μg/ml卡那霉素；Cb:100μg/ml羧芐青霉素；h小時；U每小時每公斤干重所形成的HMTBA的公斤數(shù)。這些數(shù)據(jù)顯示，與GroE共表達能夠改善腈水解酶的表達，連續(xù)傳代的常規(guī)菌株篩選也有助于改善重組活動。實施例6腈水解酶在惡臭假單胞菌和糞產(chǎn)堿菌中的表達利用實施例5中描述的表達系統(tǒng)來在惡臭假單胞菌和糞產(chǎn)堿菌中產(chǎn)生腈水解酶。含nitB基因的pRPA-BCAT6的1.14kbNdeⅠ-XbaⅠ片段被引入了載體pXL1289的NdeⅠ-XbaⅠ位點中。載體pXL1289是pKT230(Bagdasarian等，1981，基因15:237-247)的一種衍生物，其帶有革蘭氏陰性細菌多宿主的復制起始區(qū)(oriV)，含有攜Ptrp啟動子和RBScⅡ的pXL534的120bpEcoRⅠ-NdeⅠ片段(Latta等，1990,DNA和細胞生物學(DNAandCellBiology),9:129-137)、編碼cobA基因的NdeⅠ-XbaⅠ插入片段(Crouzet等，1990，細菌學雜志(J.Bacteriol.)172:5968-5979)和pXL534的含TrrnB終止子的550bpXbaⅠ-BamHⅠ插入片段(Latta等，1990,DNA和細胞生物學，9:129-137)。因而所得質(zhì)粒pRPA-BCAT14是pKT230的一種衍生物，含有產(chǎn)生卡那霉素(Km)抗性的基因和Ptrp:RBScⅡ控制下的nitB基因(圖8)。當將該質(zhì)粒引入大腸桿菌菌株DH5α中時，篩到了一個特別的克隆它表達一種腈水解酶，該酶在SDS-PA凝膠上的分子量為44kDa，而不是43kDa。該克隆所含質(zhì)粒具有與pRPA-BCAT14相同的限制酶譜，被稱為pRPA-BCAT24。最后，按照與pRPA-BCAT14相同的操作方法構建了質(zhì)粒pRPA-BCAT23，但有如下修改pRPA-BCAT6的136bpStuⅠ-BsmⅠ片段用pRPA-BCAT4的StuⅠ-BsmⅠ片段代替。因而質(zhì)粒pRPA-BCAT23表達的腈水解酶NitB在279位有Asn殘基。通過電穿孔將質(zhì)粒pRPA-BCAT14、23和24引入了菌株惡臭假單胞菌G2081中。同時用對萘啶酸和利福平的抗性篩選，從菌株KT2440(Bagdasarian和Timmis,1981，見Hofschneid和Goebel的“微生物和免疫學論題”(TopicsinMicrobiologyandImmunology),47,SpringerVerlag,Berlin)衍生得到菌株G2081。載體pKT230用作對照質(zhì)粒。然后從菌株惡臭假單胞菌提取了質(zhì)粒pRPA-BCAT14、pRPA-BCAT23、pRPA-BCAT24和pKT230，以通過電穿孔引入菌株糞產(chǎn)堿菌ATCC8750(=PRA-BIOCAT1)中。在含50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于30℃將菌株G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)、G2081(pKT230)和RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT14)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT23)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)、RPA-BIOCAT1(pKT230)培養(yǎng)過夜。將這些預培養(yǎng)物以1/100稀釋在含50mg/l卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)20小時。對細胞超聲處理后，細胞超聲處理后的粗提物、離心后的沉淀和上清液在10％SDS-PA凝膠上測定腈水解酶的表達。結果示于圖9中。對于菌株RPA-BIOCAT1(pKT230)和G2081(pKT230)，只用粗提物點樣(分別為泳道A和I)。在該圖中，M代表分子量標記，分子量以KDa表示。另外，其中泳道具有如下含義-B、D、F代表分別從菌株RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT14)、RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT23)、RPA-BIOCAT(pRPA-BCAT24)的粗提物；-C、E、G代表分別從這些菌株得到的上清液；-H代表從RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)獲得的沉淀；-J、L、O代表分別從菌株G2081(pRPA-BCAT14)、G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)獲得的粗提物；-K、N、P代表分別從上述相同菌株獲得的上清液；-Q代表從G2081(pRPA-BCAT24)得到的沉淀。該實驗表明，菌株惡臭假單胞菌表達顯著量的三種可溶性腈水解酶多肽，而菌株糞產(chǎn)堿菌只過量表達44kDa的腈水解酶多肽。按如實施例4中所述方法進行的這些培養(yǎng)物的活性測定表明，菌株G2081(pRPA-BCAT23)、G2081(pRPA-BCAT24)和RPA-BIOCAT1(pRPA-BCAT24)對HMTBN具有腈水解酶活性。實施例7腈水解酶在谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中的表達借助于PcspB啟動子(Peyret等，1993，分子生物學(MolecularMicrobiol.9:97-109)進行腈水解酶在菌株CGL1010(=ATCC14752)中的表達。用如下引物KS1和KS2從質(zhì)粒pCGL815(Peyret等，同上)擴增了含PcspB啟動子的530bp的片段KS1:5′-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3′KS2:5′-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3′用SalⅠ消化后，將擴增的530bp片段克隆在用SalⅠ和EcoRⅤ打開的質(zhì)粒pBSK(Statagene,LaJollaUSA)中，得到質(zhì)粒pCGL1084。通過將如下兩個寡核苷酸KS8和KS9雜交，制得一個EcoNⅠ/NdeⅠ接頭KS8:5′-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3′KS9:5′-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3′從質(zhì)粒pRPA-BCAT6中以1.1kbNdeⅠ-XbaⅠ片段的形式提取了腈水解酶的基因。利用上述接頭EcoNⅠ/NdeⅠ，將該基因引入用EcoNⅠ和XbaⅠ打開的pCGL1084中，得到質(zhì)粒pCGL1086。然后將pCGL1086含有PcspB::nitB的SalⅠ-BamHⅠ片段克隆在載體pCGL482(Peyret等，同前)的SalⅠ和BamHⅠ位點上，產(chǎn)生了質(zhì)粒pCGL1087。因而質(zhì)粒pCGL1087(圖10)是一種基于pBl1(Santamaria等，1984，普通微生物學(J.Gen.Microbiol.)130:2237-2246)的穿梭載體，含有在大腸桿菌中可被識別的pACYC184的復制起始區(qū)、產(chǎn)生氯霉素(Cm)抗性的基因和PcspB::nitB融合基團。按Bonnamy等，1990(FEMSMicrobiol.Lett.66:263-270)所述，用電穿孔法將質(zhì)粒pCGL1087和pCGL482引入了CGL1010中。在加有5mg/l氯霉素的3.7％腦心浸液培養(yǎng)基(DifcoLaboratories,Detroit,USA)中30℃培養(yǎng)20小時后，如實施例4所述在培養(yǎng)物樣品中進行腈水解酶活性的測定。結果顯示，菌株CGL1010(pCGL1087)具有腈水解酶活性，而菌株CGL1010(pCGL482)則沒有。實施例8腈水解酶在變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)中的表達利用質(zhì)粒plJ6021(Takano等，1995，基因166:133-137)用PtipA啟動子(Holmes等，1993,EMBOJ.12:3183-3191)在變鉛青鏈霉菌TK24菌株(Hopwood等，1985，鏈霉菌的遺傳操作實驗室手冊(GeneticManipulationofStreptomyces:ALaboratoryManual)，TheJohnInnesFoundation,Norwich)中進行了腈水解酶的表達。對質(zhì)粒pUC19(Yanisch-Perron等，基因，33:103-119)進行了如下修飾用TfiⅠ消化刪除140bp的TfiⅠ片段、用Klenow處理及載體自身連接。所得質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ打開，以克隆pRPA-BCAT3含有nitB基因的1.15kbEcoRⅠ-BamHⅠ片段。所得的質(zhì)粒pOS48.4具有位于nitB基因和BamHⅠ位點間的單一TfiⅠ位點。在用BamHⅠ消化和Klenow處理后，該TfiⅠ位點用于插入取自質(zhì)粒pHP45Ωhyg(Blondelet-Rouault等，基因，已交稿)的2.3kbΩhyg片段。Ωhyg片段含有吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)基因(Zalacain等，1986，核酸研究(Nucl.AcidsRes.,14:1565-1581)，能使變鉛青鏈霉菌具有潮霉素抗性。如此獲得的質(zhì)粒pOS48.5用于分離含有腈水解酶基因和隨后的hyg基因的3.45kbNdeⅠ-BamHⅠ片段，將該片段克隆在用NdeⅠ和BamHⅠ打開的質(zhì)粒plJ6021(Takano等，同前)中。質(zhì)粒plJ6021只在鏈霉菌中復制，用常規(guī)方法(Hopwood等，同上)將連接混合物轉(zhuǎn)化在變鉛青鏈霉菌TK24中，挑選對200mg/l潮霉素(BoehringerManheim)有抗性的克隆。用常規(guī)方法(Hopwood等，同上)提取了這些克隆的質(zhì)粒DNA，它們的限制酶譜與目標結構相符良好，并被稱為pOS48.7(圖11)。在5mg/l卡那霉素存在下在50mlTSB培養(yǎng)基(TrypticSoyBroth,Difco)中將含pOS48.7的兩個變鉛青鏈霉菌克隆于30℃培養(yǎng)72小時，然后以5mg/l的濃度加入蘚霉素，在已述條件(Hopwood等，同上)下繼續(xù)培養(yǎng)18小時。收集培養(yǎng)物，在實施例4中所述的條件下進行活性測定，結果表明，變鋁青鏈霉菌TK24(pOS48.7)菌株表達腈水解酶活性，而TK24(plJ6021)不表達。實施例9用其他腈水解酶水解HMTBN在Levy-Schil等，1995(同上)中描述的Comamonastestosteronisp.的腈水解酶一級序列與本發(fā)明中描述的腈水解酶一級序列具有31％的一致性。在Levy-Schil等(同上)描述的條件下培養(yǎng)了表達C.testosteroni腈水解酶的重組菌株大腸桿菌TG1(pXL2158,pXL2035)，將細胞沉淀在pH7的100mM磷酸鹽緩沖液中30℃下與50mMHMTBN保溫。測得活性為2.3kg/h.kgCS。與本發(fā)明的腈水解酶一樣，C.testosteroni的腈水解酶能夠水解HMTBN。另外，實施例4中給出的關于質(zhì)粒pBCAT12和pBCAT13的資料顯示，糞產(chǎn)堿菌ATCC8750的腈水解酶中發(fā)生Asn279→Asp279的替換仍能保留對HMTBN的活性。實施例10提供載體將5g干細胞加入到調(diào)至pH7.0的20g水中。然后加入所示量的載體(CELITE545,Prolabo，法國)，完全均化后向懸液中加入總干重15％的戊二醛，繼而10％聚乙烯亞胺(SEDIPUR,BASF，德國)進行交聯(lián)。在室溫下攪拌該懸液1小時。然后加入0.001％陰離子絮凝劑SuperflocA100使懸液絮凝。過濾收集交聯(lián)物。加入總干重10％的聚氮雜環(huán)丁烷(KYMENE557,Hercules，美國)對該物重新交聯(lián)。將該濕物團擠過0.5mm直徑的孔并干燥。按專利WO96/09403中描述的方法測定所得顆粒的活性為細胞提供載體后顯著改善了其活性。用部分溶于水的小麥谷蛋白(Roquette，法國)或完全溶于水的明膠(SBI，法國)代替CELITE，重復了該實驗該細胞懸液不絮凝，不能過濾。本實施例說明可用谷蛋白代替代替CELITE。但如果加入的是明膠(完全可溶)則不可能用前述技術(擠出)制備催化劑。實施例11將在LB培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)制得的10g實施例4的大腸桿菌BIOCAT171在500gpH7.0的100mM磷酸鹽緩沖液中與10gCLARCEC78(CECA，法國)混合。均化后，加入6g25％的戊二醛，室溫下攪拌該懸液15分鐘。然后加入2g聚乙烯亞胺和6g25％的戊二烯。室溫下攪拌整個混合物1小時，加入5ml0.2％的SUPERFLOCA100溶液(CYTEC，法國)使懸液絮凝。過濾，將所得糊狀物與16g12.5％的聚氮雜環(huán)丁烷(KYMENE557,Hercules)混合，然后被擠壓通過0.5mm直徑的孔。將后得長條物在烘箱中35℃下干燥，然后在含1％NaBH4的pH10.0的50mM硼酸緩沖液中浸泡30分鐘。然后該生物催化劑用蒸餾水洗滌。將該催化劑在5℃或室溫下于pH8.0的500mM磷酸鹽緩沖液中保存。用100g生物催化劑填充高45cm內(nèi)徑3cm的恒溫柱。該柱通過一個再循環(huán)環(huán)路與一個泵相連。反應器總體積為430ml。環(huán)路中充滿25％的羥基甲硫基丁酸銨鹽的溶液。溶液從上向下的時間流量為20升/小時。水在柱的雙層外殼間和在熱交換器中循環(huán)，使溫度保持在35℃。向環(huán)路中以80g/h的流速加入去離子水。以20g/h的流速加入2-羥基-4-甲硫基丁腈。多余的反應介質(zhì)從柱的底部排出以保持環(huán)路中的體積恒定。這樣，得到了連續(xù)的液流，和95％的腈轉(zhuǎn)化率。另外，在反應器出口處所得的2-羥基-4-甲硫基丁酸銨水溶液的濃度為25％。實施例12所用的電透析器由9個2dm2活性表面的池集合而成，每個池由如下所述的兩個室構成-鹽/酸室陰極側(cè)以陽離子交換膜TokuyamaSoda的NeoseptaCMB為限，陽極側(cè)以雙極膜Aqualytics的陽離子面為限，-堿室陽極側(cè)以陽離子膜為限，陰極側(cè)以雙極膜的陰離子面為限。陽極由鍍鉑鈦構成。陰極由不銹鋼制成。電解質(zhì)是在40℃下電導率為100mS/cm的硫酸鈉水溶液。向各電極的循環(huán)流速為2×100升/小時。體積為5升?！皦A”室中開始時充以5升1％的硫酸銨溶液。“鹽/酸”室中開始時充以5升1.44mol/l的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨溶液。起始時的溶液再循環(huán)流速，對鹽/酸室固定在130升/小時，對堿室固定在190升/小時。在平均40℃下以不連續(xù)方式(根據(jù)再循環(huán)情況)進行電透析。強度設在9A，即電流密度為0.45kA/m2。運行155分鐘后，鹽/酸室的電導率由59變?yōu)?.8mS/cm。鹽/酸室含有1.35mol/l的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸，為100％的酸形式。法拉第產(chǎn)率約為71％，能耗為每形成一公斤酸0.53kWh。實施例13所用的電透析器由8個結構與實施例12中相同的池集合構成?！皦A”室開始時充以5.27升0.1％的硫酸銨溶液?！胞}/酸”室開始時充以4.85升1.39mol/l的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨溶液。各溶液再循環(huán)的起始流速，對鹽/酸室固定在60升/小時，對堿室固定在150升/小時。在40℃的平均溫度下以不連續(xù)方式(根據(jù)再循環(huán)的情況)進行電透析。強度設在9A，即電流密度為0.45kA/m2。運行172分鐘后，鹽/酸室的電導率由59變?yōu)?.5mS/cm。鹽/酸室的終體積為4.67升。組成如下2-羥基-4-(甲硫基)丁酸1.24mol/l2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨0.148mol/l轉(zhuǎn)化率為86％終產(chǎn)物為89％的酸形式。法拉弟產(chǎn)率為74％。能耗約為形成每公斤酸0.58kWh。實施例14使用類似于實施例13的設備。開始時“堿”室中充以5.46升1％的硫酸銨。開始時“鹽/酸”室中充以5.23升1.24mol/l的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨溶液。各溶液的再循環(huán)起始流量，對鹽/酸室設在90升/小時，對堿室設在150升/小時。在40℃的平均溫度下以不連續(xù)方式(根據(jù)再循環(huán)的情況)進行電透析。強度設在14A，即電流密度為0.7kA/m2。運行105分鐘后，鹽/酸室的電導率從57.6變?yōu)?.8mS/cm。鹽/酸室的最終組成如下2-羥基-4-(甲硫基)丁酸1.28mol/l2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨0.14mol/l因而產(chǎn)物為90％的酸形式。實施例15使用與實施例13相似的設備。用從實施例14產(chǎn)生的堿室中的內(nèi)容物進行本實驗。開始時“鹽/酸”室中充以5.2升1.44mol/l的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨的溶液。各溶液的再循環(huán)起始流速，對于鹽/酸室設為50升/小時，對于堿室設在150升/小時。在40℃的平均溫度下以不連續(xù)方式(根據(jù)再循環(huán)的情況)進行電透析。強度設在19A，即電流密度為0.95kA/m2。運行53分鐘后，鹽/酸室的電導率從59變?yōu)?7mS/cm。鹽/酸室的終濃度為4.85升。組成如下2-羥基-4-(甲硫基)丁酸0.87mol/l2-羥基-4-(甲硫基)丁酸銨0.56mol/l轉(zhuǎn)化率為50％。終產(chǎn)物為61％的酸形式。法拉弟產(chǎn)率為83％。能耗為形成每公斤酸0.7kWh。實施例16以每批200.1g約1.5MHMTBS溶液的量在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮。水浴溫度為45±5℃。壓力調(diào)在約2.5×103Pa(25毫巴)。沸騰器中的溫度從開始蒸餾的25℃變?yōu)樽詈蟮?0℃。3小時末時，回收得到41.9g黃色粘性液，其特征如下調(diào)節(jié)濃度后(用水稀釋)，得到特征如下的產(chǎn)物通過電勢測定，得出其質(zhì)量分配如下通過HPLC，測定單體或二聚體與(單體+二聚體)的面積比。單體/(單體+二聚體)100二聚體(單體+二聚體)(*)0(*)沒有檢測到二聚體。實施例17以每批200.0g約1.5MHMTBS溶液的量在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮。水浴溫度為121±5℃。壓力調(diào)在約9.5×104Pa。沸騰器中的溫度從開始蒸餾的100℃變?yōu)樽詈蟮?13℃。3小時末時，回收得到41.5g黃色粘性液，其特征如下調(diào)節(jié)濃度后(用水稀釋)，得到特征如下的產(chǎn)物通過電勢測定，得出其質(zhì)量分配如下<通過HPLC，測定單體或二聚體與(單體+二聚體)的面積比。單位/(單體+二聚體)95.0二聚體/(單體+二聚體)(*)5.0實施例18向?qū)嵤├?7中描述的100.0g液體中加入40.0g水。用75.0g異丙基醚萃取。分層后，收集有機相，蒸發(fā)后得到25.6gHMTBA，其特征如下測定單體/(單體+二聚體)(％面積)97.0二聚體/(單體+二聚體)(％面積)3.025℃下的粘度(mm2·s-1)55</table></tables>實施例19上述實施例中所述溶液的老化>沒有評價存儲40天以后實施例16和17溶液中的二聚體含量。權利要求1．通過酶水解從2-羥基-4-甲硫基丁腈制備2-羥基-4-甲硫基丁酸和/或2-羥基-4-甲硫基丁酸銨鹽的方法，其特征在于a)第一步，制備具有腈水解酶活性的生物材料，b)第二步，將其固定化，c)第三步，將2-羥基-4-甲硫基丁腈與如此固定化的生物材料接觸，以獲得2-羥基-4-甲硫基丁酸銨鹽，d)第四步，必要時將c)步所得鹽轉(zhuǎn)變成相應的酸，及e)第五步，濃縮c)或d)步中所得產(chǎn)物。2．根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于腈水解酶活性從產(chǎn)堿菌屬，優(yōu)選糞產(chǎn)堿菌的腈水解酶獲得。3．根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于使用編碼一種腈水解酶的遺傳信息，在一種微生物宿主中表達。4．根據(jù)權利要求1-3任一項的方法，其特征在于微生物宿主選自大腸桿菌或芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、鏈霉菌屬、酵母屬、克魯維酵母屬、青霉屬和曲霉屬的成員。5．根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于腈水解酶活性獲自克隆在質(zhì)粒pRPA-BCAT3中的基團所編碼的腈水解酶，所述質(zhì)粒以保藏號CBS998-96保藏在CBS。6．根據(jù)權利要求1-5任一項的方法，其特征在于腈水解酶與一種伴侶蛋白共表達。7．根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于伴侶蛋白為大腸桿菌的GroESL。8．根據(jù)上述權利要求中任一項的方法，其特征在于a)步的生物材料被固定在固體載體上。9．根據(jù)權利要求8的方法，其特征在于固體載體具有1μm-3mm，優(yōu)選10μM-2mm的粒度，還在于以生物材料重量的0.01-500％，優(yōu)選10-200％的比例加入該載體。10．根據(jù)權利要求9的方法，其特征在于固體載體選自-離子交換樹脂，-氧化鋁，-合成二氧化硅或硅藻類及硅膠，-沸石，-炭，-在水中部分溶解的蛋白，和-多糖。11．根據(jù)權利要求10的方法，其特征在于固體載體是谷蛋白。12．根據(jù)權利要求8的方法，其特征在于使用一種或多種化學試劑以使生物材料和載體交聯(lián)和/或不溶化。13．根據(jù)權利要求12的方法，其特征在于化學試劑選自，-聚氮雜環(huán)丁烷聚合物，-聚乙烯亞胺聚合物，-聚酰胺聚合物，-異氰酸酯聚合物，-藻酸鹽膠體，-k-角叉菜膠，-胺類，-醛類，-羧酸，及-異氰酸酯。14．根據(jù)權利要求10-13的方法，其特征在于生物材料和載體在化學試劑存在下混合，以獲得一糊狀物，后者被擠出并干燥。15．根據(jù)權利要求10-13的方法，其特征在于生物材料和化學試劑混合，然后以薄層的形式沉積在載體上。16．根據(jù)以上權利要求任一項的方法，其特征在于通過電透析解離相應的銨鹽，得到含至少60％HMTBA，優(yōu)選至少80％HMTBA的HMTBA和HMTBS的混合物，混合物其余部分為HMTBS。17．根據(jù)權利要求16的方法，其特征在于在具有雙極膜及三個室的電透析器中進行解離。18．根據(jù)權利要求16的方法，其特征在于在具有雙極膜及兩個室的電透析器中進行解離。19．根據(jù)權利要求1-15任一項的方法，其特征在于通過加熱銨鹽溶液得到HMTBS和HMTBA的混合物。20．根據(jù)權利要求16-19的方法，其特征在于釋放出的氨被蒸餾，濃縮并再循環(huán)回HCN的合成。21．根據(jù)權利要求16-19獲得的水溶液，其由HMTBA和HMTBS的混合物構成，其重量比HMTBA/(HMTBA+HMTBS)為5-99.9％，優(yōu)選10-50％。22．用于實施本發(fā)明方法的設備，包括-裝有具腈水解酶活性的固定化酶，或表達具有腈水解酶活性的酶的固定化微生物宿主的一個或多個反應器(3,4)，-必要時，一個或多個電透析裝置(9)，-終產(chǎn)物的濃縮裝置(6,12)。23．質(zhì)粒pRPA-BCAT3，其以CBS998-96號保藏在CBS。全文摘要本發(fā)明的主題是一種通過酶水解2－羥基－4－甲硫基丁腈制備2－羥基－4－甲硫基丁酸和/或其銨鹽的方法,其特征在于:a)第一步,制備具有腈水解酶活性的生物材料,b)第二步,將其固定化,c)第三步,將2－羥基－4－甲硫基丁腈與如此固定化的生物材料接觸,以獲得2－羥基－4－甲硫基丁酸的銨鹽,d)第四步,必要時將c)步所得鹽轉(zhuǎn)變成相應的酸,及e)第五步,濃縮c)或d)步中所得產(chǎn)物。文檔編號C12R1/66GK1234074SQ9719902公開日1999年11月3日申請日期1997年10月24日優(yōu)先權日1996年10月25日發(fā)明者O·發(fā)沃－布勒,J·彼爾阿德,C·戴維,P·默里爾,D·霍伯咨申請人:羅納-普朗克動物營養(yǎng)素公司