本發(fā)明屬于食品分離純化技術領域，具體涉及羊奶乳清的分步提取方法。

背景技術：

干酪的制作過程中會大量產生乳清，乳清含有豐富的蛋白和多種類的微量元素，隨著功能食品的開發(fā)利用，乳清的合理利用也越發(fā)受到關注，高質量的乳清粉已作為營養(yǎng)強化劑添加到食品行業(yè)中。在飼料工業(yè)，乳清粉也發(fā)揮著重要的角色，在羔羊犢牛代乳料、乳豬飼料等領域的應用已廣為人知。隨著乳清產品在市場上的活躍，乳清蛋白的得率和乳品過敏原αs1酪蛋白的去除是獲得高質量乳清的關鍵，乳清的提純工藝迫切需要改進。

乳清有多種提純方法，常見的方法主要有：乙醇分級沉淀法、等電點沉淀法、離心法、膜過濾法，CO₂沉淀分離法，此外還有超臨界CO₂萃取法、雙水相萃取法等。這些不同方法的提純過程雖然都比較單一，但都可以比較簡潔的分離乳清。

1.乙醇分級沉淀法

沉淀蛋白質所需要使用的乙醇濃度，與所要去除物質的分子量有關。在乙醇的百分數(shù)不斷增加的情況下，蛋白質逐漸沉淀：纖維蛋白原為8％，球蛋白為20％，白蛋白為40％。一般乙醇加入不能太快，要邊加邊搖，防止局部濃度過高，造成溶液的共沉或者局部變性。乙醇法沉淀蛋白易造成蛋白變性，變性蛋白無法重新溶解，沉淀蛋白的特異性不夠好，分級沉淀的效果不佳，筆者使用乙醇分級沉淀制取乳清蛋白，SDS-PAGE之后發(fā)現(xiàn)酪蛋白的量顯著降低的同時，乳清蛋白丟失嚴重。

2.等電點沉淀法

運用蛋白質中正、負電荷數(shù)目相同時，蛋白質為電中性，容易沉淀的特點。調整羊奶的pH同酪蛋白等電點相同，這時酪蛋白的溶解度最小，酪蛋白及其夾雜物就會從羊奶中沉淀出來，上清液中所含蛋白即為乳清蛋白。常用等電點沉淀法從羊奶中分離酪蛋白。該方法與制作干酪中得到乳清的原理一致，都運用了等電點沉淀的原理。該方法乳清蛋白損失較少，但是乳清蛋白中酪蛋白污染嚴重，造成這種結果的原因是：在pH 4.6～4.7環(huán)境下分離乳清時，β-酪蛋白(等電點為4.83～5.07)、κ-酪蛋白(等電點為5.3～5.8)等酪蛋白難以沉淀。

3.離心法

離心法被廣泛應用于生物樣品。如細胞器、蛋白質、病毒和核糖等的分離提純，是研究生物分子提純、分離的重要手段。離心法與電泳配合使用，能對蛋白質定量和定性分析，筆者發(fā)現(xiàn)離心法和等電點沉淀法都能獲得類似的乳清蛋白分離效果：乳清蛋白損失較少，酪蛋白顯著減少。但由于酪蛋白的量較多(羊乳蛋白的80％)，而離心法依靠分子量的大小沉淀蛋白，分子量較大的蛋白先沉淀，羊乳中主要蛋白大小依次為：αs1-酪蛋白(23600Da),αs2-酪蛋白(25150Da)，β-酪蛋白(24000Da)，κ-酪蛋白(19000Da)，β-乳球蛋白(18300Da)，α-乳球蛋白(14400Da)。從分子量來看，乳清蛋白(β-乳球蛋白及α-乳球蛋白)和酪蛋白的分子量相差并不大，尤其是κ-酪蛋白的分子量十分接近乳清蛋白，所以難以用離心法從乳清中去除。

4.膜過濾法

膜過濾法使用半透膜作為選擇障礙層，利用膜兩側的能量差為動力，通過膜的孔徑大小對蛋白質進行過濾，過濾大粒子，通過小粒子，從而起到分離溶液作用。這是一種新型方法，膜過濾存在濃差極化，膜污染的問題，過濾時程長，易導致奶樣酸化等問題。

5.雙水相萃取法

雙水相萃取法的使用率較低。它用不互溶的兩種聚合物(如聚乙二醇和葡聚糖)溶液，或是不互溶的鹽溶液和聚合物溶液(如硫酸銨和聚乙二醇)。通常先將兩種溶質配制成合適濃度的水溶液，再將兩者按照不相同的比值配合起來。靜置中超過某濃度范圍時，兩種溶質就會產生兩相。試驗中選擇聚乙二醇、硫酸鹽做雙水相，乳蛋白應該富集在聚乙二醇相(上相)，乳脂應該富集在鹽相(下相)。筆者發(fā)現(xiàn)該方法的原料應使用羊乳粉，當使用生羊乳為樣品時，因為羊乳中的液體成分復雜，無法回收聚乙二醇和硫酸銨，并且高濃度的硫酸銨極易使羊乳的蛋白鹽析，該方法適合在其它提純乳清方法基礎上，制備脫脂乳清粉，只能將乳粉中的乳脂去除。

6.CO₂沉淀分離法

CO₂溶于水，生成碳酸，降低溶液的pH，當溶劑的溫度較低，壓力較大的時候，CO₂的溶解度會相應增大，從而能達到較低的pH，當pH達到某種蛋白等電點的時候，會導致該蛋白聚沉，降低壓力后溶液能回復到正常的pH，與等電點沉淀和鹽析相比，CO₂在蛋白分離后更容易除去，這就是該方法的優(yōu)勢所在。然而該方法需要對奶樣進行約40倍的稀釋，且分離裝置較昂貴，這些都是制約因素。

7.超臨界CO₂萃取法

該方法成本很高，設備昂貴，不適合農產品和食品的加工。

中國專利“一種酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法”(公開日：2013.07.24，公開號：CN103215333A)中公開了先離心再等電點沉淀的酪蛋白分離步驟，酪蛋白的得率接近12％，但是，考慮到羊乳中乳蛋白的含量僅為3～4％，且乳蛋白中酪蛋白的比重為80％，因此，使用該專利提供的方法無法達到有效分離酪蛋白的目的。

目前，亟待提出一種既可以降低酪蛋白的含量，又可以提高乳蛋白得率的羊乳乳清分離方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提取羊奶乳清的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案：

1)將羊奶樣品經均質處理后于18～25℃條件下離心，離心的轉速為≥17000g；

2)離心后棄去離心體系的上層脂肪和下層沉淀，得到羊奶上清液；

3)用等電點沉淀法分離羊奶上清液中的酪蛋白，收集分離酪蛋白后的羊奶上清液，得到羊奶乳清。

所述羊奶樣品選自采集的新鮮羊奶或4℃以下低溫保存的未發(fā)生酸敗的羊奶。

所述步驟1)中，離心的時間≥0.5h。

所述步驟3)具體包括以下步驟：用鹽酸調節(jié)羊奶上清液的pH至4.6～4.7，然后進行靜置，直至不再析出沉淀，然后通過離心去除沉淀。

所述靜置的時間為25～35min。

所述步驟3)中，離心的條件為：4℃條件下5000g離心20～30min。

所述均質處理包括以下步驟：將羊奶樣品置于37～40℃恒溫水浴搖床中溫育20～30min，轉速為60～80rpm。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

與現(xiàn)有分離提取乳清的方法相比，本發(fā)明主要采用“高速離心-等電點沉淀-離心分離沉淀”的乳清分離方法；根據(jù)羊乳蛋白特性，在對羊乳均質后，采用高速離心不僅能更有效的去除乳脂，還能選擇性地沉淀羊乳中分子量較大的酪蛋白，然后經過等電點沉淀，可最大限度地降低酪蛋白的含量，并提高乳蛋白的得率，因此獲得了有效分離羊奶乳清的技術效果，具有較高的推廣應用前景和經濟價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述提取羊奶(羊乳)乳清的方法的流程圖；

圖2為奶樣不同處理的SDS-PAGE分析結果；

圖3為αs1酪蛋白標準品線性回歸曲線。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細說明。

(一)乳清分離實施例(參見圖1)

1)將40mL新鮮羊奶或者4℃保存的羊奶置于恒溫水浴搖床上，37℃溫育30min，轉速為60～80rpm，使羊奶結構均勻，并且達到預定的溫度(37℃)，當羊奶體積大于40mL時，酌情延長溫育時間。本方法必須使用理化性質正常的羊奶，酸敗的奶樣在室溫下有固形物小顆粒析出，無法使用，-20℃保存半個月以上的羊奶酸敗狀況嚴重，-20℃保存半個月以內的羊奶可根據(jù)是否酸敗酌情使用。

2)將經過溫育的羊奶于18℃條件下17800g離心1h。棄去離心后的羊奶上層脂肪和下層蛋白沉淀，收集羊奶上清液。本方法中，升高離心的溫度會導致在室溫下進行后續(xù)操作時(刮去脂肪層的操作在室溫下進行，該操作需要耗費一定的時間，在處理大量樣品的時候尤其明顯，在這段時間內會導致離心后奶樣的升溫)脂肪層的回溶，進一步降低離心的溫度可使脂肪層的硬度增加，但離心時會有破損的可能，破碎的脂肪層散落在乳清層中，不易除盡。離心宜選用10mL以上的離心體系，40mL離心體系能得到較好的分離效果，離心體系過小會導致實驗誤差的增大?？s短17800g轉速下的離心時間至30min也能得到較高的酪蛋白去除率，離心時間延長至大于1h能進一步提高酪蛋白去除率，但是提高的幅度很小。

3)在室溫環(huán)境下，加入1mol/L鹽酸使羊奶上清液pH達到4.6，在此過程中持續(xù)攪拌，使鹽酸與羊奶上清液充分混勻，然后靜置30min。本方法中，等電點沉淀時pH小于4.6，能得到更高的酪蛋白去除率，但同時會沉淀乳清蛋白，導致乳清蛋白得率的下降。pH超過4.7會導致酪蛋白的去除率下降。

4)4℃條件下5000g離心20min，收集上清液，即獲得羊奶乳清，計算其乳蛋白得率及酪蛋白去除率。

(二)乳清分離結果分析

1.乳蛋白得率

利用BCA蛋白檢測試劑盒分析發(fā)現(xiàn)，上述實施例獲得的乳清中乳蛋白(總蛋白)的濃度為10.226+0.240mg/mL，與純羊奶樣品相比乳蛋白得率高達到44.5％，參見表1。

表1提取乳清不同方法的結果比較

2.SDS-PAGE電泳

根據(jù)測得的乳蛋白濃度進行SDS-PAGE電泳。取5μL乳清樣品與上樣緩沖液混合后煮沸5min，冷卻備用。配制15％分離膠、5％濃縮膠，將各樣品(制樣參考以上步驟)加入電泳槽中(等體積加樣)，100V電泳30min，之后140V電泳100min。電泳結束后對凝膠進行考馬斯亮藍G-250染色30min，之后脫色至背景透明。結果見圖2，上述實施例獲得的乳清中酪蛋白條帶明顯變弱，說明酪蛋白去除率很高。

3.酪蛋白污染檢測

利用imagej灰度分析法對圖2獲得蛋白條帶定量分析發(fā)現(xiàn)，上述實施例可有效去除酪蛋白，去除率達到63.9％。

表2不同分離方法的酪蛋白去除率

4.αs1酪蛋白污染檢測

利用αs1酪蛋白檢測試劑盒標準品獲得αs1酪蛋白標準品線性回歸曲線(圖3)。利用回歸曲線獲得7個樣品的αs1酪蛋白濃度。結果發(fā)現(xiàn)，上述實施例獲得的乳清中αs1酪蛋白濃度為2.285±0.095mg/mL，與純羊奶樣品相比αs1酪蛋白去除率達到14.9％。

表3 6種分離方法處理后的αs1酪蛋白濃度

本發(fā)明將高速離心法、等電點沉淀法聯(lián)合使用，獲得的乳蛋白濃度為10.226+0.240mg/mL，乳蛋白得率達到44.5％。同時，顯著去除羊奶中的酪蛋白，去除率可達到總酪蛋白的63.9％，并用ELISA試劑盒分析發(fā)現(xiàn)αs1酪蛋白的去除率可達14.9％。以上結果證實，本發(fā)明的方法(離心+等電點)是獲得羊奶乳清的有效方法。