專利名稱：真菌食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌。
由一種單倍體真菌鐮刀菌商業(yè)化生產(chǎn)人類食料。美國(guó)植物專利4,347中描述了一種特別適合的鐮刀菌A3/5菌株IMI 145425。
為了生產(chǎn)有吸引人口感的人類食料，最理想的是該鐮刀菌表現(xiàn)出幾乎無(wú)菌絲分支，而鐮刀菌IMI 145425的情況是這樣。然而，鐮刀菌在延長(zhǎng)的連續(xù)發(fā)酵過程中總是變得分支更多，這是由于在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)變種的出現(xiàn)。高分支變種的出現(xiàn)似乎是延長(zhǎng)的真菌發(fā)酵的一個(gè)普通特征。(Trinci，A.P.J等，(1990)Microbial Growth Dynamics，第17-38頁(yè)，IRL出版社，Oxford，英國(guó))因此，最理想的是生產(chǎn)形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性更好的鐮刀菌菌株。
常有報(bào)道在真菌菌株育種程序中，準(zhǔn)性世代作為工業(yè)上改良重要生產(chǎn)菌株的一種有價(jià)值的方法，因?yàn)樗ㄟ^重組、異核現(xiàn)象或二倍性，可使兩個(gè)個(gè)體的有利特征結(jié)合在一起。例如，已證明二倍性增加檸檬酸(Das & Roy，1978)、青霉素(Elander et al.，1973)及頭孢菌素C(TakedaChemical co.，1997)的生產(chǎn)率。性質(zhì)改良的報(bào)道包括產(chǎn)黃青霉中孢子形成能力的恢復(fù)(Calam等，1976)、在黑曲霉中提高過濾特性(Ball等，1978)、在C.acremonium中通常能增加活力(Hamlyn & Ball，1979)、在M.inyoensis中減少氧需求(Crueger，1982)以及在產(chǎn)黃青霉中消除羥基青霉素V的產(chǎn)生(Chang等，1982)。相比之下，雖然已經(jīng)描述了尖鐮刀菌的假定二倍體(Buxton，1956)，但在鐮刀菌中似乎沒有清楚地證明準(zhǔn)性生殖(Booth，1984)。證明禾本科鐮刀菌NRRL 319二倍體的嘗試(Bu′Lock等，1986)沒有成功，但報(bào)道了異核細(xì)胞。
根據(jù)Rowland(1984)的報(bào)道，在發(fā)酵期間二倍體是不穩(wěn)定的，并且很易斷裂，同時(shí)生產(chǎn)能力逐漸喪失，除非施加某種選擇壓力。在釀酒酵母中，有證據(jù)顯示在演變中的二倍體中其適應(yīng)性突變發(fā)生的頻率比單倍體群體高(x1.6)(Paquin和Adams，1983)。這支持了真菌的二倍體群體不穩(wěn)定的觀點(diǎn)。然而，我們發(fā)現(xiàn)某些半知菌類較高倍性的菌株在與單倍體親本相應(yīng)的典型生長(zhǎng)條件下，表現(xiàn)出(形態(tài)學(xué))穩(wěn)定性增加。
我們已經(jīng)生產(chǎn)了較高倍性的鐮刀菌菌株，并且已設(shè)計(jì)出可以憑此產(chǎn)生其它半知菌類、特別是鐮刀菌的較高倍性菌株的方法。這些菌株比單倍體菌株形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性更好。這可能至少部分是由于導(dǎo)致形成較高分支的突變基因是隱性的，并且在這種情況下，在通過遺傳特征無(wú)性繁殖傳遞前，較高倍性菌株中兩個(gè)重復(fù)基因必須相應(yīng)地突變，從而減低它對(duì)突變的敏感性。半知菌類區(qū)別于其它真菌在于，它們不是正常地通過有性階段。因此，可以預(yù)言，倘若較高倍性的菌株在培養(yǎng)條件使得可以忽略單倍體形式的回復(fù)或部分回復(fù)，較高倍性菌株在遺傳特征上一般將比單倍體菌株表現(xiàn)出更大的穩(wěn)定性。
“較高倍性”是指比單倍體包括無(wú)倍體高的倍性。
本發(fā)明包括一種人類食品，它包括半知菌類一個(gè)成員的較高倍性菌株，這些菌類的每個(gè)親本的生長(zhǎng)能力都有遺傳限制，這種生長(zhǎng)能力是另一親本所不享有的。本發(fā)明還包括一個(gè)較高倍性的鐮刀菌菌株。最好一個(gè)親本為選自組氨酸，精氨酸，亮氨酸和腺嘌呤的兩種化合物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，而另一個(gè)親本為其它兩種所述化合物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。適合的菌株由Marlow食品有限公司(Marlow Foods Limited)，StationRoad，Stokesley，Middlesbrough TS9 7AB以IMI 369190、369191和369192于1995年11月6日保藏于國(guó)際真菌研究所，Bakeham Lane，Egham，Surrey TW20 9TY。
從半知菌類得到的人類食料的核酸含量最好較低，最好是低于2％(重量)。
本發(fā)明包括一個(gè)死的較高倍性的半知菌菌株，其核酸含量不到2％(重量)。通過用至少60℃溫度的水處理，該真菌可能被殺死，并且同時(shí)其核酸含量減少到不到2％，該水可能是它本身的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
遺傳限制可能是每個(gè)親本都是一種不同代謝產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷的，或每個(gè)親本產(chǎn)生一個(gè)生長(zhǎng)所必需的基因產(chǎn)物，該產(chǎn)物比另一親本相應(yīng)的基因產(chǎn)物具有更大的溫度或PH敏感性。通過使較高倍體菌株在一種合適的環(huán)境下(在上述情況中，該環(huán)境缺乏營(yíng)養(yǎng)缺陷型親本缺少的營(yíng)養(yǎng)物，或該環(huán)境的溫度或pH是任一親本不供給另一親本的基因產(chǎn)物時(shí)都不能生長(zhǎng)的，人們可以篩選出抗向單倍體菌株恢復(fù)的菌株，因此可維持真菌較高的形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性。
本發(fā)明也包括包含半知菌的一個(gè)較高倍性菌株的人類食物，其中這些真菌已經(jīng)過處理，以去除了核酸和/或改變它的質(zhì)地、味道和口感。
可以如下生產(chǎn)較高倍性的菌株，培養(yǎng)相應(yīng)的單倍體菌株并進(jìn)行誘變，例如用紫外線照射直至產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株失去了產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物的能力。將該培養(yǎng)物例如平板接種到瓊脂平板上，添加可使?fàn)I養(yǎng)缺陷型和未突變生物均能生長(zhǎng)的完全培養(yǎng)基。通過復(fù)制平板接種到基本培養(yǎng)基上，鑒定未突變菌株，而從完全培養(yǎng)基平板上選出營(yíng)養(yǎng)缺陷型來(lái)并鑒定其營(yíng)養(yǎng)需求。然后可以選擇例如需要不同的氨基酸作為營(yíng)養(yǎng)物的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型用來(lái)按下述產(chǎn)生較高倍性的菌株，或單獨(dú)培養(yǎng)它們并重復(fù)該方法(只是這時(shí)該基本營(yíng)養(yǎng)物將包含每種營(yíng)養(yǎng)缺陷型需要的適當(dāng)氨基酸)。通過這種方法，可得到兩個(gè)雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型，最好是它們每一個(gè)需要兩種氨基酸，而彼此需要的互不相同。如果可以通過相應(yīng)的方法制備所需的三營(yíng)養(yǎng)缺陷型或更高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，那么它們最好應(yīng)是應(yīng)當(dāng)是沒有普通成員的一組代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
本發(fā)明包括制備半知真菌一員(例如鐮刀菌)的較高倍性菌株的方法，該方法包括在含有兩種需要不同營(yíng)養(yǎng)缺陷營(yíng)養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)均需要的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型(接合培養(yǎng)階段)，然后培養(yǎng)從缺少營(yíng)養(yǎng)缺陷組分的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)中的這種培養(yǎng)物得到的有機(jī)體(基本培養(yǎng)基培養(yǎng)階段)，并從該基本培養(yǎng)基培養(yǎng)階段回收一個(gè)較高倍性菌株。
在該接合培養(yǎng)階段，誘導(dǎo)孢子形成是必需的。這可通過已知方法實(shí)施，適當(dāng)?shù)赝ㄟ^使有機(jī)體經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)挑戰(zhàn)，例如僅供應(yīng)一種復(fù)合碳源作為主要營(yíng)養(yǎng)。
我們已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到如缺少營(yíng)養(yǎng)缺陷組分的基本培養(yǎng)基中時(shí)，從兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型獲得的較高倍性菌株相對(duì)于單倍體菌株和那些得自相一營(yíng)養(yǎng)缺陷型的較高倍性菌株進(jìn)行倍增，通過使有機(jī)體經(jīng)受誘變劑作用，可能增加這種作用，該誘變劑為適當(dāng)?shù)妮椛?，如紫外光，其?qiáng)度足夠量殺死存在的高比例的單倍體菌株。
然后最好例如通過平板培養(yǎng)，用較強(qiáng)的抗誘變性，例如通過紫外光作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，選擇較高倍性菌株。如有必要，選擇的有機(jī)體可以再在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，希望時(shí)在誘變下如用紫外光進(jìn)行，再篩選存活的較高倍性菌株。
從按以上方法產(chǎn)生的較高倍性菌株，進(jìn)一步篩選其它特征，如生長(zhǎng)率。實(shí)施例1.1親本單倍體鐮刀菌菌株A3/5(CMI 145425，ATCC 20334)是該單倍體的野生型。用常規(guī)突變技術(shù)，從已經(jīng)經(jīng)受紫外射線照射的A3/5孢子的懸浮液中回收菌株UMDA4-C和UMDA6-N。二者均為雙自養(yǎng)菌。UMDA4-C的營(yíng)養(yǎng)需要為組氨酸和精氨酸，而比A3/5更抗氯酸鹽。UMDA6-N需要亮氨酸和腺嘌呤，并且比A3/5更抗氮芥。1.2培養(yǎng)物保存和種子培養(yǎng)物的制備有機(jī)體以菌絲片段保存在50％(v/v)甘油中并貯存在保持在-196℃的小瓶(2ml)中。通過從這些小瓶中的一個(gè)將幾個(gè)等份轉(zhuǎn)移至含有50ml或200ml的RHM生長(zhǎng)培養(yǎng)基(見下文)的1升Ehrlenmeyer燒瓶中，制備種子培養(yǎng)物。通過于28℃培養(yǎng)多至72小時(shí)，發(fā)展培養(yǎng)物。1.3生長(zhǎng)培養(yǎng)基1.3.1 RHM培養(yǎng)基每升的量d-葡萄糖，10g；K2SO4，0.3g；NH4Cl，4.4g；MgSO4·7H2O，0.25g；KH2PO4，20.0g；微量元素溶液A，5.0ml；生物素，30μg。
A1升微量元素溶液含有CaCl2·2H2O，2.0g；FeCl3·6H2O，2.0g；檸檬酸，1.5g；ZnCl2，1.0g；MnCl2·4H2O，1.0g；CuCl2·2H2O，0.2g；CoCl2·2H2O，0.2g；NaMoO4·2H2O，0.2g。
將基本鹽類(除了葡萄糖和生物素)混合，并用20％(v/v)的NaOH將pH調(diào)至6.0。然后將產(chǎn)生的溶液按需要分裝到燒瓶中。葡萄糖單獨(dú)制備為含500gl-1d-葡萄糖的貯液。這兩種液體均于121℃高壓滅菌滅菌20分鐘。冷卻后，每個(gè)燒瓶中按需要補(bǔ)充葡萄糖。也由單獨(dú)過濾除菌的含30mgl-1生物素的貯液加入生物素。
1.3.2 YPG培養(yǎng)基每升的量酵母抽提物，3g；真菌蛋白胨，5g；D-葡萄糖，10g。將該酵母抽提物和蛋白胨混合，形成基本溶液，將該溶液于121℃高壓滅菌20分鐘。然后從依1.3.1節(jié)所述方法制備的含500g l-1D-葡萄糖的單獨(dú)的貯液加入葡萄糖。
1.3.3 CMC培養(yǎng)基每升含有羧甲基纖維素(CMC)，15g；NH4NO3，1.0g；KH2PO4，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g。溶解這些組分，于121℃高壓滅菌20分鐘之前，用20％的NaOH將pH調(diào)至6.0。
1.3.4發(fā)酵罐培養(yǎng)基這由三種單獨(dú)的貯液制成，每種制備為10升體積，并于121℃高壓滅菌30分鐘。a)基本鹽濃縮液每10l中的了量K2SO4，40g；MgSO4·7H2O，18g；(CH3COO)2Ca，4g；H3PO4(85％v/v)，23ml；微量元素溶液，10ml；每升微量元素溶液含有MnSO4·2H2O，40g；ZnSO4·7H2O，50g；CuSO4·5H2O，5g；生物素，50mg；cH2SO4，5ml。b)葡萄糖用水溶解730g葡萄糖一水合物，使其總體積為10l，制備含66gl-1D-葡萄糖的貯液。c)鐵每10升的量FeSO4·7H2O，5g；cH2SO4，5ml。
高壓滅菌后，將含基本鹽濃縮液的容器和含葡萄糖的容器連接在一起，將內(nèi)容物混合，形成營(yíng)養(yǎng)物主流。單獨(dú)供應(yīng)含大約100mg l-1Fe2+的鐵溶液。
1.3.5補(bǔ)充培養(yǎng)基按需要，將精氨酸、組氨酸、亮氨酸和腺嘌呤加入基本培養(yǎng)基中，其濃度為500mg l-1。
1.3.6固體培養(yǎng)基需要固體培養(yǎng)基時(shí)，在高壓滅菌前加入15g l-1瓊脂。滅菌后讓熔化的瓊脂冷卻至55℃，然后將其璇渦混勻后，將大約20ml的等份分裝到9cm的陪替氏培養(yǎng)皿中。1.4異核體的形成和分離按1.2節(jié)中描述的，用適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充了精氨酸和組氨酸或腺嘌呤和亮氨酸的RHM培養(yǎng)基(50ml)，制備雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型的液體培養(yǎng)物。然后通過在加入精氨酸、組氨酸、腺嘌呤和亮氨酸的CMC培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩個(gè)菌株，誘導(dǎo)孢子形成，并且將燒瓶在28℃再培養(yǎng)24小時(shí)。得到的大型分生孢子的懸浮液以1∶1的比例混合，并且將40微升等份轉(zhuǎn)移到10×96孔無(wú)菌微量檢測(cè)板的各個(gè)孔中，每孔中已加入了160μl無(wú)菌的YPG培養(yǎng)基?；旌虾?，將這些板在28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)。在某些情況下，這包括暴露于樟腦或紫外照射的一個(gè)時(shí)期
樟腦將板放在一個(gè)密閉容器中，容器底部灑有幾個(gè)d-樟腦晶體，將微孔板在樟腦氛圍中于28℃保溫4小時(shí)。處理后，將板取出并在空氣中于28℃再培養(yǎng)44小時(shí)。
紫外線將這些板于28℃上常規(guī)保溫48小時(shí)，然后將其取出，暴露于20μW.cm-2的紫外線下210秒。暴露后，將板放回28℃，并再培養(yǎng)24小時(shí)。
在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，從每個(gè)孔中取出等份試樣(10微升)，在第二組微量測(cè)試板中與190μl RHM培養(yǎng)基混合。然后將其在28℃培養(yǎng)7天，以突出原養(yǎng)型生長(zhǎng)。1.5假定的多倍體的篩選和分離將孔中事先填裝190μl RHM培養(yǎng)基的新微量測(cè)試板與已表現(xiàn)出原養(yǎng)型生長(zhǎng)證據(jù)的培養(yǎng)物的10μl等份試樣一同培養(yǎng)。然后將板于28℃培養(yǎng)5天，該循環(huán)重復(fù)兩次，以突出能在基本培養(yǎng)基中持續(xù)生長(zhǎng)的菌株。然后將100μl篩選出的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含5ml RHM培養(yǎng)基的通用瓶中，擴(kuò)大體積。將這些瓶于28℃攪拌培養(yǎng)多至4天。
將從以上篩選方法回收的菌株在液體中進(jìn)行再次傳代培養(yǎng)，將2ml通用瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含50ml RHM和50ml CMC生長(zhǎng)培養(yǎng)基的燒瓶中。兩個(gè)燒瓶均于28℃攪拌培養(yǎng)4天，然后收獲內(nèi)容物并用于制備長(zhǎng)期貯存的貯存培養(yǎng)物。1.6用對(duì)紫外線照射的劑量反應(yīng)分析菌株所需菌株的種子培養(yǎng)物在50ml RHM培養(yǎng)基的燒瓶中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中按雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型的需要加入添加物。每個(gè)燒瓶于28℃攪拌培養(yǎng)多至48小時(shí)，然后將10ml轉(zhuǎn)入第二個(gè)含50ml CMC培養(yǎng)基的燒瓶中傳代培養(yǎng)。在相同條件下培養(yǎng)16-20小時(shí)以促進(jìn)孢子形成。然后通過兩層無(wú)菌晶狀體組織過濾至一個(gè)無(wú)菌容器中去除營(yíng)養(yǎng)菌絲體后，將20ml孢子懸浮液轉(zhuǎn)入一個(gè)9cm陪替氏培養(yǎng)皿中。用磁力攪拌器不斷地?cái)嚢柙搼腋∫骸?br> 用一個(gè)功率額定為高處的能量率為20uW.cm-2的燈，將每個(gè)板用紫外光照射多至10分鐘。在Ringers溶液中連續(xù)稀釋0.5ml樣品，并將每個(gè)稀釋液的0.2ml體積涂布于含瓊脂固化的RHM培養(yǎng)基(補(bǔ)充特定的成分)的平板上，測(cè)定整個(gè)暴露期間的存活率。這些平板在28℃培養(yǎng)，48小時(shí)出現(xiàn)的菌落數(shù)用于構(gòu)成平均存活數(shù)的時(shí)間系列圖。從這些圖中可以定量測(cè)定每個(gè)菌株同使其致死水平相關(guān)的暴露時(shí)間。1.7連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)培養(yǎng)物在Braun(B.Braun Biotech，Aylesbury，Bucks)Biostat ER3發(fā)酵罐中生長(zhǎng)，工作體積為2.8升。強(qiáng)制設(shè)置點(diǎn)是溫度28℃；pH6.0(通過自動(dòng)滴定7M NH4OH來(lái)維持)；攪拌1000rpm；空氣流速2.211min-1。通過以0.1-0.2ml h-1定時(shí)加入聚丙二醇消泡油抑制泡沫形成。
向發(fā)酵罐容器中加入基本鹽+葡萄糖溶液，然后在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中補(bǔ)充硫酸鐵，使Fe2+終濃度為1mg l-1。確立控制設(shè)置點(diǎn)并導(dǎo)入種子培養(yǎng)物。通過借用質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析出口氣組成來(lái)監(jiān)控生長(zhǎng)，出口氣組成用來(lái)測(cè)定二氧化碳放出速率(CER)。當(dāng)CER達(dá)到35毫摩爾升-1小時(shí)-1時(shí)，通過打開傳送消泡劑、鐵和基本鹽+葡萄糖的泵來(lái)建立連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)。以等于流入的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中0.8-1.0mg 1-1Fe2+濃度的固定速率加入鐵。
作為中心控制可變性的一個(gè)加入CER的反饋環(huán)用于在連續(xù)流動(dòng)起見調(diào)節(jié)基本鹽+葡萄糖流的流速。從質(zhì)譜計(jì)接收的信號(hào)通過軟件處理，將該軟件編程，以產(chǎn)生響應(yīng)高于或低于CER設(shè)置點(diǎn)變化的兩個(gè)輸出電壓中的一個(gè)。該輸出電壓控制一個(gè)傳送基本鹽+葡萄糖流的蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速，由于該流單獨(dú)占通入發(fā)酵罐總液體流的95％以上，因而該輸出電壓控制該稀釋率。實(shí)際上，兩個(gè)輸出電壓對(duì)應(yīng)于在0.15h-1和0.25h-1間的稀釋率。設(shè)計(jì)這些輸出電壓分別進(jìn)一步濃縮或者稀釋該生物量。在該軟件監(jiān)控下進(jìn)行這兩個(gè)界限之間的受調(diào)轉(zhuǎn)換，并且將平衡維持在對(duì)應(yīng)于有機(jī)體的最大生長(zhǎng)速率的值上。當(dāng)在最大允許稀釋率下操作時(shí)，該操作方法可使在培養(yǎng)發(fā)酵液中維持葡萄糖的過量水平。菌落形態(tài)學(xué)的監(jiān)測(cè)每日從發(fā)酵罐中取新鮮培養(yǎng)物的樣品，并在無(wú)菌Ringers溶液中連續(xù)地稀釋。將適當(dāng)稀釋度的等份試樣(0.1ml)涂于含固化RHM培養(yǎng)基的10個(gè)瓊脂平板的表面。這些平板于28℃培養(yǎng)多至72小時(shí)，按(Wiebe等，1991)描述的方法測(cè)定菌落變異體的比例。2結(jié)果2.1原養(yǎng)型微生物的選擇性回收共進(jìn)行34,650個(gè)個(gè)體交配；11,520個(gè)無(wú)特殊處理；11,520個(gè)暴露于樟腦以及11,520個(gè)用紫外光照射。表1給出了用每種方法在RHM基本培養(yǎng)基中經(jīng)3次(倒數(shù)第二次)和四次(最終)選擇性傳代培養(yǎng)后得到的原養(yǎng)微生物的數(shù)目。表1用該微量測(cè)試方法的三種變化方法的原養(yǎng)微生物的選擇性回收
從常規(guī)雜交，即從那些沒有暴露于樟腦或紫外光的培養(yǎng)物中沒有回收到原養(yǎng)微生物，表明原養(yǎng)型生長(zhǎng)的自然收率不到8.7×10-5。很清楚，用樟腦處理是最成功的方法，產(chǎn)生總共12個(gè)菌株，并且將收率提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，即1.0×10-3。這些菌株指定為菌株編碼D2和D11-D21。
包括紫外照射的篩選只產(chǎn)生了一個(gè)目的培養(yǎng)物(編碼為11-1/M1)，它最初含兩個(gè)具有不同菌落形態(tài)的變異體。因?yàn)樗鼈冊(cè)谥睆缴舷鄬?duì)的不同，隨后被稱為“大的”或“小的”。兩個(gè)類型中較大的也比較小的更有活力，它外觀上的菌絲密度比較小的大。劑量反應(yīng)試驗(yàn)(1.6)顯示大型培養(yǎng)物更抗紫外照射，提示它本質(zhì)上突變頻率較低。在此基礎(chǔ)上，決定主要集中于該型培養(yǎng)物，而忽視較小型培養(yǎng)物。回收在劑量反應(yīng)試驗(yàn)中制備的生長(zhǎng)于稀釋平板上的總共9個(gè)大菌落作為亞克隆，并定為菌株編碼指D1和D3-D10。
這些培養(yǎng)物和用樟腦處理的12個(gè)培養(yǎng)物的譜系總結(jié)于

圖1。2.2用對(duì)紫外照射有劑量反應(yīng)分析菌株對(duì)應(yīng)于存活計(jì)數(shù)減少90％、99％和99.9％的暴露(或殺死)時(shí)間用來(lái)定量測(cè)定每個(gè)菌株的劑量反應(yīng)(表2)。表2-禾赤鐮刀菌親本單倍體和假定多倍體的孢子懸浮液中使90、99和9.9％死亡的紫外暴露時(shí)間的比較
所有時(shí)間以分鐘計(jì)*通過外推法得到的有機(jī)體D1、D2和D21已根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于1995年10月19日保藏在國(guó)際真菌研究所(Bakeham Lane，Egham，Surrey TW20 9TY，英國(guó))，保藏號(hào)為IMI 369192、IMI 369191和IMI 369190。
對(duì)于A3/5，各自的死亡時(shí)間為4.4、5.7和7.4分鐘。在雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型的情況下，顯然需要更長(zhǎng)的暴露期，以建立比較數(shù)據(jù)的完全補(bǔ)充，因?yàn)榇?9.9％死亡的值(而UMDA4-C為99％)在10分鐘的暴露期內(nèi)沒有下降。
通常，對(duì)來(lái)自紫外交配的假定的更高倍體而言，代表90和99％死亡的值與那些記錄的親本單倍體的值的數(shù)量級(jí)相同。雖然有證據(jù)顯示其中兩個(gè)菌株(D1和D5)不同于其它菌株，但該組的大多數(shù)獲得反映90％死亡時(shí)間在A3/5獲得時(shí)間的0.5分鐘內(nèi)，亦即3.9-4.9分鐘。D1的值高于該組中其它分離物的值，而D5的值則持續(xù)地較低。這些描繪表明，D1類似于雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型，亦即比A3/5抗性更高，而D5的抗性在一定程度上低于A3/5。
相反，從樟腦交配回收的半數(shù)分離物需要的暴露時(shí)間超過10分鐘，以迫使99％死亡。大部分聚集在4.9-6.8分鐘的范圍內(nèi)，雖然有四個(gè)顯著的例外。菌株D14、D19和D21似乎更易受影響，而D20不僅在樟腦組中而且在該程序過程中分離的所有原養(yǎng)微生物中都明顯地具有最強(qiáng)的抗性。2.4在D1和D2的連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)中菌落變異體的出現(xiàn)一般在A3/5的107+/-14代，亦即448+/-60小時(shí)后，檢出具有局限性菌落表型的變異體。然而，在用D1和D2進(jìn)行的發(fā)酵中，直到540和594代(1,957和2,028小時(shí))才檢出具有局限性菌落表型的變異體(表3)。因此在QUORN工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)運(yùn)行期間，增加的穩(wěn)定性接近提高至少四倍。表3在鐮刀菌A3/5、D1和D2連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)中局限性菌落突變體的第一次出現(xiàn)<
表4真菌中準(zhǔn)性世代的發(fā)生
參考文獻(xiàn)BALL，C.，LAWRENCE，A.J.，BUTLER，J.M.和MORRISON，K.B.(1978).European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 5，95-102.
BARRON，G.L.(1962).儲(chǔ)藏腐爛真菌擴(kuò)展青霉中的準(zhǔn)性世代和連鎖關(guān)系。Canadian Journal of Botany 40，1603-1613.
BOOTH，C.(1984).鐮刀菌問題歷史、經(jīng)濟(jì)和分類方面。TheApplied Mycology of Fusarium(ed.M.O.Moss和J.E.Smith)，第1-14頁(yè)。倫敦British Mycological Society.
BU′LOCK，J.D.，MOONEY，J.P.&amp; WRIGHT，C.E.(1986)由禾赤鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素的調(diào)節(jié)兩個(gè)突變型之間的互補(bǔ)作用。Biotechnology Letters 8(5)，323-326.
BUXTON，E.W.(1956).尖鐮刀菌的致病菌株中的異核現(xiàn)象和準(zhǔn)性重組。Jounrnal of General Microbiology 15，133-139.
CALAM，C.T.，DAGLISH，L.B.和McCANN，E.P.(1976).Proceedings of the Second Interational Sym posium on the Genetics ofIndustrial Microorganism s.(K.D.MacDonald編輯)第273-287頁(yè).倫敦Academic Press.
CASSELTON，L.A.(1965).Corprinus lagopus的二倍體的產(chǎn)生和行為.Genetical Research 6，190-208CATEN，C.E.(1981).真菌中的準(zhǔn)性錯(cuò)過程.The Fungal Nucleus(K.Gull和S.T.Oliver編輯)第191-214頁(yè).CambridgeCambridgeUniversity Press.
CHANG，L.T.，TERESAKA，D.T.和ELANDER，R.P.(1982).Developm ents in Industrial Microbiology 23，21-29.
CRUEGER，a.(1982).Fourth International Symposium on theGenetics of Industrial Microorganisn s.Abstract 0-V1-1.
DAS，A.和ROY，P.(1978).用黑曲霉的二倍體菌株提高的檸檬酸生產(chǎn).Canadian Journal of Microbiology 24，622-625.
ELANDER，R.P.，ESPENSHADE，M.A.，PATHAK，S.G.和PAN，C.H.(1973).Proceedings of the First International Symposium on theGenetics of Industrial Microrganism s(Z.Vanek，Z.Holstalek和J.Cudlin編輯)第239-253頁(yè).AmsterdamElsevier Publishing Co.
HAMLYN，P.F.和BALL，C.Proceedings of the Third InternationalSym posium on the Genetics of Industrial Microrganism s(O.K.Sebek和A.I.Laskin編輯)第185-191頁(yè).Washington DCAmerican Society forMicrobiology.
HASTLE，A.C.(1962).hopwilt真菌黃萎輪枝孢的遺傳重組.Journal of General Microbiology 27，373-382.
HASTIE，A.C.(1970).無(wú)性致植物病真菌特別是輪枝孢的遺傳學(xué).Root Diseases and Soil-borne Pathogens(T.A.Tousson，R.V.Bega和P.E.Nelson編輯)第55-62頁(yè).BerkeleyUniversity of California PressHOLLIDAY，R.(1961).在玉蜀黍黑粉菌中誘導(dǎo)的有絲分裂交換.Genetical Research 2.231-248.
ISHITANI，C.，IKEDA，Y.和SAKAGUCHI，K.(1956).曲酶(米曲霉和醬油曲霉)的遺傳變異和遺傳重組.VI.雜合二倍體的遺傳重組.Journal of General and Applied Microbiology(Tokyo)2，401-430.
JACKSON，C.W.和HEALE，J.B.(1983).在蠟蚧輪枝孢準(zhǔn)性遺傳中克服植物不親和性的原生質(zhì)體融合.Protoplasts 1983.PosterProceedings，6th international Protoplast symposium，Basel，1983年8月12-16日，第318-319頁(yè).BaselBirkhauser Verlag.
JOHNSON，J.R.(1975).絲狀真菌的菌株改良和菌株穩(wěn)定性.TheFilam entous Fungi第1卷.(J.E.Smith和D.R.Berry編輯)第59-78頁(yè).倫敦Edward Arnold.
NUESCH，J.，TREICHLER，H.J.和LIERSCH，M.(1973).頭孢菌素C的生物合成.Genetics of Industrial Microorganism s，Actinom ycetes andFungi(Z.Vanek，Z.Hostalek和J.Cudlin編輯)第309-334頁(yè).PragueAcademia.
PAQUIN，C.&amp; ADAMS，J.(1983)在進(jìn)化中二倍體中適應(yīng)性突變固定的頻率高于酵母單倍體群體.Nature 302，495-500.
PEBERDY，J.F.(1988).遺傳操作.Physiology of Industrial Fungi(J.F.Peberdy編輯)，第187-218頁(yè).OxfordBlackwell ScientiicPublications.
PONTECORVO，G.，ROPER，J.A.和FORBES，E.(1953).在黑曲霉中沒有性生殖的遺傳重組.Journal of General Microbiology 8，198-210.
PONTECORVO，G.和SERMONTI，G.(1954).產(chǎn)黃青霉中沒有性生殖的遺傳重組.Nature 172，126-127.
REHM，H.J.和REED，G.(1981).工業(yè)微生物的遺傳系統(tǒng).Biotechnology，第1卷Microbial Fundamentals(H.F.Ebel和C.Schultz編輯)第246-151頁(yè).BaselVerlag Chemie.
ROPER，J.A.(1952).絲狀真菌中雜合二倍體的產(chǎn)生.Experientia8(1)，14-15.
ROPER，J/A.(1966).準(zhǔn)性世代.The Fungi，第II卷，The FungalOrganism(G.C.Ainsworth和A.S.Sussman編輯)第589-617頁(yè).紐約Academic Press.
ROWLANDS，R.T.(1984).工業(yè)菌株改良合理的篩選和遺傳重組技術(shù).Enzyme &amp; Microbial Technology 6，290-300.
STERN，C.(1936).黃猩猩果蠅體細(xì)胞交換和分離.Genetics 21，625-630.
TAKEDA CHEMICAL COMPANY(1977).[頭孢菌素C的生產(chǎn)].英國(guó)專利號(hào)1 488 822.
WIEBE，M.G.，TRINCI，A.P.J.，CUNLIFFE，B，ROBSON，G.D和OLIVER，S.G.，(1991)在葡萄糖限制的禾赤鐮刀菌A3/5的連續(xù)流動(dòng)培養(yǎng)中形態(tài)學(xué)(菌落)突變體的出現(xiàn).Mycological Research 95，1284-1288.WILLIAMS，M.A.J.和KIRK，P.M.(1988).工業(yè)真菌的特征.Physiology of Industrial Fungi(J.F.Peberdy編輯)，第1-17頁(yè).牛津Blackwell Scientific Publications.
權(quán)利要求
1.包含半知菌類一員的一個(gè)較高倍性菌株的人類食料，其每個(gè)親本對(duì)其生長(zhǎng)能力具有一不與另一親本共有的遺傳限制。
2.可食用的鐮刀菌的較高倍性菌株，其每個(gè)親本菌株是一種不同代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的菌株，其一個(gè)親本是選自組氨酸、精氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的兩個(gè)氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，而另一親本是另外兩個(gè)所述化合物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。
4.鐮刀菌菌株IMI 369190、IMI 369191和IMI 369192以及它們的變異體突變體和高倍性衍生物。
5.半知菌類的一個(gè)較高倍性菌株，它是死的并且其核酸含量低于2％(重量)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的菌株，其每個(gè)親本對(duì)其生長(zhǎng)能力都有一個(gè)不與另一親本共有的遺傳限制。
7.如權(quán)利要求1、2、3或4中要求保護(hù)的菌株或食品，其中該菌株是死的并且其核酸含量低于2％(重量)。
8.制備權(quán)利要求5、6或7中要求保護(hù)的半知菌類菌株的方法，其中包括通過用溫度至少為60℃的水處理，殺死半知菌類的較高倍性的菌株，同時(shí)使其核酸含量減少至2％(重量)以下。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中該真菌是鐮刀菌A3/5。
10.制備可食用的鐮刀菌較高倍性菌株的方法，該方法包括將需要不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷的營(yíng)養(yǎng)物的兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型在含有允許二者均生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中一同培養(yǎng)(接合培養(yǎng)階段)，然后將得自這種培養(yǎng)物的有機(jī)體在缺乏營(yíng)養(yǎng)缺陷的組分的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)中培養(yǎng)(基本培養(yǎng)基培養(yǎng)階段)，并從基本培養(yǎng)基培養(yǎng)階段回收較高倍性菌株。
11.權(quán)利要求10中要求保護(hù)的方法，其中這些營(yíng)養(yǎng)缺陷型都是通過突變和選擇制備的。
12.權(quán)利要求11中要求保護(hù)的方法，其中這兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型都得自同一菌株。
13.權(quán)利要求10-12的任何權(quán)利要求中要求保護(hù)的方法，其中這些營(yíng)養(yǎng)缺陷型需要不同的氨基化合物作為營(yíng)養(yǎng)物。
14.權(quán)利要求13中要求保護(hù)的方法，其中每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型都需要兩種氨基化合物作為營(yíng)養(yǎng)物，這兩種化合物中的任一種都與另一營(yíng)養(yǎng)缺陷型需要的不同。
15.權(quán)利要求9-14的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的方法，其中該接合培養(yǎng)階段產(chǎn)生的真菌經(jīng)受的嚴(yán)格誘變，足以殺死相當(dāng)大比例存在的任何單倍體真菌，而允許至少一些較高倍性的真菌存活，由此較高倍性的真菌比單倍體真菌經(jīng)過誘變存活的比例更大。
16.權(quán)利要求9-15中要求保護(hù)的方法，其中真菌在基本培養(yǎng)基培養(yǎng)階段或由其回收后經(jīng)受誘變，誘變的嚴(yán)格性足以殺死相當(dāng)大比例存在的任何單倍體真菌，而允許至少一些較高倍性的真菌存活，由此較高倍性的真菌比單倍體真菌經(jīng)過誘變存活的比例更大。
17.權(quán)利要求15或16中要求保護(hù)的方法，其中通過照射進(jìn)行該誘變。
18.權(quán)利要求17中要求保護(hù)的方法，其中該照射是紫外照射。
19.生產(chǎn)人類食品的方法，該方法包括培養(yǎng)半知真菌類的較高倍性菌株，其中其每個(gè)親本對(duì)其生長(zhǎng)能力都有一個(gè)不與另一親本共有的遺傳限制，該方法在使得減少回復(fù)為單倍體型的回復(fù)突變或部分回復(fù)突變的條件下進(jìn)行。
20.包含半知真菌類較高倍性菌株的人類食品，其中該真菌已被處理，以去除核酸和/或改變其質(zhì)地、味道或口感。
全文摘要
一種人類食品包含一種半知菌類較高倍性的菌株,其每個(gè)親本都具有一個(gè)不與另一親本共有的遺傳生長(zhǎng)限制。一個(gè)親本例如是選自組氨酸、精氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的兩種化合物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型,而另一親本則是另兩種化合物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。該菌株的核酸含量最好不到2%(重量)。通過用水處理殺死半知菌類的較高倍性菌株并同時(shí)將其核酸含量降至2%(重量)以下,制備該菌株。該方法可以包括通過在含允許二者都生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型,然后在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)得自這種培養(yǎng)物的有機(jī)體,制備可食用的一種鐮刀菌的較高倍性菌株。本發(fā)明可通過在使得減少單倍體型回復(fù)突變或部分回復(fù)突變的條件下培養(yǎng)該菌株,應(yīng)用于人類食品的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23J3/20GK1209166SQ96199948
公開日1999年2月24日 申請(qǐng)日期1996年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月16日
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