一種基于lamp技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法，該方法包括以下步驟：⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA；⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系；⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系；⑷進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；⑸LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定：在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑1000×SYBRGREENI熒光染料，混勻，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果；當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定樣品中存在動(dòng)物源性成分；當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動(dòng)物源性成分。本發(fā)明具有高特異性，且具有快速高效、操作簡便，檢測成本低的特點(diǎn)，適合現(xiàn)場快速檢測。
【專利說明】-種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物源性成分檢測方法，尤其涉及一種基于LAMP技術(shù)的植物源 性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，市場上植物油火鍋底料和各類油炸食品等植物源性食品消費(fèi)量巨大，為了 杜絕使用地溝油或者劣質(zhì)動(dòng)物油冒充植物油生產(chǎn)植物源性食品，確保食品安全，保護(hù)廣大 消費(fèi)者的切身利益，同時(shí)考慮不同民族、宗教信仰人群飲食文化差異，都需要對(duì)植物源性食 品中動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測。
[0003] 國內(nèi)外眾多學(xué)者也對(duì)動(dòng)物源性成分的檢測技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，目前主要以樣 品的組織學(xué)特性和品種特異性的生物標(biāo)記物，如蛋白質(zhì)、DNA和其他生物大分子等為對(duì)象， 檢測方法主要有顯微鏡檢、紅外光譜、普通PCR、熒光定量PCR、ELISA等，但這些方法存在檢 測量小、易產(chǎn)生假陽性、要求檢驗(yàn)人員有豐富的操作經(jīng)驗(yàn)、要求專門的檢測設(shè)備等缺點(diǎn)，因 此迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的方法。LAMP方法具有快速高效、操作簡便、特異性 強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)、不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場快速檢測，正是一種可以滿足這些要求的 方法。
[0004] 專利（200710144833. 5)提供一種利用普通PCR技術(shù)檢測動(dòng)物源性成分的鑒別方 法，該方法與本發(fā)明相比，具有靈敏度低，易產(chǎn)生假陽性、要求專門的檢測設(shè)備，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn) 場檢測的缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、高效的基于LAMP技術(shù)的植物源性 食品中動(dòng)物源性成分檢測方法。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性 成分檢測方法，包括以下步驟： ⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA; ⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200yLPCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測樣品DNA2飛yL、檢測引物溶液1.5iiL、濃 度為疒9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3iiL，用滅 菌去離子水補(bǔ)齊到25iiL;其中 所述檢測引物溶液是指由濃度為4~6Mmol/L的外引物I、濃度為4~6Mmol/L的外引 物II、濃度為32~48Mfliol/L的內(nèi)引物I和濃度為32~48Mffl〇l/L的內(nèi)引物II配制而成； 所述 10X反應(yīng)緩沖液是指由 200mmol/L且pH= 8. 8 的Tris-HCl，100mmol/LKC1， 100mmol/L(NH4) 2S04,40?100mmol/LMgS04,6?14mol/L甜菜喊混合而成； 所述dNTPs溶液是指由濃度分別為10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧 核糖核苷酸溶液等體積混合而成； ⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200iiLPCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽性DNA對(duì)照樣品2?5iiL、檢測引物溶液1. 5iiL、 濃度為疒9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25yL; 在200yLPCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5yL、檢測引物溶液1.5iiL、 濃度為疒9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25yL; 其中 所述陽性DNA對(duì)照樣品是指含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品； 所述陰性DNA對(duì)照樣品是指不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA; ⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管I、PCR反應(yīng)管II、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定：在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1?2ML顯色劑1000XSYBRGREEN I熒光染料，混勻，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果；當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定 樣品中存在動(dòng)物源性成分；當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動(dòng)物源性成分。
[0007] 所述步驟⑵中外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 2第1位到19位所 /_J、i〇
[0008] 所述步驟⑵中外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 3第1位到19位所 /_J、i〇
[0009] 所述步驟⑵中內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 4第1位到44位所 /_J、i〇
[0010] 所述步驟⑵中內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 5第1位到43位所 /_J、i〇
[0011] 所述步驟⑶中脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQID NO. 1第1位到259位所示。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、在食品烹飪過程中，經(jīng)過蒸、煮、煎、炸、炒等高溫處理，細(xì)胞核基因組往往被破壞，但 線粒體DNA具有分子量小、拷貝數(shù)多和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易檢出，因此，本發(fā)明中的脊椎動(dòng)物線粒 體高度保守DNA序列是動(dòng)物源性成分檢測的理想靶基因。
[0013] 2、本發(fā)明中脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列僅存在于脊椎動(dòng)物，而在細(xì)菌、古 菌、真菌和綠色植物線粒體中則不存在，因此，可作為LAMP技術(shù)檢測植物源性食品中是否 含有動(dòng)物源性成分的依據(jù)，為本發(fā)明的特異性和準(zhǔn)確性提供了保障。
[0014] 3、本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)以動(dòng)物線粒體DNA為檢測靶標(biāo)，設(shè)計(jì)六 個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性，且具 有快速高效、操作簡便，在不到1小時(shí)即可完成檢測。
[0015] 4、本發(fā)明樣品處理簡單，只需提取樣品的DNA，即可快速高效的檢出各種食品樣品 中否含有動(dòng)物源性成分，不受食品來源、種類、加工方式、加工程度、保存條件的影響。
[0016] 5、本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè) 備，檢測成本低，適合現(xiàn)場快速檢測。
[0017] 6、采用本發(fā)明方法，分別對(duì)含有豬、牛、羊、雞和魚等動(dòng)物源性成分的火腿腸，市場 上常見的小麥、大米、玉米、土豆和2種植物調(diào)和油進(jìn)行測試，結(jié)果顯示所有含有動(dòng)物源性 成分的火腿腸（1-5)和陽性對(duì)照（P)反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色，市場上常見的小麥（6)、大米（7)、玉 米（8)、土豆（9)、2種植物調(diào)和油（10、11)和陰性對(duì)照（幻顯現(xiàn)橙色，表明本發(fā)明試劑盒及檢 測方法具有很好的通用性和特異性(參見圖1)。
[0018] 7、采用本發(fā)明方法，在植物油中分別加入100%、1%、0. 1%、0. 01%、0. 001%和0% (v/ V)的牛油，采用本發(fā)明分別對(duì)上述樣品進(jìn)行測試，結(jié)果顯示樣品中比例為100% (p)、l%(l)、 0? 1% (2)和0? 01% (3)的反應(yīng)管中均呈現(xiàn)綠色，而0? 001% (4)和0% (N)的反應(yīng)管中顯現(xiàn) 橙色，表明本發(fā)明檢測方法的靈敏度可達(dá)0.01% (參見圖2)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0020] 圖1為本發(fā)明LAMP檢測方法的通用性和特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明LAMP靈敏度檢測結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法，包括以下步驟： ⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA; ⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200yLPCR反應(yīng)管I內(nèi)加入待測樣品DNA2?5yL、檢測引物溶液1.5iiL、濃度為 7?9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2.5iiL、dNTPs溶液3iiL，用滅菌去 離子水補(bǔ)齊到25iiL;其中 檢測引物溶液是指由濃度為4~6Mmol/L的外引物I、濃度為4~6Mmol/L的外引物II、濃度為32~48Mfliol/L的內(nèi)引物I和濃度為32~48Mffl〇l/L的內(nèi)引物II配制而成；外引物I的 核苷酸序列如序列表中SEQIDN0. 2第1位到19位所示；外引物II的核苷酸序列如序列表 中SEQIDN0. 3第1位到19位所示；內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQIDN0. 4第1 位到44位所示；內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 5第1位到43位所示； 10X反應(yīng)緩沖液是指由 200mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100mmol/LKC1，100 mmol/L(NH4) 2S04,40?100mmol/LMgS04,6?14mol/L甜菜喊混合而成； dNTPs溶液是指由濃度分別為10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核 苷酸溶液等體積混合而成； ⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200iiLPCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽性DNA對(duì)照樣品2?5iiL、檢測引物溶液1. 5iiL、 濃度為疒9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25iiL; 在200yLPCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5yL、檢測引物溶液1.5iiL、 濃度為疒9U/iiL的BstDNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25iiL; 其中 陽性DNA對(duì)照樣品是指含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA， 或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列 的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO. 1第1位到259位所示； 陰性DNA對(duì)照樣品是指不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA; ⑷分別對(duì)PCR反應(yīng)管I、PCR反應(yīng)管II、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：6(T65°C孵 育2(T60min,80°C孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定：在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1?2ML顯色劑1000XSYBRGREEN I熒光染料，混勻，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果；當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定 樣品中存在動(dòng)物源性成分；當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動(dòng)物源性成分。
【權(quán)利要求】
1. 一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法，包括以下步驟： ⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA ; ⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200 yL PCR反應(yīng)管I內(nèi)加入所述待測樣品DNA 2?5 yL、檢測引物溶液1.5iiL、濃 度為疒9U/iiL的Bst DNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3 iiL，用滅 菌去離子水補(bǔ)齊到25 iiL;其中 所述檢測引物溶液是指由濃度為4~6 Mmol/L的外引物I、濃度為4~6 Mmol/L的外引 物II、濃度為32~48 Mfliol/L的內(nèi)引物I和濃度為32~48Mffl〇l/L的內(nèi)引物II配制而成； 所述 10X 反應(yīng)緩沖液是指由 200 mmol/L 且 pH= 8. 8 的 Tris-HCl，100 mmol/L KC1， 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgS04,6?14 mol/L 甜菜喊混合而成； 所述dNTPs溶液是指由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧 核糖核苷酸溶液等體積混合而成； ⑶配制對(duì)照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系： 在200 ii L PCR反應(yīng)管II內(nèi)加入陽性DNA對(duì)照樣品2?5 ii L、檢測引物溶液1. 5 ii L、 濃度為疒9U/iiL的Bst DNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3 iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 y L ; 在200 yL PCR反應(yīng)管III內(nèi)加入陰性DNA對(duì)照樣品2?5 yL、檢測引物溶液1.5iiL、 濃度為疒9U/iiL的Bst DNA聚合酶liiL、10X反應(yīng)緩沖液2. 5iiL、dNTPs溶液3 iiL，用 滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 y L ; 其中 所述陽性DNA對(duì)照樣品是指含有脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質(zhì)粒 DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品； 所述陰性DNA對(duì)照樣品是指不含脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的DNA; ⑷分別對(duì)所述PCR反應(yīng)管I、PCR反應(yīng)管II、PCR反應(yīng)管III進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：6(T65°C 孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)； (5) LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定：在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1?2 ML顯色劑1000 XSYBR GREEN I熒光染料，混勻，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果；當(dāng)出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定 樣品中存在動(dòng)物源性成分；當(dāng)出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動(dòng)物源性成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法， 其特征在于：所述步驟⑵中外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2第1位到19位 所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法， 其特征在于：所述步驟⑵中外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3第1位到19位 所示。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法， 其特征在于：所述步驟⑵中內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4第1位到44位 所示。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方法， 其特征在于：所述步驟⑵中內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 5第1位到43位 所示。
6.如權(quán)利要求1所述的一種基于LAMP技術(shù)的植物源性食品中動(dòng)物源性成分檢測方 法，其特征在于：所述步驟⑶中脊椎動(dòng)物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表 中SEQ ID NO. 1第1位到259位所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328194SQ201410637171
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】徐紅偉, 臧榮鑫 申請(qǐng)人:西北民族大學(xué)