一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，包括如下步驟：首先準備原核表達載體，接著將大腸埃希氏菌菌株分離、純化獲得二氫葉酸合成酶，然后以大腸埃希氏菌的基因組為模板調(diào)取獲得的二氫葉酸合成酶基因片段并克隆到原核表達載體中獲得克隆載體，接著將克隆載體與原核表達載體提取重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒與大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種，接著將陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體，然后將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚濃縮，離心獲得蛋白，最后將蛋白純化。本發(fā)明所述一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，在高結合力作用下生產(chǎn)的快速檢測產(chǎn)品比同類型的抗體結合原理生產(chǎn)的產(chǎn)品有更高靈敏度。
【專利說明】一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法。

【背景技術】
[0002]目前檢測鮮奶中抗生素的方法多種多樣，傳統(tǒng)的方法有:微生物檢測法、色譜法、免疫學法等。這些傳統(tǒng)方法雖然靈敏度較高，但檢測步驟繁瑣、儀器設備及操作人員要求較高、耗時較長，一般都要兩小時以上。而對于企業(yè)來說生產(chǎn)效率是第一位的，所以快速檢測在企業(yè)中備受青睞。但目前快速檢測試劑盒為進口試劑盒，成本較高，一個檢測96個樣品的試劑盒價格在3000元以上。這使得每年一個中小乳制品企業(yè)用在抗生素檢測領域的資金至少要幾十萬。國內(nèi)快速有效檢測產(chǎn)品的缺失及高昂的進口試劑使得國內(nèi)乳制品抗生素檢測市場潛力巨大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其所使用的結合蛋白是通過基因技術改造的磺胺嘧啶的天然結合蛋白，在高結合力的作用下生產(chǎn)的快速檢測產(chǎn)品比同類型的抗體結合原理生產(chǎn)的產(chǎn)品有更高的靈敏度。
[0004]為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是:
一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，包括如下步驟:首先準備原核表達載體([￡1'-2?)，接著將大腸埃希氏菌(￡.^)11)菌株分離、純化獲得二氫葉酸合成酶，然后以大腸埃希氏菌(￡.￠:011)的基因組為模板調(diào)取獲得的二氫葉酸合成酶基因片段并克隆到原核表達載體(卩日!'-2?)中獲得克隆載體，接著將克隆載體與原核表達載體([￡1'-2?)提取重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種，接著將陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體，然后將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚濃縮，離心獲得蛋白，最后將蛋白純化。
[0005]所述克隆載體與原核表達載體$￡1'-2?)提取重組質(zhì)粒時首先用內(nèi)切酶(乂“工和￡(3081)對克隆載體與原核表達載體$￡1-28^0分別進行雙酶切后凝膠電泳后回收片段，接著用連接酶(14 0嫩)將回收片段連接構建成含目的基因的原核表達載體，然后將含目的基因的原核表達載體轉化大腸桿菌(0115 0 )后提取重組質(zhì)粒。
[0006]所述重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種時首先在一701中取出的含感受態(tài)大腸桿菌(8121 )50 放入離心管中插入濕冰溶解15-11,接著向離心管中加入5 9 1的重組質(zhì)?；旌暇鶆蚝箪o置冰上30111111，然后將在421中水浴加熱908后冰浴靜置2111111，接著將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )加入800 9 I的含氨芐青霉素的18培養(yǎng)基中于371時振蕩培養(yǎng)1卜，然后取50 ^ I培養(yǎng)物涂18瓊脂平板上于371培養(yǎng)12匕后獲得單菌落，接著挑落單菌落用培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12卜后提質(zhì)粒獲得陽性克隆菌種。
[0007]所述陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體時首先將陽性克隆菌種接種于18培養(yǎng)基中，于371振動培養(yǎng)2處后將培養(yǎng)物轉接至18培養(yǎng)基，371振蕩培養(yǎng)至00600為0.8；然后在⑶培養(yǎng)基中加入異丙基--0-硫代吡喃半乳糖苷(191(?使其終濃度為1臟01/[，繼續(xù)培養(yǎng)411后于41^、60001~卹離心15111111收獲菌體。
[0008]將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚濃縮，離心獲得蛋白時首先菌體重懸于磷酸緩沖液$83)中后置于冰浴中超聲破碎，接著加入聚乙二醇辛基苯基醚(11-1^0^-100)后濃縮至最終濃度為1%，然后將混合物攪拌30111111，接著于41、12000 I'卹離心15 111111后收集蛋白。
[0009]所述蛋白用咪唑純化。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其所使用的結合蛋白是通過基因技術改造的磺胺嘧啶的天然結合蛋白，在高結合力的作用下生產(chǎn)的快速檢測產(chǎn)品比同類型的抗體結合原理生產(chǎn)的產(chǎn)品有更高的靈敏度。

【具體實施方式】
[0011]實施例1
一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，包括如下步驟:首先準備原核表達載體([￡1'-2?)，接著將大腸埃希氏菌(￡.(^11)菌株分離、純化獲得二氫葉酸合成酶，然后以大腸埃希氏菌(￡.￠011)的基因組為模板調(diào)取獲得的二氫葉酸合成酶基因片段并克隆到原核表達載體(卩日!'-2?)中獲得克隆載體，接著將克隆載體與原核表達載體([￡1'-2?)提取重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種，接著將陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體，然后將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚濃縮，離心獲得蛋白，最后將蛋白純化。
[0012]所述克隆載體與原核表達載體'-2?)提取重組質(zhì)粒時首先用內(nèi)切酶(乂“工和￡(3081)對克隆載體與原核表達載體$￡1-28^0分別進行雙酶切后凝膠電泳后回收片段，接著用連接酶(14 0^0將回收片段連接構建成含目的基因的原核表達載體，然后將含目的基因的原核表達載體轉化大腸桿菌(0115 0 )后提取重組質(zhì)粒。
[0013]所述重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種時首先在一701中取出的含感受態(tài)大腸桿菌(8121 )50 放入離心管中插入濕冰溶解15-11,接著向離心管中加入5 9 1的重組質(zhì)?；旌暇鶆蚝箪o置冰上30111111，然后將在421中水浴加熱908后冰浴靜置2111111，接著將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(8121 )加入800 9 I的含氨芐青霉素的18培養(yǎng)基中于371時振蕩培養(yǎng)1卜，然后取50 ^ I培養(yǎng)物涂18瓊脂平板上于371培養(yǎng)12匕后獲得單菌落，接著挑落單菌落用培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12卜后提質(zhì)粒獲得陽性克隆菌種。
[0014]所述陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體時首先將陽性克隆菌種接種于18培養(yǎng)基中，于371振動培養(yǎng)2處后將培養(yǎng)物轉接至18培養(yǎng)基，371振蕩培養(yǎng)至00600為0.8；然后在⑶培養(yǎng)基中加入異丙基--0-硫代吡喃半乳糖苷(191(?使其終濃度為1臟01凡，繼續(xù)培養(yǎng)411后于41^、6000:01?)離心15111111收獲菌體。
[0015]將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚濃縮，離心獲得蛋白時首先菌體重懸于磷酸緩沖液$83)中后置于冰浴中超聲破碎，接著加入聚乙二醇辛基苯基醚(11-1^0^-100)后濃縮至最終濃度為1%，然后將混合物攪拌30111111，接著于41、12000 I'卹離心15 111111后收集蛋白。
[0016]所述蛋白用咪唑純化。
[0017]本實施例的一種膜片式單向閥，其結構簡單,使用方便，提高單向密封性的同時提高了單向閥的使用壽命。
【權利要求】
1.一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟:首先準備原核表達載體(PET-28a)，接著將大腸埃希氏菌(E.Coli)菌株分離、純化獲得二氫葉酸合成酶，然后以大腸埃希氏菌(E.Coli)的基因組為模板調(diào)取獲得的二氫葉酸合成酶基因片段并克隆到原核表達載體(PET-28a)中獲得克隆載體，接著將克隆載體與原核表達載體(PET-28a)提取重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(BL21 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種，接著將陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體，然后將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-1OO)濃縮，離心獲得蛋白，最后將蛋白純化。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于:所述克隆載體與原核表達載體(PET-28a)提取重組質(zhì)粒時首先用內(nèi)切酶(XhoI和EcoRI)對克隆載體與原核表達載體(PET-28a)分別進行雙酶切后凝膠電泳后回收片段，接著用連接酶(T4 DNA)將回收片段連接構建成含目的基因的原核表達載體，然后將含目的基因的原核表達載體轉化大腸桿菌(DH5 α )后提取重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于:所述重組質(zhì)粒與大腸桿菌(BL21 )在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得陽性克隆菌種時首先在一70°C中取出的含感受態(tài)大腸桿菌(BL21 ) 50 μ L放入離心管中插入濕冰溶解15min，接著向離心管中加入5 μ L的重組質(zhì)?；旌暇鶆蚝箪o置冰上30min，然后將在42°C中水浴加熱90s后冰浴靜置2min，接著將重組質(zhì)粒與大腸桿菌(BL21 )加入800 μ L的含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C時振蕩培養(yǎng)lh，然后取50 μ L培養(yǎng)物涂LB瓊脂平板上于37°C培養(yǎng)12h后獲得單菌落，接著挑落單菌落用LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12h后提質(zhì)粒獲得陽性克隆菌種。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于:所述陽性克隆菌種在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、離心獲得菌體時首先將陽性克隆菌種接種于LB培養(yǎng)基中，于37°C振動培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)物轉接至LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.8;然后在LB培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為lmmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4h后于4°C、6000rmp離心15min收獲菌體。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于:將菌體與聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-1OO)濃縮，離心獲得蛋白時首先菌體重懸于磷酸緩沖液(PBS)中后置于冰浴中超聲破碎，接著加入聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-1OO)后濃縮至最終濃度為I %，然后將混合物攪拌30min，接著于4°C、12000 rmp離心15 min后收集蛋白。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種受體配體結合的磺胺類抗生素蛋白的制備方法，其特征在于:所述蛋白用咪唑純化。
【文檔編號】C12R1/19GK104388504SQ201410686178
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權日:2014年11月26日
【發(fā)明者】施戈韜 申請人:紹興康知生物科技有限公司