飲用水源水中腸道病毒的檢測方法
【專利摘要】一種飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，屬于水質(zhì)檢測方法領域。該檢測方法，包括以下步驟：（1）水樣處理，（2）水樣濃縮，（3）細胞培養(yǎng)，（4）病毒檢測。本發(fā)明所述的檢測方法測定水中腸道病毒含量簡單易行、準確度高、重復性高、檢測極限低，可在環(huán)境監(jiān)測站作為水中腸道病毒含量的測定方法而推廣使用。
【專利說明】飲用水源水中腸道病毒的檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，屬于水質(zhì)檢測方法領域。

【背景技術】
[0002]隨著生活水平的日益改善，人們對生活飲用水的衛(wèi)生要求不斷提高。由水傳播的病毒性疾病的流行在許多國家和地區(qū)都有報告。為確保飲用水的質(zhì)量，對水源水和飲用水中腸道病毒的檢測具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]因此，研究一種準確度高、重復性高、操作簡便、檢測極限低的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法很有必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種準確度高、重復性高、操作簡便、檢測極限低的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法。
[0005]本發(fā)明所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，包括以下步驟:
(I)水樣處理:用無菌采樣瓶收集水源水樣,將1%體積比的Earl^ s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)pH為4.5。
[0006](2)水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪于175mm直徑的過濾器網(wǎng)板上，用無菌水浸濕，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸濕的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然后蓋上兩張直徑相同的濾紙。將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾。待水樣全部通過吸附層后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液。用lmol/L鹽酸調(diào)pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用。
[0007](3)細胞培養(yǎng):將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋并分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)。
[0008](4)病毒檢測:細胞成片后，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養(yǎng)瓊脂平鋪待凝，凝固后37°C翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時，然后用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水沖洗干凈，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水沖洗，觀察空斑并計數(shù)，設一瓶空白對照，即細胞不經(jīng)接種做空斑試驗；通過空斑數(shù)量計算病毒濃度。
[0009]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的Earle' s平衡鹽液配制方法為A液:取氯化鈉6.Sg、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶于800mL 二次蒸餾水中，B液:氯化鈣0.2g溶于150mL 二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，4°C保存。
[0010]更優(yōu)選的，本發(fā)明所述的滑石粉-硅藻土混懸液配制方法為取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勻后室溫或4°C保存。
[0011]進一步優(yōu)選的，本發(fā)明所述的生長液配制方法為取濃度為1.04%的1640培養(yǎng)液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻后4°C保存。
[0012]更進一步優(yōu)選的，本發(fā)明所述的EDTA-胰酶消化液配制方法為取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，-20°C保存。
[0013]本發(fā)明所述的檢測方法中，分為水樣濃縮、細胞培養(yǎng)、病毒檢測三部分。水中病毒濃縮方法有很多種，鑒于有的需昂貴的儀器設備，有的操作繁瑣。本方法采用了適合于一般實驗室條件下開展水病毒檢測的滑石粉-硅藻土濃縮系統(tǒng)，其基本原理是病毒與滑石粉發(fā)生電化學作用產(chǎn)生一種可逆性結合，在酸性環(huán)境中病毒帶正電荷，易吸附在滑石粉上；在堿性環(huán)境中，用洗脫液能有效地將吸附于滑石粉上的病毒洗脫下來，病毒不能獨立繁殖，必須寄生于細胞內(nèi)才能增殖。由于病毒在敏感細胞中可使細胞產(chǎn)生病變，并在一定條件下形成蝕斑，所以將待檢水樣接種于敏感細胞中，根據(jù)細胞病變效應(CPE)可定性判斷病毒的有無；根據(jù)空斑形成單位(PFL)來定量計算水中病毒的含量。
[0014]水中腸道病毒含量的計算公式為 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒濃度，單位；PFL/L ；A—每瓶空斑數(shù)，單位:個PFL;B—接種量，單位:mL ；C—水樣濃縮量，單位:mL ；D—水樣米集量，單位:L
本發(fā)明所述的檢測方法中，分為水樣濃縮、細胞培養(yǎng)、病毒檢測三部分，測定水中腸道病毒含量簡單易行、準確度高、重復性高、檢測極限低，可在環(huán)境監(jiān)測站作為水中腸道病毒含量的測定方法而推廣使用。

【具體實施方式】
[0015]實施例一:
配制Earle' s平衡鹽液:A液:取氯化鈉6.8g、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉
0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶于800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶于150mL 二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，40C保存。
[0016]配制滑石粉-硅藻土混懸液:取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勾后室溫或4 C保存。
[0017]配制生長液:取濃度為1.04%的1640培養(yǎng)液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻后4°C保存。
[0018]配制EDTA-胰酶消化液:取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，-20°C保存。
[0019]水樣處理:用無菌采樣瓶收集水源水樣，將1%體積比的Earle' s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)pH為4.5。
[0020]水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪于175mm直徑的過濾器網(wǎng)板上，用無菌水浸濕，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸濕的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然后蓋上兩張直徑相同的濾紙。將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾。待水樣全部通過吸附層后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液。用lmol/L鹽酸調(diào)pH至7.2左右。用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用。
[0021]細胞培養(yǎng):將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋并分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)。
[0022]病毒檢測:細胞成片后，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養(yǎng)瓊脂平鋪待凝，凝固后37°C翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時，然后用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水沖洗干凈，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水沖洗，觀察空斑并計數(shù)，設一瓶空白對照，即細胞不經(jīng)接種做空斑試驗；通過空斑數(shù)量計算病毒濃度。
[0023]水中腸道病毒含量的計算公式為 E= ((A/B) XC) /D
其中，E—水中病毒濃度，單位；PFL/L ；A—每瓶空斑數(shù)，單位:個PFL;B—接種量，單位:mL ；C—水樣濃縮量，單位:mL ；D—水樣米集量，單位:L。
【權利要求】
1.飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，包括以下步驟: (1)水樣處理:用無菌采樣瓶收集水源水樣,將1%體積比的Earl^s平衡液加入水樣中以促進病毒的吸附，充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)pH為4.5 ; (2)水樣濃縮:將一張直徑175mm的濾紙平鋪于175mm直徑的過濾器網(wǎng)板上，用無菌水浸濕，將滑石粉-硅藻土混懸液倒在浸濕的濾紙上，加壓抽濾，使之形成均勻而平整的薄層，然后蓋上兩張直徑相同的濾紙，將處理好的水樣加到吸附層上加壓過濾，待水樣全部通過吸附層后，用30mL的3%牛肉浸膏洗脫液洗脫吸附層上的病毒，抽濾，收集洗脫液，用lmol/L鹽酸調(diào)pH至7.2左右，用0.22 μ m的微孔濾膜抽濾除菌，得到水樣濃縮液，置4°C冰箱待用； (3)細胞培養(yǎng):將長成單層的Hela細胞生長液倒掉，加入適量的EDTA-胰酶消化液消化，加入適量的生長液，用吸管吹打分散細胞，再用生長液稀釋并分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)； (4)病毒檢測:細胞成片后，棄去生長液，加水樣濃縮液，37°C吸附1-2小時，每隔15分鐘振蕩一次；將接種過的細胞倒掉水樣液，加適量的46°C _47°C營養(yǎng)瓊脂平鋪待凝，凝固后37°C翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時，然后用甲醛液固定20分鐘，甩掉瓊脂，自來水沖洗干凈，再加入結晶紫染色20分鐘，自來水沖洗，觀察空斑并計數(shù)，設一瓶空白對照，即細胞不經(jīng)接種做空斑試驗；通過空斑數(shù)量計算病毒濃度。
2.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特征在于所述的Earle' s平衡鹽液配制方法為A液:取氯化鈉6.8g、氯化鉀0.4g、硫酸鎂0.2g、磷酸二氫鈉0.125g、葡萄糖lg、碳酸氫鈉Ig溶于800mL 二次蒸懼水中,B液:氯化I丐0.2g溶于150mL二次蒸餾水中，使用時將B液加到A液中攪拌均勻，40C保存。
3.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特征在于所述的滑石粉-硅藻土混懸液配制方法為取滑石粉2.7g、硅藻土 0.9g加入10mL 二次蒸餾水中混勻后室溫或4°C保存。
4.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特征在于所述的生長液配制方法為取濃度為1.04%的1640培養(yǎng)液90mL、小牛血清(滅活)10mL、雙抗液ImL混勻后4 C保存。
5.如權利要求1所述的飲用水源水中腸道病毒的檢測方法，其特征在于所述的EDTA-胰酶消化液配制方法為取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.3g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.4g、葡萄糖1.0g、碳酸氫鈉0.5g,0.22 μ m微孔濾膜抽濾除菌，_20°C保存。
【文檔編號】C12Q1/70GK104372107SQ201410496524
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權日:2014年9月25日
【發(fā)明者】陸強 申請人:陜西華陸化工環(huán)保有限公司