專(zhuān)利名稱(chēng)：甲醇畢赤酵母的轉(zhuǎn)化的制作方法
背景技術(shù)：
甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母是那些能夠利用甲醇作為唯一碳源和能量源的酵母。具有甲醇利用所必需的生化途徑的酵母物種可分成四個(gè)屬漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬以及球擬酵母屬。這些酵母屬多少有點(diǎn)是基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生長(zhǎng)特點(diǎn)而人工合成的，并且不反映密切的遺傳關(guān)系(Billon-Grand,Mycotaxon 35:201-204,1989;Kurtzman,Mycologia 84:72-76,1992)。此外。并非這些屬中的所有物種都能夠利用甲醇作為碳源和能量源。這一分類(lèi)的結(jié)果是在一屬的單個(gè)物種之間的生理和代謝方面有極大的差異。
甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母是在重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)中利用的具有吸引力的候選者。一些甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母已經(jīng)顯示出在基本確定成分培養(yǎng)基上能快速生長(zhǎng)至高生物量的特征。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的某些基因在誘導(dǎo)或者脫阻抑條件下得到嚴(yán)格調(diào)節(jié)和高度表達(dá)，這表明這些基因的啟動(dòng)子對(duì)于產(chǎn)生商業(yè)價(jià)值的多肽來(lái)說(shuō)是有用的。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)aber等，酵母，11:1331,1995；Romanos等，酵母，8:423,1992；以及Cregg等，生物/技術(shù)，11:905,1993。
在重組產(chǎn)生系統(tǒng)中用作為宿主的甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的發(fā)展是緩慢的，其部分原因是由于缺乏合適的材料(例如啟動(dòng)子、選擇性標(biāo)記以及突變體宿主細(xì)胞)和方法(如轉(zhuǎn)化技術(shù))。大多數(shù)高度發(fā)展的甲基營(yíng)養(yǎng)型宿主系統(tǒng)利用巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母(Faber等，Curr.Genet.25:305-310,1994；Cregg等，同上；Romanos等，同上；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,855,242；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,857,467；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,879,231以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,929,555)。
本領(lǐng)域仍然需要轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的其它物種的方法，以及需要利用所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生具有經(jīng)濟(jì)重要性的多肽，包括工業(yè)酶和藥物蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了在這些過(guò)程中有用的組合物和方法以及其它的相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了將DNA分子導(dǎo)入甲醇畢赤酵母細(xì)胞的方法和按照這些方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所說(shuō)的方法包括在線性DNA分子的存在下，使甲醇畢赤酵母細(xì)胞暴露于呈指數(shù)衰變的，場(chǎng)強(qiáng)為2.5～4.5kV/cm且時(shí)間常數(shù)為1～40毫秒的脈沖電場(chǎng)中，由此將DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，DNA分子包括編碼一種多肽的節(jié)段，所說(shuō)的多肽不是甲醇畢赤酵母多肽，可操作地連接到甲醇畢赤酵母基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和甲醇畢赤酵母基因轉(zhuǎn)錄終止子上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是甲醇畢赤酵母AUG1基因啟動(dòng)子，在一個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子包含如SEQ ID NO:2中所示的核苷酸24至核苷酸1354的核苷酸序列。該DNA分子可進(jìn)一步包含補(bǔ)充宿主細(xì)胞中的突變的選擇性標(biāo)記基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記基因是甲醇畢赤酵母基因，如甲醇畢赤酵母ADE2基因。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供了用異源DNA轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的方法，該方法包括在異源線性DNA分子的存在下，使甲醇畢赤酵母細(xì)胞的群體暴露于呈指數(shù)衰變的，場(chǎng)強(qiáng)為2.5～4.5kV/cm且時(shí)間常數(shù)為1-40毫秒的脈沖電場(chǎng)中，由此將異源DNA導(dǎo)入至少一部分群體中，回收DNA已導(dǎo)入其中的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每毫克異源DNA回收103～105個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每毫克異源DNA回收0.9×104～1.1×104個(gè)細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法還包括從回收的細(xì)胞回收整合轉(zhuǎn)化體的步驟，如通過(guò)在以山梨糖醇作為碳源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在附加的實(shí)施方案中，細(xì)胞群體處于早期對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。
在其它方面中，本發(fā)明提供了用以上公開(kāi)的方法轉(zhuǎn)化的甲醇畢赤酵母細(xì)胞。
一旦參考下列詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將變得明顯。
附圖簡(jiǎn)要描述

圖1說(shuō)明電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時(shí)間對(duì)甲醇畢赤酵母的電穿孔效率的影響。
圖2是在質(zhì)粒pCZR140和甲醇畢赤酵母基因組DNA之間的重組過(guò)程的示意圖。
圖3是質(zhì)粒pCZR137和甲醇畢赤酵母基因組DNA之間的重組過(guò)程的示意圖。
發(fā)明詳細(xì)描述在更詳細(xì)地闡明本發(fā)明之前，先定義在本文中使用的某些術(shù)語(yǔ)是有用的＂早期對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)＂是在培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)期，其時(shí)的細(xì)胞濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml至8×106個(gè)細(xì)胞/ml。
＂異源DNA＂指的是一個(gè)DNA分子或者一群DNA分子，這些DNA分子并不天然存在于給定的宿主細(xì)胞中。與特定宿主細(xì)胞異源的DNA分子可以包含得自該宿主細(xì)胞物種的DNA，只要宿主DNA與非宿主DNA結(jié)合。例如，一般認(rèn)為可操作地連接到宿主DNA節(jié)段(包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子)上的DNA分子(包含編碼多肽的非宿主DNA節(jié)段)是異源DNA分子。
＂整合轉(zhuǎn)化體＂是異源DNA已經(jīng)引入其中的細(xì)胞，其中的異源DNA已整合到該細(xì)胞的基因組DNA中。
＂線型DNA＂意指具有自由5′和3′末端的DNA分子，該DNA分子是非環(huán)狀DNA分子。線型DNA可以由閉合環(huán)狀DNA分子(如質(zhì)粒)通過(guò)酶促消化或者物理破裂制得。
術(shù)語(yǔ)＂可操作地連接的＂意指DNA節(jié)段得到排列，以便它們一致實(shí)現(xiàn)其預(yù)期的目的，例如轉(zhuǎn)錄以啟動(dòng)子開(kāi)始并且通過(guò)編碼節(jié)段進(jìn)行到終止子。
如上所述，本發(fā)明提供了制備具有營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的甲醇畢赤酵母細(xì)胞的方法?？梢杂猛碊NA(來(lái)源于宿主物種的DNA)和異源DNA來(lái)轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體，并且所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體可以用于大量的不同生物應(yīng)用中。本發(fā)明的突變細(xì)胞尤其能很好地適合于用異源DNA的轉(zhuǎn)化，其中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以用來(lái)產(chǎn)生多肽和蛋白質(zhì)，包括高級(jí)生物體(包括人類(lèi))的多肽和蛋白質(zhì)?？梢杂闷渌麯NA分子(包括DNA文庫(kù)和合成DNA分子)轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型甲醇畢赤酵母細(xì)胞。因此本發(fā)明提供了這樣一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞可以用來(lái)表達(dá)基因多樣化的文庫(kù)，從而產(chǎn)生對(duì)于新的生物活性篩選出的產(chǎn)品，該宿主細(xì)胞可以在基因工程中用作為化合物文庫(kù)篩選的靶，還可以得到基因修飾，從而提高它們?cè)谄渌椒ㄖ械睦谩?br> 甲醇畢赤酵母菌株可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)和其它儲(chǔ)存處，并且可以在本發(fā)明中用作為原材料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用異源DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞一般具有一個(gè)突變，該突變可以為在異源DNA分子上的基因(＂選擇性標(biāo)記＂)所互補(bǔ)。這一選擇性標(biāo)記使所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞得以在一定條件下生長(zhǎng)，該條件即其中的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能成倍增加(＂選擇性的條件＂)。選擇的一般原則是本領(lǐng)域所熟知的。通常利用的選擇性標(biāo)記是編碼合成氨基酸或者核苷酸所要求的酶的基因。在這些基因中有突變的細(xì)胞(營(yíng)養(yǎng)陷型突變體)在缺乏特異性氨基酸或者核苷酸的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，除非突變?yōu)檫x擇性標(biāo)記所互補(bǔ)。這樣的＂選擇性＂培養(yǎng)基的利用確保在宿主細(xì)胞之內(nèi)的異源DNA的穩(wěn)定維持。用于甲醇畢赤酵母中的這一類(lèi)型的優(yōu)選的選擇性標(biāo)記是甲醇畢赤酵母ADE2基因，該基因編碼磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)。當(dāng)ADE2基因轉(zhuǎn)化到ade2宿主細(xì)胞中時(shí)，該基因使細(xì)胞在缺少腺嘌呤的情況下得以生長(zhǎng)。代表性甲醇畢赤酵母ADE2基因序列的編碼鏈顯示在SEQ ID NO:1中。所說(shuō)明的序列包括5′-非編碼序列的1006個(gè)核苷酸和3′-非編碼序列的442個(gè)核苷酸，它們?cè)诤塑账?007-1009都具有起始ATG密碼子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含核苷酸407-2851的DNA節(jié)段用作為選擇性標(biāo)記，雖然也能利用更長(zhǎng)或更短的節(jié)段(只要編碼部分可操作地連接到啟動(dòng)子和終止子序列上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本文提供的這一序列與其它序列表示各自基因的單一等位基因，并且期望等位變異存在。任何功能性ADE2等位基因都可以用于本發(fā)明中?？梢杂糜诒景l(fā)明中的其它營(yíng)養(yǎng)性標(biāo)記包括甲醇畢赤酵母ADE1、HIS3以及LEU2基因，這些基因允許在分別缺少腺嘌呤、組氨酸和亮氨酸的情況下進(jìn)行選擇。異源基因(如得自其它真菌的基因)也可以用作為選擇性標(biāo)記。對(duì)于大規(guī)模的工業(yè)方法(其中需要最大限度地減少對(duì)甲醇的利用)來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的是利用其中兩個(gè)甲醇利用基因(AUG1和AUG2)缺失的宿主細(xì)胞。對(duì)于分泌的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)說(shuō)，缺乏液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的?？梢杂靡阎椒?如定點(diǎn)誘變)制備基因缺損的突變體?？梢曰谂c它們的對(duì)應(yīng)物釀酒酵母的同源性來(lái)克隆甲醇畢赤酵母基因?；谶@樣的同源性給出本文所揭示的ADE2基因的定義。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用顯性選擇性標(biāo)記，從而排除了對(duì)突變宿主細(xì)胞的需要。顯性選擇性標(biāo)記是能對(duì)野生型細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的標(biāo)記。典型的顯性選擇性標(biāo)記是對(duì)抗生素，如新霉素型抗生素(例如，G418)，潮霉素B，和博來(lái)霉素/腐草霉素型抗生素(例如，ZeocinTM,可得自Invitrogen Corp.,San Diego,CA)具有抗性的基因。用于甲醇畢赤酵母的優(yōu)選的顯性選擇性標(biāo)記是Sh bla基因，該基因抑制ZeocinTM的活性。
在本發(fā)明中使用電穿孔促進(jìn)DNA導(dǎo)入甲醇畢赤酵母細(xì)胞。電穿孔法是這樣一種方法，其利用瞬時(shí)透化細(xì)胞膜的脈沖電場(chǎng)，使大分子(如DNA)得以進(jìn)入細(xì)胞。已有文獻(xiàn)報(bào)道了與哺乳動(dòng)物的(例如Neumann等，EMBOJ.1:841-845,1982)和真菌的(例如Meilhoc等，生物/技術(shù)，8:223-227,1990)宿主細(xì)胞一起利用的電穿孔法。然而，對(duì)于DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞的真正機(jī)理并不充分了解。對(duì)于甲醇畢赤酵母的轉(zhuǎn)化，人們已發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞暴露于指數(shù)衰減的脈沖電場(chǎng)(具有2.5至4.5kV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度和1至40毫秒的時(shí)間常數(shù)(τ))中時(shí)，電穿孔法是極為有效的。時(shí)間常數(shù)τ被定義為初始的峰值電壓V0降至V0/e值時(shí)所需的時(shí)間。可以按照脈沖電路的總電阻與電容的乘積來(lái)計(jì)算時(shí)間常數(shù)，即τ=R×C。典型地，可以由用戶(hù)預(yù)置或者選擇電阻以及電容，這取決于所選擇的電穿孔法設(shè)備。在任何情況下，按照制造廠商提供的上述電場(chǎng)強(qiáng)度和衰減參數(shù)的說(shuō)明書(shū)來(lái)配置設(shè)備。電穿孔法設(shè)備由供應(yīng)商(例如BioRad實(shí)驗(yàn)室，Hercules,CA)提供。
一般將用于轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的DNA分子制備成雙鏈的環(huán)狀質(zhì)粒，優(yōu)選地，該質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化之前被線性化。對(duì)于多肽或者蛋白質(zhì)產(chǎn)生，除以上描述的選擇性標(biāo)記外，DNA分子還包括表達(dá)盒，其包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼感興趣的多肽或者蛋白質(zhì)的DNA節(jié)段(如cDNA)以及轉(zhuǎn)錄終止子。將這些元件可操作地連接在一起，從而提供感興趣的DNA節(jié)段的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選的是，啟動(dòng)子與終止子是甲醇畢赤酵母基因的啟動(dòng)子與終止子。
特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是甲醇畢赤酵母醇利用基因(AUG1)的啟動(dòng)子。其代表性編碼鏈序列顯示在SEQ ID NO:2中。在SEQ ID NO:2中，起始ATG密碼子位于核苷酸1355-1357。SEQ ID NO:2的核苷酸1-23是非AUG1多接頭序列。特別優(yōu)選的是利用包含SEQ ID NO:2的核苷酸24-1354的節(jié)段作為啟動(dòng)子，雖然附加的上游序列也可以包括在內(nèi)。甲醇畢赤酵母含有第二個(gè)醇利用基因AUG2，該基因的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明中。其它的有用啟動(dòng)子包括那些二羥基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)基因的啟動(dòng)子。DNA分子還包含使鑒定、選擇和轉(zhuǎn)化體維持得以實(shí)現(xiàn)的選擇性標(biāo)記。DNA分子還可以含有附加的元件，這樣的復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記使在交替宿主(例如大腸桿菌)中的DNA的擴(kuò)增和維持得以實(shí)現(xiàn)。為了有利于DNA整合到宿主染色體中，優(yōu)選的是DNA分子具有側(cè)連在宿主DNA序列的兩端的整個(gè)表達(dá)節(jié)段，包含啟動(dòng)子--感興趣基因--終止子以及選擇性標(biāo)記。通過(guò)在表達(dá)節(jié)段的下游末端上包含3′未翻譯DNA序列以及依賴(lài)于在5′末端上的啟動(dòng)子序列，可以便利地實(shí)現(xiàn)這一目的。當(dāng)利用線型DNA時(shí)，表達(dá)節(jié)段將側(cè)連切割位點(diǎn)，從而使分子得以線性化和使表達(dá)節(jié)段得以與其它序列(例如細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記)分離。優(yōu)選的這樣的切割位點(diǎn)是那些為不經(jīng)常在DNA序列中切割的限制性?xún)?nèi)切酶所識(shí)別的切割位點(diǎn)，如那些識(shí)別8-堿基靶序列的切割位點(diǎn)(如NotⅠ)。
可以在甲醇畢赤酵母中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)包括工業(yè)和藥物上感興趣的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)包括得自植物和動(dòng)物(尤其是如哺乳動(dòng)物的脊椎動(dòng)物)的高級(jí)真核蛋白質(zhì)，雖然某些來(lái)源于微生物的蛋白質(zhì)也具有很高的價(jià)值?？梢岳帽景l(fā)明方法制備的蛋白質(zhì)包括酶(如脂酶、纖維素酶和蛋白酶)；酶抑制劑(包括蛋白酶抑制劑)；生長(zhǎng)因子(如血小板衍生的生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子)；細(xì)胞因子(如促紅細(xì)胞生成素和血小板生成素)以及激素(如胰島素、leptin和胰高血糖素)。
為了在本發(fā)明中使用，在大約25-35℃溫度下，在包含充分碳源、氮源以及痕量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲醇畢赤酵母細(xì)胞。由常規(guī)手段(如搖動(dòng)小瓶或者噴射發(fā)酵罐)用充分通氣來(lái)提供液體培養(yǎng)物。優(yōu)選的培養(yǎng)基是YEPD(表1)。可以通過(guò)在新鮮培養(yǎng)基中稀釋使細(xì)胞傳代，或者細(xì)胞可以在冷凍之下在平板上短期存儲(chǔ)。對(duì)于長(zhǎng)期存儲(chǔ)，細(xì)胞優(yōu)選在-70℃下保持在50％甘油溶液中。
表1YEPD2％D-葡萄糖2％BactTM蛋白胨(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)1％BactoTM酵母提取物(Difco實(shí)驗(yàn)室)0.004％腺嘌呤0.006％L-亮氨酸ADED0.056％-Ade-Trp-Thr粉0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液ADEDS0.056％-Ade-Trp-Thr粉0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液18.22％D-山梨糖醇LEUD0.052％-Leu-Trp-Thr粉
0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液HISD0.052％-His-Trp-Thr粉0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液URAD0.056％-Ura-Trp-Thr粉0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液URADS0.056％-Ura-Trp-Thr粉0.67％無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)2％D-葡萄糖0.5％200X色氨酸、蘇氨酸溶液18.22％D-山梨糖醇-Leu-Trp-Thr通過(guò)結(jié)合以下物質(zhì)所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、4.0g賴(lài)氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-His-Trp-Thr粉通過(guò)結(jié)合以下物質(zhì)所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴(lài)氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-Ura-Trp-Thr粉通過(guò)結(jié)合以下物質(zhì)所制得的粉狀物4.0g腺嘌呤、3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴(lài)氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)-Ade-Trp-Thr粉通過(guò)結(jié)合以下物質(zhì)所制得的粉狀物3.0g精氨酸、5.0g天冬氨酸、2.0g組氨酸、6.0g異亮氨酸、8.0g亮氨酸、4.0g賴(lài)氨酸、2.0g甲硫氨酸、6.0g苯丙氨酸、5.0g絲氨酸、5.0g酪氨酸、4.0g尿嘧啶以及6.0g纈氨酸(所有L-氨基酸)200X色氨酸、蘇氨酸溶液3.0％L-蘇氨酸、0.8％在H2O中的L-色氨酸對(duì)于平板，加入1.8％BactoTM瓊脂(Difco實(shí)驗(yàn)室)優(yōu)選在早期的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)中的細(xì)胞上進(jìn)行甲醇畢赤酵母的電穿孔法。在固體培養(yǎng)基(優(yōu)選為固體YEPD)上將細(xì)胞劃線培養(yǎng)為單一菌落。在30℃下生長(zhǎng)大約2天之后，利用得自新鮮平板的單一菌落來(lái)接種所需量的豐富培養(yǎng)基(如YEPD)而使細(xì)胞密度達(dá)到大約5-10×105細(xì)胞/ml。在大約25-35℃(優(yōu)選為30℃)下通過(guò)劇烈搖動(dòng)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，直到它們處于早期對(duì)數(shù)期。然后通過(guò)如3000×g的2-3分鐘離心來(lái)收獲細(xì)胞，并再懸浮該細(xì)胞。通過(guò)還原細(xì)胞壁中的二硫鍵、在離子溶液(適合電穿孔法條件)中平衡它們以及冷卻它們，使細(xì)胞處于電感受態(tài)(electrocompetent)。典型地，通過(guò)在pH6-8緩沖液(包含還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或者β-巰基乙醇(BME))中培養(yǎng)它們，使細(xì)胞處于電感受態(tài)，以還原細(xì)胞壁蛋白質(zhì)而有利于爾后的對(duì)DNA的攝取。就這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，優(yōu)選的培養(yǎng)緩沖液是pH7.5的、包含25mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖劑的新鮮溶液。在大約30℃下在這一緩沖液(典型地是利用原培養(yǎng)量的五分之一)中培養(yǎng)細(xì)胞大約5-30分鐘，優(yōu)選為大約15分鐘。然后收獲細(xì)胞并在合適的電穿孔緩沖液(其利用時(shí)是經(jīng)過(guò)用冰預(yù)冷的)中洗滌該細(xì)胞?；谶@一考慮，合適的緩沖液包括包含弱緩沖劑、二價(jià)陽(yáng)離子(如Mg++、Ca++)和滲透穩(wěn)定劑(例如食糖)的pH6-8溶液。在洗滌之后，將細(xì)胞再懸浮于小量的緩沖液中，其時(shí)間為達(dá)到電感受態(tài)的時(shí)間，并且該細(xì)胞可以被直接利用或者等分和存儲(chǔ)在凍結(jié)(優(yōu)選為-70℃)下。優(yōu)選的電穿孔緩沖液是STM(270mM蔗糖、10mMTris、pH7.5、1mM MgCl2)。在優(yōu)選的方案中，使細(xì)胞接受兩次洗滌，首先用原培養(yǎng)量的用冰預(yù)冷的緩沖液，然后用一半原培養(yǎng)量。在第二次洗滌之后，收獲并再懸浮細(xì)胞，典型地是利用大約3-5ml緩沖液(對(duì)于200ml原培養(yǎng)量)。
利用少量電感受態(tài)細(xì)胞(典型地為大約100μl)和至多十分之一量的線型DNA分子，實(shí)施電穿孔法。例如，使0.1ml的在緩沖液中的細(xì)胞懸浮液(其離子強(qiáng)度不超過(guò)50mM)與0.1-10μg的DNA(體積≤10μl)混合。將這一混合液放置在用冰預(yù)冷的電穿孔小池中，并且使之受于呈指數(shù)衰減的脈沖電場(chǎng)，電場(chǎng)強(qiáng)度為2.5至4.5kV/cm，優(yōu)選為大約3.75kV/em，時(shí)間常數(shù)為1至40毫秒，優(yōu)選為10-30毫秒，更優(yōu)選為15-25毫秒，最優(yōu)選為大約20毫秒。為了達(dá)到所需脈沖參數(shù)，所利用的實(shí)際設(shè)備設(shè)置由所利用的設(shè)備決定。當(dāng)利用具有2mm電穿孔小池的BioRad(Hercules,CA)Gene PulserTM電穿孔儀時(shí)，電阻設(shè)為600歐姆或者更大，優(yōu)選為＂無(wú)窮大＂電阻值，而電容則設(shè)為25μF，以便獲得所需電場(chǎng)特征。在脈沖之后，將細(xì)胞稀釋大約10X而成為1ml YEPD肉湯，并在30℃下將其溫育一小時(shí)。
然后收獲細(xì)胞并將其平板接種在選擇性培養(yǎng)基上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用少量(等于稀釋量的電穿孔細(xì)胞)的1X酵母氮基質(zhì)(6.7g/L無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)，Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，MI)一次性洗滌細(xì)胞，并且將其平板接種在基本選擇性培養(yǎng)基上?？梢詫⒕哂衋de2突變的細(xì)胞(已經(jīng)用ADE2選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化過(guò))平板接種在缺乏腺嘌呤的基本培養(yǎng)基(如ADED(表1)或者ADEDS(表1))上。用典型的方法，可以將細(xì)胞的250μl等分平板接種在4個(gè)單獨(dú)ADED或者ADEDS平板上，以便選擇Ade+細(xì)胞。
甲醇畢赤酵母識(shí)別某些極少存在的序列，即所謂的作為DNA復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制序列(ARS)，這些序列可以偶然地發(fā)生于用來(lái)轉(zhuǎn)化的DNA分子中，使轉(zhuǎn)化DNA得以保持在染色體外。然而。整合轉(zhuǎn)化體一般優(yōu)選用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)中。在包含山梨糖醇作為碳源的選擇性培養(yǎng)基上，整合轉(zhuǎn)化體具有超過(guò)ARS轉(zhuǎn)化體的極強(qiáng)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，由此提供了用于從所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中選擇整合轉(zhuǎn)化體的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ARS序列存在于ADE2基因中，并且也有可能存在于甲醇畢赤酵母的AUG1基因中。用ADE2基因轉(zhuǎn)化的甲醇畢赤酵母的ade2宿主細(xì)胞因此可以通過(guò)至少兩種不同的方式成為Ade+。在ADE2基因中的ARS可以使轉(zhuǎn)化DNA的不穩(wěn)定染色體外維持得以存在(Hiep等，酵母，9:1189-1197,1993)。這樣的轉(zhuǎn)化體的菌落的特征為緩慢的生長(zhǎng)速率和粉紅顏色(由于所謂的Ade-子代的大量產(chǎn)生所致)。轉(zhuǎn)化DNA也可以整合入宿主基因組中，產(chǎn)生快速生長(zhǎng)的、白色的以及不能產(chǎn)生可檢測(cè)量Ade-子代的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。ADE D平板使所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞得以最迅速地生長(zhǎng)，并且不穩(wěn)定和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體也以大致相同的速率生長(zhǎng)。在30℃下在ADED平板上溫育3-5天之后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體菌落是白色的，并且大致是不穩(wěn)定的粉紅色轉(zhuǎn)化體的大小的兩倍。ADE DS平板對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體更是選擇性的，該轉(zhuǎn)化體在5-7天之后形成大(≈5mm)菌落，而不穩(wěn)定(ARS保持)菌落則小得多(≈1mm)。因此更具選擇性的ADEDS培養(yǎng)基優(yōu)選鑒定和選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。對(duì)于一些應(yīng)用，如從遺傳多樣性文庫(kù)中篩選遺傳因子的稀有組合，有時(shí)需要篩選大量的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，人們已觀察到不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的數(shù)量超過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的數(shù)量大約100倍。在這樣的情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到平板接種在較少選擇性培養(yǎng)基(如ADED)上轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的用途。
整合轉(zhuǎn)化體優(yōu)選用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法中?？梢栽鲋尺@樣的細(xì)胞而無(wú)需連續(xù)選擇性的壓力，這是因?yàn)镈NA很少?gòu)幕蚪M中失去?？梢杂蒘outhern印跡分析確認(rèn)DNA整合到宿主染色體中。簡(jiǎn)言之，用限制性核酸內(nèi)切酶消化轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的宿主DNA，電泳分離之，將其印跡到支持膜上，以及用適當(dāng)?shù)乃拗鱀NA節(jié)段探測(cè)之。在未轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中觀測(cè)到的片段模式的不同預(yù)示有整合轉(zhuǎn)化?？梢赃x擇限制酶和探針以便在基因組片段中確定轉(zhuǎn)化DNA節(jié)段(如啟動(dòng)子、終止子、異源DNA以及選擇性標(biāo)記序列)。
異源蛋白質(zhì)表達(dá)水平的不同產(chǎn)生于這樣一些因子，如整合位點(diǎn)和表達(dá)盒的拷貝數(shù)以及各個(gè)分離物之間的啟動(dòng)子活性方面的不同。因此在選擇產(chǎn)生菌株之前根據(jù)不同表達(dá)水平篩選一些分離物是有利的。有各種合適的篩選方法可供使用。例如，使轉(zhuǎn)化體菌落生長(zhǎng)在用結(jié)合蛋白質(zhì)的膜(例如硝酸纖維素)覆蓋的平板上。通過(guò)分泌或者其后的裂解以及與膜的結(jié)合，可以使蛋白質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)。然后可以利用已知方法(包括免疫測(cè)定)分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)在液體培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)細(xì)胞以及適當(dāng)?shù)胤治鰲l件培養(yǎng)基或者細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，可以獲得更精確的表達(dá)水平分析。從培養(yǎng)基和溶胞產(chǎn)物中濃縮和純化蛋白質(zhì)的方法部分地由感興趣的蛋白質(zhì)決定。這樣的方法易于由技術(shù)人員選擇和實(shí)踐。
對(duì)于小規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)(例如平板或者搖瓶生產(chǎn))來(lái)說(shuō)，在存在甲醇以及缺乏干擾量的其它碳源(例如葡萄糖)的情況下，使攜帶包含甲醇調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(如AUG1啟動(dòng)子)的表達(dá)盒的甲醇畢赤酵母轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)。對(duì)于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)(包括表達(dá)水平的初步篩選)，可以使轉(zhuǎn)化體在固體培養(yǎng)基上在30℃下生長(zhǎng)，該固體培養(yǎng)基包含，例如20g/LBacto瓊脂(Difco)、6.7g/L無(wú)氨基酸(Difco)的酵母氮基質(zhì)、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素以及0.56g/L-Ade-Thr-Trp粉。因?yàn)榧状际且讚]發(fā)的碳源，所以它在長(zhǎng)時(shí)間溫育時(shí)容易損失。通過(guò)在倒置平板的蓋子上放置50％的甲醇水溶液，可以連續(xù)不斷地供給甲醇，由此蒸發(fā)傳輸將甲醇轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)細(xì)胞上?？偟膩?lái)說(shuō)，每100mm平板利用不到1mL的甲醇。利用生長(zhǎng)在搖瓶中的培養(yǎng)物可以進(jìn)行稍大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。用一典型方法，在如上所述的基本甲醇平板上在30℃下培養(yǎng)細(xì)胞兩天，然后，將菌落用來(lái)接種少量的基本甲醇培養(yǎng)基(6.7g/L無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其細(xì)胞密度為大約1×106個(gè)細(xì)胞/ml。使細(xì)胞在30℃下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在甲醇上的的細(xì)胞有高的需氧量，并需要在培養(yǎng)期間進(jìn)行劇烈搖動(dòng)。每日補(bǔ)充甲醇(典型地為每天1/100量的50％甲醇)。
對(duì)于生產(chǎn)規(guī)模培養(yǎng)，用搖瓶制備高產(chǎn)量克隆的新鮮培養(yǎng)物。然后，所產(chǎn)生的培養(yǎng)物用來(lái)在發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)基。典型地，通過(guò)劇烈振蕩，在YEPD(在30℃下生長(zhǎng)1-2天)中的500ml培養(yǎng)物用來(lái)接種5升發(fā)酵罐。在pH5.0下在28℃下使細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基(包含鹽、葡萄糖、生物素和痕量元素以及＞30％的溶解氧)中。在消耗了(以耗氧量減少作為指示)初填充的葡萄糖之后，將葡萄糖/甲醇進(jìn)料傳送到容器中以便引起感興趣的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因?yàn)樵谙拗铺紬l件下實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的發(fā)酵，所以葡萄糖在進(jìn)料中的存在并不阻抑甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
本發(fā)明由下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)UV暴露來(lái)誘變甲醇畢赤酵母細(xì)胞(來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的CBS6515菌株，Rockville,MD)。通過(guò)以大約200-250個(gè)細(xì)胞/平板將細(xì)胞接種在幾個(gè)平板上，首先產(chǎn)生致死曲線。然后，利用懸掛在離平板表面25cm處的G8T5殺菌燈(Sylvania)，將平板暴露于UV輻射下，持續(xù)時(shí)間如表2所示。然后保護(hù)平板以免可見(jiàn)光源照射并在30℃下溫育兩天。
表2可存活的細(xì)胞時(shí)間 平板1 平板2 平均值0秒 225 2292271秒 200 2472232秒 176 1851814秒 149 86 1188秒 20 7 1416秒 0 2 1然后利用2秒U(xiǎn)V暴露進(jìn)行大規(guī)模誘變，以提供大約20％的殺死。以大約104個(gè)細(xì)胞/平板將細(xì)胞平板接種在八個(gè)YEPD平板上，這些平板用尿嘧啶、腺嘌呤和亮氨酸(每種物質(zhì)各為100mg/L)進(jìn)行補(bǔ)充，補(bǔ)加這些物料以便給可能的缺乏有關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)補(bǔ)料。在UV暴露之后，用箔包裹這些平板，并在30℃下溫育一夜。第二天，將平板上的菌落(總共為大約105)再懸浮于水中，并用水洗滌一次。足以給出0.1-0.2OD600的一定量細(xì)胞懸浮液用來(lái)接種500ml基本肉湯(用無(wú)氨基酸或者無(wú)氨的酵母氮基質(zhì)制得)，其中用1％葡萄糖和400μg/L生物素補(bǔ)料。將培養(yǎng)物放置在2.8L折流板式Bell瓶(baffled Bell flask)中，并且在30℃下劇烈振蕩一夜。第二天，細(xì)胞達(dá)到大約1.0-2.0OD600。使細(xì)胞成球狀，并將其再懸浮于500ml的以5g/L硫酸銨補(bǔ)料的基本肉湯中。將細(xì)胞懸浮液放置在2.8L折流板式Bell瓶中，并在30℃下劇烈振蕩6個(gè)小時(shí)。將50ml培養(yǎng)物放置在250ml瓶中而擱置在一邊作為對(duì)照，并且在其余部分的培養(yǎng)物中加入1mg制霉菌素(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)，以便選擇營(yíng)養(yǎng)突變體(Snow，自然，211:206-207,1966)。通過(guò)振蕩附加的一小時(shí)來(lái)溫育培養(yǎng)物。然后由離心收獲對(duì)照細(xì)胞和制霉菌素處理過(guò)的細(xì)胞，并用水洗滌三次。再懸浮所洗滌的細(xì)胞從而在50％甘油中得到1.0OD600并凍結(jié)之。以菌落形成單位表示的制霉菌素處理過(guò)的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的滴定揭示制霉菌素富集使可存活細(xì)胞的數(shù)量減少了104倍。
將制霉菌素處理過(guò)的細(xì)胞的10-2稀釋液平板接種在15YEPD平板上。將菌落復(fù)制鋪板于基本平板(2％瓊脂，1X YNB,2％葡萄糖，400μg/L生物素)上。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的頻率為大約2-4％。挑選大約180個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌落至YEPD+Ade,Leu,Ura平板中，并將其復(fù)制鋪板于各種點(diǎn)滴(dropout)平板上。所有營(yíng)養(yǎng)缺陷型都是Ade-。其中的30個(gè)在點(diǎn)滴平板上呈現(xiàn)出顯著的粉紅色(LEUD,HISD等參見(jiàn)表1)。在30個(gè)粉紅色突變體中，選擇21個(gè)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，余者對(duì)于在ADED平板上的生長(zhǎng)是滲漏的或者為野生型細(xì)胞所污染。
然后對(duì)Ade-突變體進(jìn)行互補(bǔ)分析和表型檢驗(yàn)。為了確定由突變體限定的基因座的數(shù)量，將所有21個(gè)突變體配對(duì)成單一粉紅色的Ade-檢驗(yàn)菌株(菌株2#)。通過(guò)混合細(xì)胞懸浮液(OD600=1)以及把混合物的10μl等分試樣平板接種在YEPD平板上，來(lái)實(shí)現(xiàn)配對(duì)。然后將細(xì)胞復(fù)制到SPOR培養(yǎng)基(0.5％乙酸鈉，1％KCl,1％葡萄糖，1％瓊脂)上，并在30℃下溫育一夜。然后將細(xì)胞復(fù)制鋪板于ADED平板上以評(píng)價(jià)表型。正如表3所示，一些突變體組合沒(méi)有給出Ade+菌落(可能限定與菌株#2中的相同的遺傳基因座)，而其它突變體組合則產(chǎn)生許多Ade+菌落(可能限定單獨(dú)的遺傳基因座)。因?yàn)楫?dāng)與#2配對(duì)時(shí)，突變體#3給出Ade+菌落，所以用突變體#3重復(fù)互補(bǔ)檢驗(yàn)。如果該組突變體限定兩個(gè)遺傳基因座，那么當(dāng)與#3配對(duì)時(shí)，所有突變體(當(dāng)與菌株#2配對(duì)時(shí)，其沒(méi)有給出Ade+菌落)都應(yīng)該給出Ade+菌落。雜交的結(jié)果顯示在表3中。
表3
正如表3所示，大多數(shù)突變體屬于兩組之一，這與有兩種腺嘌呤生物合成基因(當(dāng)缺失時(shí)，其在有限腺嘌呤培養(yǎng)基上產(chǎn)生粉紅色菌落)的想法一致。三個(gè)菌落(#4、#12和#16)可以限定第三基因座或顯示出基因內(nèi)互補(bǔ)。選擇來(lái)源于兩互補(bǔ)組之每一組的兩種具有強(qiáng)烈色素形成的突變體(#3和#10；#6和#11)進(jìn)一步鑒定。附加的分析表明Ade-是存在于這些菌株中的唯一營(yíng)養(yǎng)缺陷體。
用載體pRS426(一種包含2μ和釀酒酵母URA3序列的穿梭載體，其中的URA3序列使載體pRS426得以在釀酒酵母中增殖)構(gòu)建甲醇畢赤酵母克隆庫(kù)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法由菌株CBS6515制備基因組DNA。簡(jiǎn)言之，在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一夜，用酶解酶原生質(zhì)球化，以及用SDS裂解。用乙醇從溶胞產(chǎn)物中沉淀DNA，并用苯酚/氯仿混合物提取之，然后用乙酸銨和乙醇沉淀。DNA制備物的凝膠電泳顯示出完整的高分子量DNA和可觀數(shù)量的RNA的存在。通過(guò)當(dāng)該酶的一系列稀釋液存在時(shí)培養(yǎng)該DNA，用Sau3A部分消化DNA。由電泳分析消化液的樣品，以便確定片段的大小分布。從凝膠上切割下在4和12kb之間遷移的DNA，并從凝膠切片上提取之。然后將大小分級(jí)的DNA連接到已用Bam HⅠ消化過(guò)和用堿性磷酸酶處理過(guò)的pRS426上。按照制造廠商推薦的方法，利用BioRad Gene PulserTM裝置，在大腸桿菌MC1061細(xì)胞中電穿孔反應(yīng)混合物的等分試樣。
基因組文庫(kù)用來(lái)由電穿孔法(Becker和Guarente，酶學(xué)方法，194:182-187,1991)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株HBY21A(ade2 ura3)。使細(xì)胞再懸浮于1.2M山梨糖醇中，并將六個(gè)300μl的等分試樣平板接種在ADE D、ADE DS、URA D以及URA DS平板(表1)上。在30℃下溫育平板4-5天。在ADE D或者ADE DS平板上沒(méi)有回收到任何Ade+菌落。將得自URA D和URA DS平板的菌落復(fù)制鋪板于ADE D平板上，可獲得兩個(gè)緊密相間的白色菌落。再劃線這些菌落，并確定其為Ura+和Ade+。將這兩種命名為Ade1和Ade6的菌株劃線在包含5FOA(5氟代乳清酸；Sikorski和Boeke，酶學(xué)方法，194:302-318)的培養(yǎng)基上。獲得復(fù)制鋪板時(shí)發(fā)現(xiàn)為Ade-的Ura-菌落。這些結(jié)果表明Ade+互補(bǔ)活性被基因連接到攜帶質(zhì)粒的URA3標(biāo)記上。得自酵母菌株Ade1和Ade6的質(zhì)粒似乎與如下所描述的限制性酶切作圖一致。將這些基因組克隆分別命名為pADE1-1和pADE1-6。
將總DNA與HBY21A轉(zhuǎn)化體Ade1和Ade6分離，并將其用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MC1061為AmpR。由Ade1的2個(gè)AmpR菌落和Ade6的3個(gè)AmpR菌落制備DNA。用PstⅠ、ScaⅠ和PstⅠ+ScaⅠ消化DNA，并由凝膠電泳分析之。所有五個(gè)分離物產(chǎn)生相同的限制圖譜。
由甲醇畢赤酵母P ADE2基因(也稱(chēng)作為ADE1；Hiep等，酵母，9:1251-1258,1993)的公布序列設(shè)計(jì)PCR引物。引物9080(SEQ ID NO:3)設(shè)計(jì)為在ADE2 DNA(SEQ ID NO:Ⅰ)的406-429堿基上引導(dǎo)，引物9079(SEQ ID NO:4)設(shè)計(jì)為在2852-2829堿基上引導(dǎo)。所包含的兩種引物不能在擴(kuò)增序列兩端引入AvrⅡ和SpeⅠ位點(diǎn)。所產(chǎn)生的PCR片段大小的預(yù)測(cè)值為2450bp。
以五個(gè)推定的ADE2克隆作為模板利用質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR。100μl反應(yīng)混合物包含1xTaq PCR緩沖液(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、10-100ng質(zhì)粒DNA、0.25mM dNTPs、100pmol的每種引物以及1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)。PCR包括在94℃下進(jìn)行30次30秒的循環(huán)、在50℃下進(jìn)行30次60秒的循環(huán)、在72℃下進(jìn)行30次120秒的循環(huán)。五個(gè)推定的ADE2基因組克隆之每一個(gè)都產(chǎn)生所需大小(2.4kb)的PCR產(chǎn)物。當(dāng)用BglⅡ或者SalⅠ消化時(shí)，得自一個(gè)反應(yīng)的DNA片段的限制性酶切圖給出所需大小的片段。
集中陽(yáng)性PCR反應(yīng)物并用SpeⅠ消化之。用SpeⅠ消化載體pRS426,并用牛小腸磷酸酶處理之。利用常規(guī)連接條件在10μl反應(yīng)混合物中使4μlPCR片段與1μl載體DNA結(jié)合。由凝膠電泳分析所連接的DNA。分析SpeⅠ消化液以便確定攜帶在pRS426之內(nèi)的ADE2基因的亞克隆的質(zhì)粒。將正確的質(zhì)粒命名為pCZR118。
因?yàn)橐延蒔CR擴(kuò)增了pCZR118中的ADE2基因，所以有可能的是，可以產(chǎn)生使基因的功能特性不能存在的突變。為了檢驗(yàn)這樣的突變，將具有所需插入片段的亞克隆單獨(dú)地轉(zhuǎn)化到釀酒酵母菌株HBY2lA中。使細(xì)胞處于電感受態(tài)，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化之。將轉(zhuǎn)化體平板接種在URA D和ADE D平板上。三個(gè)表型組得到鑒定。克隆1、2、11和12在ADED上產(chǎn)生許多健壯生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化頻率與Ura+轉(zhuǎn)化體的頻率相當(dāng)?？寺?、8、10和14也給出向Ura+和Ade+的高效率的轉(zhuǎn)化，但是Ade+菌落比那些在第一組中的菌落稍小?？寺?產(chǎn)生許多Ura+菌落，但不產(chǎn)生Ade+菌落，這表明克隆3攜帶非功能性ade2突變。集中克隆1、2、11、和12。
為了確定甲醇畢赤酵母ade2互補(bǔ)組，用克隆的ADE基因轉(zhuǎn)化得自每個(gè)互補(bǔ)組的兩個(gè)代表性突變體(#3和#10；#6和#11)，該突變體，當(dāng)其生長(zhǎng)在限制腺嘌呤上時(shí)，基于深紅色素形成進(jìn)行選擇。由離心(3000xg,3分鐘)收獲早期對(duì)數(shù)期細(xì)胞的200ml培養(yǎng)物，并將其再懸浮于20ml的新鮮KD緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5，包含25mM DTT)。在30℃下在這一緩沖液中溫育細(xì)胞15分鐘。然后收獲細(xì)胞，并將其再懸浮于200ml用冰預(yù)冷的STM(270mM蔗糖，10mM Tris,pH7.5,1mMMgCl2)中。收獲細(xì)胞，并將其再懸浮于100ml用冰預(yù)冷的STM中。再一次收獲細(xì)胞，并將其再懸浮于3-5ml用冰預(yù)冷的STM中。然后使來(lái)源于每種培養(yǎng)物的電感受態(tài)細(xì)胞的100μl的等分試樣與NotⅠ消化的pADE1-1DNA混合。將細(xì)胞/DNA混合物放置在2mm電穿孔小池中，并利用設(shè)置為1000Ω電阻和25μF電容的BioRad Gene PulserTM使該混合物受于5kV/cm的脈沖電場(chǎng)中。在脈沖之后，通過(guò)加入1ml YEPD來(lái)稀釋細(xì)胞，并在30℃下溫育一小時(shí)。然后由和緩離心收獲細(xì)胞，并再懸浮于缺乏腺嘌呤的400μl基本選擇性培養(yǎng)基(ADED)中。將再懸浮樣品分成200μl的等分試樣，并將其平板接種在ADED和ADEDS平板上。在30℃下溫育平板4-5天。突變體#6和#11給出Ade+轉(zhuǎn)化體。當(dāng)DNA被省略時(shí)，沒(méi)有觀察到任何Ade+轉(zhuǎn)化體，因此，兩個(gè)分離物似乎限定ade2互補(bǔ)組。ADE2序列顯示在SEQ ID NO:1中。實(shí)施例2實(shí)施例1中所揭示的甲醇畢赤酵母克隆庫(kù)用作為克隆醇利用基因(AUG1)的源?？寺?kù)作為獨(dú)立庫(kù)存儲(chǔ)，其中每個(gè)庫(kù)表示大約200-250個(gè)個(gè)體基因組克隆。來(lái)源于每個(gè)庫(kù)的0.1μl＂小量制備＂DNA在利用PCR引物(8784,SEQ ID NO:5；8787,SEQ ID NO:6)的聚合酶鏈反應(yīng)中用作為模板，該P(yáng)CR引物由在多形漢遜酵母、博伊丁假絲酵母和巴斯德畢赤酵母的醇氧化酶基因中的保守序列的排列來(lái)設(shè)計(jì)。擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行如下在94℃下30個(gè)30秒的循環(huán)，在50℃下30個(gè)30秒的循環(huán)，在72℃下30個(gè)60秒的循環(huán)；隨后在72℃下溫育7分鐘。一個(gè)庫(kù)(#5)給出大約600bp帶。這一PCR產(chǎn)物的DNA測(cè)序揭示它編碼這樣一種氨基酸序列，該氨基酸序列與為AOX1基因所編碼的巴斯德畢赤酵母醇氧化酶之間有大約70％的序列等同性，與為MOX1基因所編碼的多形漢遜酵母醇氧化酶之間有大約85％的序列等同性?？寺〉腁UG1基因的序列顯示在SEQ IDNO:2中。
利用與初始擴(kuò)增中所用的相同的引物由PCR分析#5庫(kù)的亞庫(kù)。進(jìn)一步分解一個(gè)陽(yáng)性亞庫(kù)以便確定陽(yáng)性菌落。在平板上劃線這一陽(yáng)性菌落，并由個(gè)體菌落制備DNA。在用ClaⅠ消化之后，三個(gè)菌落給出同一模式。
基因組克隆和PCR產(chǎn)物的限制性酶切圖揭示AUG1基因位于7.5kb基因組插入片段上，并且在PCR片段之內(nèi)的位點(diǎn)可以在基因組插入片段之內(nèi)得到獨(dú)一無(wú)二的確定。因?yàn)樵赑CR片段之內(nèi)的基因的取向是已知的，因此后一條信息提供在基因組插入片段之內(nèi)的AUG1基因的近似位置和轉(zhuǎn)錄方向。在這一區(qū)域之內(nèi)的DNA測(cè)序揭示基因在氨基酸水平上與其它已知的醇氧化酶基因之間有十分高的序列相似性。實(shí)施例3用包含AUG1啟動(dòng)子和終止子、人GAD65 DNA(Karlsen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88:8337-8341,1991)以及ADE2選擇性標(biāo)記的表達(dá)載體，基本上按照如上所述的過(guò)程，由電穿孔法轉(zhuǎn)化ade2突變的甲醇畢赤酵母細(xì)胞。使菌落在瓊脂基本甲醇平板(每100mm平板10至100個(gè)菌落)上形成膜片，該平板包含20g/L BactoTM瓊脂(Difco)、6.7g/L無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)(Difco)、10g/L甲醇以及0.4μg/L生物素。用硝酸纖維素覆蓋瓊脂，并將平板倒置在包含1ml 50％甲醇(在水中)的蓋子上，并在30℃下溫育3至5天。然后將膜轉(zhuǎn)移至浸泡在0.2M NaOH、0.1％SDS、35mM二硫蘇糖醇中的濾器上以便裂解粘著細(xì)胞。在30分鐘之后，用蒸餾水從濾器沖洗下細(xì)胞碎片，并通過(guò)在0.1M乙酸中沖洗30分鐘來(lái)中和濾器。
然后分析濾器中的粘著蛋白質(zhì)。通過(guò)在室溫下在TTBS-NFM(20mMTris pH7.4,0.1％Tween 20,160 mM NaCl,5％的無(wú)脂牛奶粉)中漂洗30分鐘，封阻未占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)。然后將濾器轉(zhuǎn)移到包含GAD6單克隆抗體(Chang和Gottlieb,J.Neurosci,8:2123-2130,1988)的溶液中，該單克隆抗體在TTBS-NFM中的稀釋比率為1∶1000。在該抗體溶液中對(duì)濾器進(jìn)行伴有至少一小時(shí)的和緩攪拌的溫育，然后用TTBS(20mM TrispH7.4,0.1％Tween 20,160mM NaCl)洗滌兩次，每次五分鐘。然后用與辣根過(guò)氧化物酶(1μg/ml TTBS-NFM)綴合的山羊抗小鼠抗體溫育濾器至少一小時(shí)，然后用TTBS洗滌濾器三次，每次5分鐘。然后使濾器暴露于市售的化學(xué)發(fā)光試劑(ECLTM；Amersham Inc.,Arlington Heigths,IL)下。在X光膠卷上檢測(cè)由陽(yáng)性膜片產(chǎn)生的光線。
為了更精確地檢測(cè)GAD65表達(dá)的水平，在搖瓶培養(yǎng)物中培養(yǎng)候選克隆。按照如上所述的方法，使菌落在30℃下在基本甲醇平板上生長(zhǎng)兩天。菌落用來(lái)接種20ml基本甲醇培養(yǎng)基(6.7g/L的無(wú)氨基酸的酵母氮基質(zhì)、10g/L甲醇、0.4μg/L生物素)，其細(xì)胞密度為1×106個(gè)細(xì)胞/毫升。在劇烈振蕩下使培養(yǎng)物在30℃下生長(zhǎng)1-2天。每日在每種培養(yǎng)物中加入0.2ml的50％甲醇。由離心收獲細(xì)胞，并且將其懸浮于用冰預(yù)冷的裂解緩沖液(20mM Tris pH8.0,40mM NaCl,2mM PMSF,1mM EDTA,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，1μg/ml抑蛋白酶肽)中，其終體積為每g細(xì)胞糊狀物10ml裂解緩沖液。將2.5ml所產(chǎn)生的懸浮液加入至2.5ml的400-600微米的、用冰預(yù)冷的、酸洗滌過(guò)的玻璃珠(其置于15ml容器中)中，并劇烈攪拌混合物一分鐘，然后在冰上溫育1分鐘。重復(fù)這一過(guò)程直到細(xì)胞已經(jīng)被攪拌了總共五分鐘。由離心(1000xg,5分鐘)除去大的碎片和未被打碎的細(xì)胞。然后將澄清的溶胞產(chǎn)物倒入一個(gè)干凈的容器中。用樣品緩沖液(5％SDS,8M尿素，100mM Tris pH6.8,10％甘油，2mM EDTA,0.01％溴酚藍(lán))稀釋澄清的溶胞產(chǎn)物，并在4-20％丙烯酰胺梯度凝膠(Novex,San Diego,CA)上電泳。將蛋白質(zhì)印跡到硝酸纖維素上，并用如上所述的GAD6抗體檢測(cè)之。
在高細(xì)胞密度發(fā)酵條件下，對(duì)在搖瓶培養(yǎng)中顯示出甲醇誘導(dǎo)的外源蛋白質(zhì)的最高表達(dá)水平的克隆進(jìn)行更深入的分析。首先在劇烈攪拌下在30℃下在0.5升YEPD肉湯中培養(yǎng)細(xì)胞1-2天，然后利用其來(lái)接種5升發(fā)酵裝置(例如BioFlowⅢ；New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,NJ)。首先通過(guò)加入57.8g(NH4)2SO4、68gKH2PO4、30.8gMgSO4·7H2O、8.6gCaSO4·2H2O、2.0gNaCl以及10ml消泡劑(PPG)，用礦物鹽來(lái)填裝發(fā)酵容器。加入H2O以形成2.5L體積，并將溶液高壓滅菌40分鐘。在冷卻之后，加入350ml的50％葡萄糖、250ml的10X痕量元素(表4)、25ml的200μg/ml生物素以及250ml細(xì)胞接種物。
表410X痕量元素FeSO4·7H2O100mM27.8g/LCuSO4·5H2O2mM 0.5g/LZnCl28mM 1.09g/LMnSO4·H2O 8mM 1.35g/LCoCl2·6H2O2mM 0.48g/LNa2MoO4·2H2O 1mM 0.24g/LH3BO38mM 0.5g/LKI0.5mm0.08g/L生物素 5mg/L硫胺素 0.5g/L每升加入1-2毫升H2SO4以便使化合物形成溶液將發(fā)酵容器設(shè)置在28℃、pH5.0和＞30％溶氧量下運(yùn)行。細(xì)胞將消耗初始的葡萄糖填裝物(這由消耗葡萄糖期間的需氧量急劇增加表明)，其后，在葡萄糖被耗盡之后耗氧量減少。在初始的葡萄糖填裝物用盡之后，將補(bǔ)加有NH4+和痕量元素的葡萄糖-甲醇進(jìn)料輸送到容器中，其中0.2％(w/v)葡萄糖、0.2％(w/v)甲醇進(jìn)料5個(gè)小時(shí)，其后為0.1％(w/v)葡萄糖、0.4％(w/v)甲醇進(jìn)料25小時(shí)。以純甲醇計(jì)，利用12.5ml/hr的初始輸送速率和25ml/hr的最終速率通過(guò)容器的一個(gè)端口供給總共550克甲醇。利用包含175克葡萄糖、250ml 10X痕量元素以及99g(NH4)2SO4的700ml溶液，通過(guò)第二個(gè)端口供給葡萄糖。在這些條件下，葡萄糖和甲醇同時(shí)得到利用，并且伴隨一旦葡萄糖-甲醇進(jìn)料開(kāi)始，就誘導(dǎo)GAD65表達(dá)。按照如上所述的用于搖瓶培養(yǎng)的方法，分析得自發(fā)酵容器的細(xì)胞的GAD65表達(dá)。
以一定時(shí)間間隔從發(fā)酵容器移去細(xì)胞，并隨后對(duì)其進(jìn)行分析。在利用葡萄糖的生長(zhǎng)期間觀察到低GAD65表達(dá)。葡萄糖的耗盡導(dǎo)致GAD65蛋白質(zhì)的低水平表達(dá)；在發(fā)酵培養(yǎng)物的進(jìn)料期間通過(guò)加入MeOH可提高表達(dá)水平。甲醇的加入對(duì)由甲醇反應(yīng)性AUG1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人GAD65的表達(dá)有明顯的刺激作用。實(shí)施例4研究轉(zhuǎn)化條件以便確定最適于甲醇畢赤酵母的有效轉(zhuǎn)化的電場(chǎng)條件、DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及DNA濃度。所有實(shí)驗(yàn)都利用甲醇畢赤酵母ade2菌株#11。按照如前所述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。利用BioRad GenePulserTM實(shí)施電穿孔法。
三個(gè)電場(chǎng)參數(shù)影響電穿孔的轉(zhuǎn)化效率電容、電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時(shí)間。電場(chǎng)強(qiáng)度由電脈沖的電壓決定，而脈沖持續(xù)時(shí)間則由儀器設(shè)置的電阻決定。在這一組實(shí)驗(yàn)中，檢查了一組在各種電阻下的電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置。在所有實(shí)驗(yàn)中，都利用了儀器的最高電容設(shè)置(25μF)。在冰上使電感受態(tài)細(xì)胞的100μl等分試樣與10μlDNA混合，該DNA包含大約1μg的ADE2質(zhì)粒pCZR133，該質(zhì)粒已用限制酶NotⅠ線性化。將細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)移到2mm的電穿孔小池(BTX Corp.,San Diego,CA)中，并使之接受電場(chǎng)強(qiáng)度為0.5kV(2.5kV/cm)、0.75kV(3.75kV/cm)、1.0kV(5.0kV/cm)、1.25kV(6.25kV/cm)以及1.5kV(7.5kV/cm)的電脈沖。在各種脈沖持續(xù)時(shí)間下檢查這些場(chǎng)強(qiáng)條件。通過(guò)將儀器電阻改變?yōu)?00歐姆、600歐姆或者＂無(wú)窮大＂歐姆值來(lái)調(diào)控脈沖持續(xù)時(shí)間。將脈沖過(guò)的細(xì)胞懸浮于YEPD中，并在30℃下溫育一小時(shí)，并收獲、再懸浮和平板接種之。進(jìn)行三組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。在每一組中都發(fā)現(xiàn)相比于所檢驗(yàn)的其它條件，在＂無(wú)窮大＂歐姆值的電阻下的0.75kV(3.75kV/cm)的電穿孔條件給出極高的轉(zhuǎn)化效率(參見(jiàn)圖1)。
在建立最適脈沖條件之后，研究DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。使電感受態(tài)細(xì)胞與1μg未切割的環(huán)狀pCZR133混合，或者與1μgNotⅠ消化的pCZR133混合。在三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，用環(huán)狀DNA回收平均大約25個(gè)轉(zhuǎn)化體，而線型DNA產(chǎn)生平均近1×104個(gè)轉(zhuǎn)化體。這些數(shù)據(jù)表明相比于環(huán)狀DNA，線型DNA以大得多的效率轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母。
最后，研究DNA濃度和轉(zhuǎn)化效率之間的關(guān)系。使線型pCZR133 DNA的等分試樣(1ng、10ng、100ng和1μg，在10μl水中)與100μl電感受態(tài)細(xì)胞混合，并在3.75kV/cm和＂無(wú)窮大＂歐姆值下實(shí)施電穿孔法。轉(zhuǎn)化體的數(shù)量變化于大約10(1ng DNA)至104(1μgDNA)之間，并且發(fā)現(xiàn)該數(shù)量與DNA濃度成正比。實(shí)施例5通過(guò)比較來(lái)源于野生型細(xì)胞和穩(wěn)定的白色轉(zhuǎn)化體菌落的DNA，檢測(cè)到轉(zhuǎn)化DNA整合進(jìn)入甲醇畢赤酵母的基因組。鑒定出兩類(lèi)整合轉(zhuǎn)化體。在第一類(lèi)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化DNA整合進(jìn)入同源位點(diǎn)。在第二類(lèi)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化DNA取代內(nèi)源性AUG1開(kāi)放讀框。雖然不希望被理論所束縛，但一般認(rèn)為第二類(lèi)轉(zhuǎn)化體的出現(xiàn)是“置換型重組事件”(Rothstein，酶學(xué)方法，194:281-301,1991)，其中轉(zhuǎn)化DNA經(jīng)由雙重組事件取代內(nèi)源性DNA。
用AspⅠ消化過(guò)的pCZR140將甲醇畢赤酵母ade2菌株#11轉(zhuǎn)化成為Ade+,pCZR140即一種基于Bluescript(Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla,CA)的載體，該載體包含甲醇畢赤酵母ADE2基因和AUG1的突變體，其中在啟動(dòng)子和終止子區(qū)域之間的整個(gè)開(kāi)放讀框都已被缺失(圖2)。由野生型細(xì)胞和在30℃下在YEPD平板上生長(zhǎng)兩天的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞制備基因組DNA。將大約100-200μl細(xì)胞懸浮于1ml H2O中，然后在微量離心機(jī)中離心30秒?；厥占?xì)胞沉淀，并將其再懸浮于400μl SCE+DTT+酶解酶(1.2M山梨糖醇，10mM檸檬酸鈉，10mM EDTA,10mM DTT,1-2mg/ml酶解酶100T)中，并在37℃下溫育10-15分鐘。加入400μl的1％SDS，并混合溶液直到澄清。加入300μl的5M乙酸鉀(pH8.9)，混合溶液并在微量離心機(jī)中以全速離心五分鐘。將750μl上清液轉(zhuǎn)移到一新試管中，并用等體積苯酚/氯仿提取之?；厥?00μl所產(chǎn)生的上清液，并通過(guò)加入2倍體積的乙醇和在冷室中離心15分鐘來(lái)沉淀DNA。在65℃下，在50mlTE(10mM Tris pH8,1mM EDTA)+100μg/ml RNA酶中，將DNA沉淀再懸浮大約1小時(shí)。在37℃下，用在100μl反應(yīng)量中的Eco RⅠ(5μl)消化10μl DNA樣品一夜。用乙醇沉淀DNA，由離心回收之，并將其再懸浮于7.5μl TE+2.5μl 5X加樣染料中。將全部10ml量施用于在0.5XTBE(10 X TBE是108g/L Tris堿7-9,55g/L硼酸，8.3g/L EDTA二鈉)凝膠中的0.7％瓊脂糖的一條泳道上。在包含溴化乙錠的0.5 X TBE中在100V下運(yùn)行凝膠。給凝膠拍照，并在400mA、20mV下用30分鐘將DNA電泳轉(zhuǎn)移到正衍生的尼龍膜(NytranN+,Schleicher&Schuell,Keene,NH)上。然后用2 X SSC沖洗該膜，該膜在變性溶液上印跡五分鐘，用2 X SSC中和，然后在UV交聯(lián)劑(Stratalinker,Stratagene克隆系統(tǒng))中根據(jù)其自動(dòng)設(shè)置交聯(lián)阻尼。利用市售的試劑盒(ECLTM試劑盒，Amersham Corp.,Arlington Heigthts,IL)，使印跡雜交到PCR產(chǎn)生的AUG1啟動(dòng)子探針上。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化DNA改變AUG1啟動(dòng)子DNA的結(jié)構(gòu)，這與同源整合事件(圖2)一致。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用NotⅠ消化過(guò)的pCZR137將甲醇畢赤酵母ade2菌株#11轉(zhuǎn)化成為Ade+,pCZR137即在AUG1啟動(dòng)子和終止子之間包含人GAD65cDNA的載體(圖3)。按照如上所述的方法，由野生型細(xì)胞和穩(wěn)定的白色Ade+轉(zhuǎn)化體制備基因組DNA，并用Eco RⅠ消化之。由電泳分離出所消化的DNA，并且將其印跡到膜上。用由PCR產(chǎn)生的、與AUG1開(kāi)放讀框或者AUG1啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的探針探測(cè)印跡。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)化體菌株中缺失AUG1開(kāi)放讀框DNA，并且AUG1啟動(dòng)子區(qū)域已經(jīng)歷過(guò)顯著的重排。這些結(jié)果與轉(zhuǎn)化DNA和宿主基因組之間的雙重組事件(置換型)(圖3)一致。
按照以上所述，明顯的是雖然為了說(shuō)明本發(fā)明本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是可以對(duì)其進(jìn)行各種修飾而不偏離本發(fā)明的精神與范圍。因此，除所附的權(quán)利要求書(shū)的限定外，本發(fā)明無(wú)其它限制。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Raymond,Christopher K.
Holderman,Susan D.
Vanaja,Erica(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)甲醇畢赤酵母的轉(zhuǎn)化(ⅲ)序列數(shù)6(ⅳ)通訊地址(A)收信人ZymoGenetics,Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州WA(E)國(guó)家美國(guó)(F)ZIP:98102(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ 1.5版(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Parker,Gary E(B)登記號(hào)31,648(C)參考/證書(shū)號(hào)95-37(ⅸ)聯(lián)系信息(A)電話206-442-6673
(B)傳真206-442-6678(2)關(guān)于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度3077個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型基因組DNA(ⅲ)假擬無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類(lèi)型(ⅵ)最初來(lái)源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CAGCTGCTCT GCTCCTTGAT TCGTAATTAA TGTTATCCTT TTACTTTGAA CTCTTGTCGG60TCCCCAACAG GGATTCCAAT CGGTGCTCAG CGGGATTTCC CATGAGGTTT TTGACAACTT 120TATTGATGCT GCAAAAACTT TTTTAGCCGG GTTTAAGTAA CTGGGCAATA TTTCCAAAGG 180CTGTGGGCGT TCCACACTCC TTGCTTTTCA TAATCTCTGT GTATTGTTTT ATTCGCATTT 240TGATTCTCTT ATTACCAGTT ATGTAGAAAG ATCGGCAAAC AAAATATCAA CTTTTATCTT 300GAACGCTGAC CCACGGTTTC AAATAACTAT CAGAACTCTA TAGCTATAGG GGAAGTTTAC 360TGCTTGCTTA AAGCGGCTAA AAAGTGTTTG GCAAATTAAA AAAGCTGTGA CAAGTAGGAA 420CTCCTGTAAA GGGCCGATTC GACTTCGAAA GAGCCTAAAA ACAGTGACTA TTGGTGACGG 480AAAATTGCTA AAGGAGTACT AGGGCTGTAG TAATAAATAA TGGAACAGTG GTACAACAAT 540AAAAGAATGA CGCTGTATGT CGTAGCCTGC ACGAGTAGCT CAGTGGTAGA GCAGCAGATT 600GCAAATCTGT TGGTCACCGG TTCGATCCGG TCTCGGGCTT CCTTTTTTGC TTTTTCGATA 660TTTGCGGGTA GGAAGCAAGG TCTAGTTTTC GTCGTTTCGG ATGGTTTACG AAAGTATCAG 720CCATGAGTGT TTCCCTCTGG CTACCTAATA TATTTATTGA TCGGTCTCTC ATGTGAATGT 780TTCTTTCCAA GTTCGGCTTT CAGCTCGTAA ATGTGCAAGA AATATTTGAC TCCAGCGACC 840TTTCAGAGTC AAATTAATTT TCGCTAACAA TTTGTGTTTT TCTGGAGAAA CCTAAAGATT 900TAACTGATAA GTCGAATCAA CATCTTTAAA TCCTTTAGTT AAGATCTCTG CAGCGGCCAG960TATTAACCAA TAGCATATTC ACAGGCATCA CATCGGAACA TTCAGAATGG ACTCGCAAAC 1020TGTCGGGATT TTAGGTGGTG GCCAACTTGG TCGTATGATC GTTGAAGCTG CACACAGATT 1080GAATATCAAA ACTGTGATTC TCGAAAATGG AGACCAGGCT CCAGCAAAGC AAATCAACGC 1140TTTAGATGAC CATATTGACG GCTCATTCAA TGATCCAAAA GCAATTGCCG AATTGGCTGC 1200CAAGTGTGAT GTTTTAACCG TTGAGATTGA ACATGTTGAC ACTGATGCGT TGGTTGAAGT 1260TCAAAAGGCA ACTGGCATCA AAATCTTCCC ATCACCAGAA ACTATTTCAT TGATCAAAGA 1320TAAATACTTG CAAAAAGAGC ATTTGATTAA GAATGGCATT GCTGTTGCCG AATCTTGTAG 1380TGTTGAAAGT AGCGCAGCAT CTTTAGAAGA AGTTGGTGCC AAATACGGCT TCCCATACAT 1440GCTAAAATCT AGAACAATGG CCTATGACGG AAGAGGTAAT TTTGTTGTCA AAGACAAGTC 1500ATATATACCT GAAGCTTTGA AAGTTTTAGA TGACAGGCCG TTATACGCCG 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2400TGGTGCCGCT CATTTACCGG GAATGGTTGC GGCGATGACG CCGCTGCCTG TTATTGGTGT 2460CCCTGTTAAA GGCTCTACTT TGGATGGTGT TGATTCACTA CACTCCATCG TTCAAATGCC 2520AAGAGGTATT CCTGTTGCTA CTGTGGCTAT TAACAATGCT ACTAACGCTG CCTTGCTAGC 2580TATCACAATC TTAGGTGCCG GCGATCCAAA TACTTGTCTG CAATGGAAGT TTATATGAAC 2640AATATGGAAA ATGAAGTTTT GGGCAAGGCT GAAAAATTGG AAAATGGTGG ATATGAAGAA 2700TACTTGAGTA CATACAAGAA GTAGAACCTT TTATATTTGA TATAGTACTT ACTCAAAGTC 2760TTAATTGTTC TAACTGTTAA TTTCTGCTTT GCATTTCTGA AAAGTTTAAG ACAAGAAATC 2820TTGAAATTTC TAGTTGCTCG TAAGAGGAAA CTTGCATTCA AATAACATTA ACAATAAATG 2880ACAATAATAT ATTATTTCAA CACTGCTATA TGGTAGTTTT ATAGGTTTGG TTAGGATTTG 2940AGATATTGCT AGCGCTTATC ATTATCCTTA ATTGTTCATC GACGCAAATC GACGCATTTC 3000CACAAAAATT TTCCGAACCT GTTTTTCACT TCTCCAGATC TTGGTTTAGT ATAGCTTTTG 3060ACACCTAATA CCTGCAG 3077(2)關(guān)于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度3386個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類(lèi)型基因組DNA(ⅲ)假擬無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅴ)片段類(lèi)型(ⅵ)最初來(lái)源(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2GAATTCCTGC AGCCCGGGGG ATCGGGTAGT GGAATGCACG GTTATACCCA CTCCAAATAA 60AAGTGTAGTA GCCGGACTGA AAGGTTTTAG GAGTCTGTTT GTTTGTTCAT GTGCATCATT120CCCTAATCTG TTAACAGTCT CGGAGTATAC AAAAAAGTAA GTCAAATATC AAGGTGGCCG180GGGGCAGCAT CGAGACTCGA GATGGTACAT ACTTAAAAGC TGCCATATTG AGGAACTTCA240AAGTTTTATC TGTTTTTAGA ATTAAAAGAC GATTGTTGTA ACAAAACGTT GTGCCTACAT300AAACTCAAAT TAATGGAAAT AGCCTGTTTT GAAAAATACA CCTTCTTAAG TACTGACAAA360GTTTTGTTAA ATGACTATCG AACAAGCCAT GAAATAGCAC ATTTCTGCCA GTCACTTTTA420ACACTTTCCT GCTTGCTGGT TGACTCTCCT CATACAAACA CCCAAAAGGG AAACTTTCAG480TGTGGGGACA CTTGACATCT CACATGCACC CCAGATTAAT TTCCCCAGAC GATGCGGAGA540CAAGACAAAA CAACCCTTTG TCCTGCTCTT TTCTTTCTCA CACCGCGTGG GTGTGTGCGC600AGGCAGGCAG GCAGGCAGCG GGCTGCCTGC CATCTCTAAT CGCTGCTCCT CCCCCCTGGC660TTCAAATAAC AGCCTGCTGC TATCTGTGAC CAGATTGGGA CACCCCCCTC CCCTCCGAAT720GATCCATCAC CTTTTGTCGT ACTCCGACAA TGATCCTTCC CTGTCATCTT CTGGCAATCA780GCTCCTTCAA TAATTAAATC AAATAAGCAT AAATAGTAAA ATCGCATACA AACGTCATGA840AAAGTTTTAT CTCTATGGCC AACGGATAGT CTATCTGCTT AATTCCATCC ACTTTGGGAA900CCGCTCTCTC TTTACCCCAG ATTCTCAAAG CTAATATCTG CCCCTTGTCT ATTGTCCTTT960CTCCGTGTAC AAGCGGAGCT TTTGCCTCCC ATCCTCTTGC TTTGTTTCGG TTATTTTTTT 1020TTCTTTTGAA ACTCTTGGTC AAATCAAATC AAACAAAACC AAACCTTCTA TTCCATCAGA 1080TCAACCTTGT TCAACATTCT ATAAATCGAT ATAAATATAA CCTTATCCCT CCCTTGTTTT 1140TTACCAATTA ATCAATCTTC AAATTTCAAA TATTTTCTAC TTGCTTTATT ACTCAGTATT 1200AACATTTGTT TAAACCAACT ATAACTTTTA ACTGGCTTTA GAAGTTTTAT TTAACATCAG 1260TTTCAATTTA CATCTTTATT TATTAACGAA ATCTTTACGA ATTAACTCAA TCAAAACTTT 1320TACGAAAAAA AAATCTTACT ATTAATTTCT CAAAATGGCT ATTCCAGATG AATTTGATAT 1380TATTGTTGTC GGTGGTGGTT CCACCGGTTG TGCTCTTGCT GGTAGATTAG GTAACTTGGA 1440CGAAAACGTC ACAGTTGCTT TAATCGAAGG TGGTGAAAAC AACATCAACA ACCCATGGGT 1500TTACTTACCA GGTGTTTATC CAAGAAACAT GAGATTAGAC TCAAAGACTG CTACTTTTTA 1560CTCTTCAAGA CCATCACCAC ACTTGAACGG TAGAAGAGCT ATTGTTCCAT GTGCTAACAT 1620CTTGGGTGGT GGTTCTTCCA TCAACTTCTT GATGTACACC AGAGCCTCTG CCTCCGATTA 1680CGATGATTGG GAATCTGAAG GTTGGACTAC CGATGAATTA TTACCACTAA TGAAGAAGAT 1740TGAAACTTAT CAAAGACCAT GTAACAACAG AGAATTGCAC GGTTTCGATG GTCCAATTAA 1800GGTTTCATTT GGTAACTATA CTTATCCAAA CGGTCAAGAT TTCATTAGAG CTGCCGAATC 1860TCAAGGTATT CCATTTGTTG ATGATGCTGA AGATTTGAAA TGTTCCCACG GTGCTGAGCA 1920CTGGTTGAAG TGGATCAACA GAGACTTAGG TAGAAGATCC GATTCTGCTC ATGCTTACAT 1980TCACCCAACC ATGAGAAACA AGCAAAACTT GTTCTTGATT ACTTCCACCA AGTGTGAAAA 2040GATTATCATT GAAAACGGTG TTGCTACTGG TGTTAAGACT GTTCCAATGA AGCCAACTGG 2100TTCTCCAAAG ACCCAAGTTG CTAGAACTTT CAAGGCTAGA AAGCAAATTA TTGTTTCTTG 2160TGGTACTATC TCATCACCAT TAGTTTTGCA AAGATCTGGT ATCGGTTCCG CTCACAAGTT 2220GAGACAAGTT GGTATTAAAC CAATTGTTGA CTTACCAGGT GTTGGTATGA ACTTCCAAGA 2280TCACTACTGT TTCTTCACTC CATACCATGT CAAGCCAGAT ACTCCATCAT TCGATGACTT 2340TGTTAGAGGT GATAAAGCTG TTCAAAAATC TGCTTTCGAC CAATGGTATG CTAACAAGGA 2400TGGTCCATTA ACCACTAATG GTATTGAGGC AGGTGTTAAG ATTAGACCAA CTGAAGAAGA 2460ATTAGCCACT GCTGATGACG AATTCAGAGC TGCTTATGAT GACTACTTTG GTAACAAGCC 2520AGATAAGCCA TTAATGCACT ACTCTCTAAT TTCTGGTTTC TTTGGTGACC ACACCAAGAT 2580TCCAAACGGT AAGTACATGT GCATGTTCCA CTTCTTGGAA TATCCATTCT CCAGAGGTTT 2640CGTTCACGTT GTTTCTCCAA ACCCATACGA TGCTCCTGAC TTTGATCCAG GTTTCATGAA 2700CGATCCAAGA GATATGTGGC CAATGGTTTG GTCTTACAAG AAGTCCAGAG AAACTGCCAG 2760AAGAATGGAC TGTTTTGCCG GTGAAGTTAC TTCTCACCAC CCACACTACC CATACGACTC 2820ACCAGCCAGA GCTGCTGACA TGGACTTGGA AACTACTAAA GCTTATGCTG GTCCAGACCA 2880CTTTACTGCT AACTTGTACC ACGGTTCATG GACTGTTCCA ATTGAAAAGC CAACTCCAAA 2940GAACGCTGCT CACGTTACTT CTAACCAAGT TGAAAAACAT CGTGACATCG AATACACCAA 3000GGAGGATGAT GCTGCTATCG AAGATTACAT CAGAGAACAC ACTGAAACCA CATGGCATTG 3060TCTTGGTACT TGTTCAATGG CTCCAAGAGA AGGTTCTAAG GTTGTCCCAA CTGGTGGTGT 3120TGTTGACTCC AGATTAAACG TTTACGGTGT TGAAAAGTTG AAGGTTGCTG ATTTATCAAT 3180TTGCCCAGAT AATGTTGGTT GTAACACTTA CTCTACTGCT TTGTTAATCG GTGAAAAGGC 3240TTCTACCTTA GTTGCTGAAG ACTTGGGCTA CTCTGGTGAT GCTTTGAAGA TGACTGTTCC 3300AAACTTCAAA TTGGGTACTT ATGAAGAAGC TGGTCTAGCT AGATTCTAGG GCTGCCTGTT 3360TGGATATTTT TATAATTTTT GAGAGT3386(2)關(guān)于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3TGATCACCTA GGACTAGTGA CAAGTAGGAA CTCCTGTA 38(2)關(guān)于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:4CAGCTGCCTA GGACTAGTTT CCTCTTACGA GCAACTAGA39(2)關(guān)于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5TGGTTGAAGTGGATCAA 17(2)關(guān)于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6GTGTGGTCACCGAAGAA 1權(quán)利要求
1．一種將DNA分子導(dǎo)入甲醇畢赤酵母細(xì)胞的方法，該方法包括在線性DNA分子的存在下，使甲醇畢赤酵母細(xì)胞暴露于呈指數(shù)衰變的，場(chǎng)強(qiáng)為2.5-4.5kV/cm，且時(shí)間常數(shù)為1-40毫秒的脈沖電場(chǎng)中，由此將所說(shuō)的DNA分子導(dǎo)入所說(shuō)的細(xì)胞。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的DNA分子包含編碼一種多肽的節(jié)段，所說(shuō)的多肽不是甲醇畢赤酵母多鈦，可操作地連接到甲醇畢赤酵母基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和甲醇畢赤酵母基因轉(zhuǎn)錄終止子上。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是甲醇畢赤酵母AUG1基因啟動(dòng)子。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的AUG1基因啟動(dòng)子包含如SEQ IDNO2所示的核苷酸24至核苷酸1354的核苷酸序列。
5．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說(shuō)的DNA分子進(jìn)一步包含補(bǔ)充宿主細(xì)胞中的突變的選擇性標(biāo)記基因。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的選擇性標(biāo)記基因是甲醇畢赤酵母基因。
7．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記基因是甲醇畢赤酵母ADE2基因。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的ADE2基因包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸407至核苷酸2851的核苷酸序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的DNA分子包含補(bǔ)充宿主細(xì)胞中的突變的選擇性標(biāo)記基因。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記基因是甲醇畢赤酵母基因。
11．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記基因是甲醇畢赤酵母ADE2基因。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所說(shuō)的ADE2基因包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸407至核苷酸2851的核苷酸序列。
13．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的時(shí)間常數(shù)為10-30毫秒。
14．一種用異源DNA轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的方法，該方法包括在異源線性DNA分子的存在下，使甲醇畢赤酵母細(xì)胞的群體暴露于呈指數(shù)衰變的，場(chǎng)強(qiáng)為2.5-4.5kV/cm且時(shí)間常數(shù)為1-40毫秒的脈沖電場(chǎng)中，由此將所說(shuō)的異源DNA導(dǎo)入至少一部分所說(shuō)的群體，并回收所說(shuō)的DNA已導(dǎo)入基中的細(xì)胞。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中每毫克異源DNA回收103-105個(gè)細(xì)胞。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中每毫克異源DNA回收0.9×104-1.1×104個(gè)細(xì)胞。
17．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，該方法進(jìn)一步包括從所說(shuō)的回收的細(xì)胞回收整合轉(zhuǎn)化體的步驟。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的回收步驟包括在以山梨糖醇為碳源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞。
19．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞群體處于早期對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。
20．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說(shuō)的時(shí)間常數(shù)為10-30毫秒。
21．用權(quán)利要求1的方法轉(zhuǎn)化的甲醇畢赤酵母細(xì)胞。
22．用權(quán)利要求6的方法轉(zhuǎn)化的甲醇畢赤酵母細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酶母的方法,用于轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母的DNA分子。在DNA分子存在下,使甲醇畢赤酵母細(xì)胞暴露于場(chǎng)強(qiáng)為2.5～4.5kV/cm,脈沖持續(xù)時(shí)間為1—40毫秒的脈沖電場(chǎng)中,由此將DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。DNA分子可包含一個(gè)表達(dá)單位,其包括與編碼感興趣的多肽或蛋白質(zhì)的節(jié)段可操作地連接的甲醇畢赤酵母基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。DNA分子也可以編碼一個(gè)選擇性標(biāo)記,如甲醇畢赤酵母ADE2基因。按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以用于制備具有商業(yè)重要性的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)中。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1230997SQ97197501
公開(kāi)日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1997年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月17日
發(fā)明者C·K·雷蒙德, S·D·霍德曼, E·瓦納加 申請(qǐng)人:津莫吉尼蒂克斯公司