專利名稱：一種制備天然白細胞介素-ii的方法
一種制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法。
本發(fā)明是關于一種制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法，更特別地，是從人胎血中提取白細胞介素-Ⅱ的方法。
白細胞介素-2(即IL-2)是80年代國際上開始研制的生物藥品。它是繼傳統(tǒng)治療腫瘤的三大療法(手術、化學、放射療法)之后的第四種療法即生物療法(BRN)的關鍵藥物。其本身大劑量即可有抗癌活性;用IL-2在人體外培養(yǎng)人的淋巴細胞，使淋巴細胞具有殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞，其殺傷腫瘤細胞能力大為增強的特性，并使淋巴細胞的數(shù)量得到大量、快速的增殖(此種經IL-2激活的淋巴細胞稱之為LAK細胞)。美國癌研究中心Rosenberg，SA用LAK細胞加IL-2治療晚期惡性腫瘤，獲得8例腫瘤完全消失的顯著效果，該作者又報道(Rosenberg，sa，Science2331318，1986)用IL-2在人體外培養(yǎng)從患者手術切除的腫瘤分離獲得的“腫瘤浸潤淋巴細胞”(稱TIL細胞)，開始由105個細胞經80天培養(yǎng)可增至1026個。TIL細胞較LAK細胞殺傷腫瘤的療效又提高50-100倍，此項成果震動了世界醫(yī)學界。但是目前所使用的IL-2是來自人體的淋巴細胞，人的扁桃腺、人的脾，這些都是從車禍等死者身上及時采取或從活人身上采取，再是僅采用IL-2(而不用ILI-7等)，提取工藝復雜，設備昂貴，藥物來源困難，所以價格極高。也有采用基因工程方法，將人的IL-2基困摻人大腸桿菌中，生產的IL-2稱之為重組IL-2(即rIL-2)，其價格也未降下來多少，用Rosenbery SA的劑量，一人一療程，需1000萬元人民幣，且含有大腸桿菌毒素無法完全消除，人體使用發(fā)高燒，有毒素反應。
本發(fā)明的目的在于提供一種療效高，使用安全，無付作用，價格低廉，來源廣泛的制備白細胞介素-Ⅱ的方法。
本發(fā)明的這些和其它目的將通過下列的具體描述來進一步地體現(xiàn)和說明。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，申請人采取了以人胎血作為原料來制備天然白細胞介素-Ⅱ，并且加入人血白蛋白作為穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法，包括以下步驟A、無菌采取胎盤血，加入肝素抗凝，用含6-10%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)稀釋2-3倍，用淋巴細胞分離液分離其淋巴細胞;
B、用含6-10%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)沖洗三次，(1600-2000rpa，5.5-6.9分鐘);
C、用含0.5-2%的PHA和6-10%人血白蛋白的RPNI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為(1.1-2)×109細胞個數(shù)/升;
D、將其加到細胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時;
E、收集上清液，加入6-10%的人血白蛋白作穩(wěn)定劑，分裝;
F、取分子量為3-5萬道爾頓的蛋白質部分置低溫冷凍干燥機中干粉化。
較好的是，本發(fā)明的方法采用如下步驟A、無菌采取胎盤血，加入肝素抗凝，用含7-9%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)稀釋2-3倍，用淋巴細胞分離液分離出其淋巴細胞;
B、用含7-9%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)沖洗三次，(1600-2000rpa，5.5-6.9分鐘);
C、用含1-1.5%的PHA和7-9%人血白蛋白的RPNI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為(1.1-2)×109細胞個數(shù)/升;
D、將其加到細胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時;
E、收集上清液，加入7-9%的人血白蛋白作穩(wěn)定劑，分裝;
F、取分子量為3-5萬道爾頓的蛋白質部分置低溫冷凍干燥機中干粉化。
本發(fā)明的方法具備藥源來源廣、療效高、使用安全，價格低廉等優(yōu)點，而且所制備的IL-2與人體為同種蛋白，因此無毒付作用，易于被人體接受，開創(chuàng)了一條提取IL-2的新途徑。
在本發(fā)明中，使用的所有原材料均可以從市場購得，例如人血白蛋白PBS可以從武漢生物制品研究所購得，PHA可以從廣州醫(yī)工所購得，RPNI1640培養(yǎng)液(美國Scirntific公司出品)。
在本發(fā)明中，除非特指，所有的百分比均為重量百分比，即每升多少克，以液體體積為基礎。
制備完成IL-2后，檢驗HBsAg，抗-HBC，梅毒、丙肝、愛滋病抗體，全部合格后方能使用。
以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例僅用于說明，并不能限止本發(fā)明范圍。
例1，按如下方法制備IL-2A、無菌采取胎盤血5ml，加入100u肝素抗凝，用含7%的PBS(PH＝7.2)稀釋3倍(按抗凝后血液體積計)，用淋巴細胞分離液分離出其淋巴細胞;
B、用含6%的PBS(PH＝7.2)沖洗三次(1700rpa，6分鐘);
C、用含1%的PHA和6%PBS的RPNI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為1.5×106細胞數(shù)/升;
D、放入細胞培養(yǎng)箱中，置5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時;
E、收集上清液，加入6.5%的人血白蛋白作穩(wěn)定劑，分裝;
F、測定，取分子量為4.6萬道爾頓的蛋白質部分置低溫冷凍干燥機中干粉化;
G、檢測，全部指標合格后即為成品;
例2A、無菌采取胎盤血5ml，加入100u肝素抗凝，用含6.5%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)稀釋2.5-3倍，用淋巴細胞分離液分離出其淋巴細胞;
B、用含6.5%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)沖洗三次，(1700rpa，6分鐘);
C、用含1%的PHA和6.5%人血白蛋白的RPNI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為2.0×106細胞個數(shù)/升;
D、將其加到細胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時;
E、收集上清液，加入7.0%的人血白蛋白作穩(wěn)定劑，分裝;
F、取分子量為4.6萬道爾頓的蛋白質部分置低溫冷凍干燥機中干粉化;
G、檢測，全部指標合格后即為成品。
用本發(fā)明的方法所制備的IL-2經臨床使用151例，對癌癥的總有效率為90%以上，且對人體無任何毒付作用，具有作為T細胞和自然殺傷細胞生長因子的功能，直接或間接地有助于消除癌或從免疫異常狀態(tài)恢復正常及改善免疫低下狀態(tài)。
權利要求
1.一種制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法，其特征在于使用人胎血作為原料。
2.如權利要求1的制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法，其特征在于包括以下步驟A、無菌采取胎盤血，加入肝素抗凝，用含6-10%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)稀釋2-3倍，用淋巴細胞分離液分離出其淋巴細胞;B、用含6-10%的人血白蛋白PBS(PH＝7.2)沖洗三次，(1600-2000rpa，5.5-6.9分鐘);C、用含0.5-2%的PHA和6-10%人血白蛋白的RPNI1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為(1.1-2)×109細胞個數(shù)/升;D、將其加到細胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時;E、收集上清液，加入6-10%的人血白蛋白作穩(wěn)定劑，分裝;F、取分子量為3-5萬道爾頓的蛋白質部分置低溫冷凍干燥機中干粉化。
3.如權利要求1、2的制備天然白細胞介素-Ⅱ的方法，其特征在于所制備的天然白細胞介素-Ⅱ可以作為一種新型抗瘤劑或對免疫缺陷的治療劑。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種制備天然白細胞介素-II的方法，包括以人胎血作為原料，加入人血白蛋白作穩(wěn)定劑以及冷凍干燥等步驟；本發(fā)明的方法具有藥源來源廣、療效高、使用安全、價格低廉等優(yōu)點，所制備的IL-2與人體為同種蛋白，因此無毒副作用，易于被人體接受，開創(chuàng)了一條提取IL-2的新途徑。
文檔編號C12P21/00GK1086265SQ9311711
公開日1994年5月4日 申請日期1993年9月6日 優(yōu)先權日1993年9月6日
發(fā)明者張召璉, 荊永正 申請人:張召璉, 荊永正