一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置與方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置與方法，包括精密阻抗分析儀、多通道控制開關模塊、QCM傳感器陣列、細胞培養(yǎng)池陣列、細胞培養(yǎng)箱、控制器，其中，細胞培養(yǎng)池陣列中的QCM傳感器陣列的每個QCM傳感器分別接在多通道控制開關模塊的各個開關上，各個QCM傳感器放置在不同的細胞培養(yǎng)池中，各個細胞培養(yǎng)池放置于相同或不同的細胞培養(yǎng)箱中；控制器與多通道開關模塊連接，驅動多通道開關模塊中各個開關的開、合。本發(fā)明在相同培養(yǎng)環(huán)境下監(jiān)測正常細胞和腫瘤細胞生長過程對比實驗、在不同培養(yǎng)環(huán)境下相同細胞生長過程對比實驗、用不同種凝集素修飾石英晶體監(jiān)測其誘導正常細胞凝集生長過程的對比實驗。
【專利說明】—種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置與方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置與方法。

【背景技術】
[0002]壓電石英晶體微天平(QCM)是一種對質量變化高度敏感的化學傳感器，具有靈敏度高，無需標記處理、可原位，實時監(jiān)測界面過程的優(yōu)點，被廣泛用于分析化學的各個領域。QCM具有操作簡便、連續(xù)監(jiān)測、高靈敏度和特異性等特點。作為研究固液界面吸附過程和反應的有力工具，它在蛋白質、酶、抗原/抗體、核酸、細菌和細胞等生物學研究領域得到了廣泛應用，目前已有大量關于使用QCM實時監(jiān)測細胞培養(yǎng)過程的文獻報道。
[0003]目前，采集QCM信息的方法主要包括主動分析法和被動分析法兩種，前者QCM作為振蕩電路的組成部分直接參與諧波的產生并起頻率控制作用，具有儀器設備簡單、信號連續(xù)、采樣速率高的優(yōu)點，易于構成傳感器陣列。但主動法的主要缺點是只能提供頻率變化一種信號，當QCM在液相中諧振時，僅從頻率變化不能區(qū)分質量與非質量效應，而且在損耗較大的體系中由于不能實現(xiàn)穩(wěn)定的諧振而不能應用。被動法將QCM作為一種無源的電子器件，用阻抗分析儀等測試其諧振頻率與等效電路等，該方法的優(yōu)點是信息量大，可以區(qū)分質量與非質量效應的影響，能監(jiān)測電極表面的質量負載變化也可提供電極附近包括粘密度在內的某些物理量變化的信息，而且在損耗嚴重的體系中仍然可以應用，其缺點是儀器設備較為昂貴，響應速率較主動法低。
[0004]當用QCM實時監(jiān)測細胞培養(yǎng)動力學過程時，細胞在QCM表面生長時，QCM的頻率變化不僅來自表面的質量變化，同時還與細胞與表面的作用力、培養(yǎng)液的粘度、電導率等參數(shù)的變化有關，而且QCM在培養(yǎng)液中諧振損耗較大，因此多采用被動法進行監(jiān)測。但細胞的培養(yǎng)通常需要較長的時間，而當前大多數(shù)精密阻抗分析儀只配備一個測量端，一次只能測定單個QCM的諧振參數(shù)，又因QCM對測定的電學環(huán)境敏感，監(jiān)測過程中不宜拆換在測QCM傳感器進行其它待測QCM的測定。當需要進行多組細胞實驗時，單通道測定造成阻抗分析儀的使用效率低下，嚴重影響分析速度。雖然可以采用人工切換方法測定多個壓電石英晶體的阻抗-時間曲線時，即依次將各石英晶體接入阻抗儀測量端，可分別測定各個QCM的諧振參數(shù)，但由于切換操作過程中，晶體和導線與測量端位置會發(fā)生細微變化，易導致監(jiān)測結果誤差增大，而且大幅度增加人工操作的工作量。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明為了解決上述問題，提出了一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置與方法，本裝置通過智能控制精密阻抗分析儀和連接壓電石英晶體的多通道開關系統(tǒng)，實現(xiàn)多通道的尋址訪問與測定，使精密阻抗分析儀實時監(jiān)測細胞生長過程的效率提高，并使實驗結果更準確，可以將此方法再加以擴展應用到其他分析領域。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0007]一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，包括精密阻抗分析儀、多通道控制開關模塊、QCM傳感器陣列、細胞培養(yǎng)池陣列、細胞培養(yǎng)箱、控制器，其中，精密阻抗分析儀與多通道控制開關模塊相連，細胞培養(yǎng)池陣列中的QCM傳感器陣列的每個QCM傳感器分別接在多通道控制開關模塊的各個開關上，由控制器發(fā)送連接與斷開指令，實現(xiàn)各QCM傳感器的信息采集與分析，各個QCM傳感器放置在不同的細胞培養(yǎng)池中，各個細胞培養(yǎng)池放置于相同或不同的細胞培養(yǎng)箱中。
[0008]所述QCM傳感器為AT切型壓電石英晶體，其表面噴鍍兩個反對稱的“鑰匙孔”型的金膜電極，基頻在5?100MHz，或用3倍、5倍頻率。
[0009]所述精密阻抗分析儀與QCM傳感器連接。
[0010]所述細胞培養(yǎng)箱中填充有二氧化碳，二氧化碳濃度為4% _7%，所述培養(yǎng)箱的溫度為35-38°C，所述培養(yǎng)箱底部加有高純水。
[0011]所述細胞培養(yǎng)池中裝設有培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基高過壓電石英晶體的設置位置。
[0012]所述培養(yǎng)基為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中含有10%胎牛血清。
[0013]所述控制器與多通道開關模塊連接，驅動多通道開關模塊中各個開關的開、合。
[0014]一種基于上述系統(tǒng)的檢測方法，包括以下步驟:
[0015](I)連接控制器、多通道開關模塊和精密阻抗分析儀；
[0016](2)清洗整個裝置，并制備懸浮細胞；
[0017](3)清洗培養(yǎng)池，加入培養(yǎng)基，將各壓電石英晶體放入培養(yǎng)池內，不加待測細胞；
[0018](4)培養(yǎng)池放入培養(yǎng)箱，將多通道開關與各壓電石英晶體連接，當測量基線達到穩(wěn)定后，同時將含相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)基分別加入各培養(yǎng)池中；
[0019](5)實時監(jiān)測細胞貼壁和生長過程中的QCM的諧振頻率和動態(tài)電阻隨時間的變化曲線，存儲分析數(shù)據(jù)；
[0020](6)清洗壓電石英晶體、培養(yǎng)池和培養(yǎng)箱。
[0021]所述步驟(2)中，其具體方法為:在進行細胞傳代實驗前，先用pH = 7.3-7.5磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)瓶內待測貼壁細胞2-3次，洗去死細胞和未貼壁細胞；再用0.20% -0.30%胰蛋白酶消化貼壁細胞，獲得懸浮細胞；懸浮細胞經(jīng)離心后，用RPM1-1640培養(yǎng)基重新分散，并用細胞計數(shù)板數(shù)出經(jīng)分散后待測細胞的個數(shù)，最后轉入一個新的培養(yǎng)瓶中。
[0022]所述步驟(3)中:細胞培養(yǎng)池在紫外燈光照下用體積分數(shù)75%酒精消毒0.5-1小時，再用磷酸鹽緩沖液清洗2-5次；然后加入培養(yǎng)基，將各壓電石英晶體放入培養(yǎng)池內，再將整個細胞培養(yǎng)池放入培養(yǎng)箱中。
[0023]所述步驟(4)中，利用控制器控制多通道開關，當測量基線達到穩(wěn)定后，同時將含相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)基加入各培養(yǎng)池中，監(jiān)測細胞貼壁和生長過程中的&和R1值的變化，監(jiān)測時間為12-36小時。
[0024]所述步驟(6)中，一次實驗完成后，需及時清洗壓電石英晶體，除去上面的細胞，用胰蛋白酶浸泡10-20小時，再滴加重鉻酸鉀洗液洗滌，接著用高純水沖洗，反復清洗多次。
[0025]所述磷酸鹽緩沖液的成分包括:1.50-1.60g.T1Na2HPO4.H20、
0.15-0.25g.L-1KH2PO4J.50-8.50g.L-1NaCl 和 0.15-0.25g.L-1KCl。
[0026]所述重鉻酸鉀洗液的成分包括:20g K2Cr2O7,40mL H20、360mL濃H2S04。
[0027]本發(fā)明的工作原理為:此系統(tǒng)可同時做多組實時監(jiān)測細胞生長過程對比實驗，如:在相同培養(yǎng)環(huán)境下監(jiān)測正常細胞和腫瘤細胞生長過程對比實驗、在不同培養(yǎng)環(huán)境下相同細胞生長過程對比實驗、用不同種凝集素修飾石英晶體監(jiān)測其誘導正常細胞凝集生長過程的對比實驗等；各個對比實驗可在同一培養(yǎng)箱中同時進行監(jiān)測，兩兩互不干擾，這樣只需一天左右就可得到多組可靠的實驗結果，提高了精密阻抗分析儀的工作效率。
[0028]本發(fā)明的有益效果為:
[0029](I)實現(xiàn)多個壓電石英晶體同時監(jiān)測，通過控制精密阻抗分析儀和多通道開關，各晶體依次輪流監(jiān)測，幾秒鐘就可以采集一遍數(shù)據(jù)、提高了精密阻抗分析儀的工作效率；
[0030](2)利于減小誤差，提高精確度；在同一個細胞培養(yǎng)箱中，可同時做多組細胞生長對比實驗，這樣消除了許多干擾因素，大大減小了測量誤差。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明的結構示意圖。
[0032]其中:1、二氧化碳；2、細胞培養(yǎng)箱；3、細胞培養(yǎng)池；4、QCM傳感器；5、高純水；6、多通道開關模塊；7、電源；8、精密阻抗分析儀；9、控制器。

【具體實施方式】
:
[0033]下面結合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0034]如圖1所示，一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，包括精密阻抗分析儀8、多通道控制開關模塊6、QCM傳感器陣列、細胞培養(yǎng)池陣列、細胞培養(yǎng)箱2、控制器9，其中，精密阻抗分析儀8與多通道控制開關模塊6相連，QCM傳感器陣列的每個QCM傳感器4與細胞培養(yǎng)池陣列的細胞培養(yǎng)池3分別接在多通道控制開關模塊6的各個開關上，由控制器9發(fā)送連接與斷開指令，實現(xiàn)各QCM傳感器4的采集與分析，各個QCM傳感器4放置在不同的細胞培養(yǎng)池3中，各個細胞培養(yǎng)池3放置于相同或不同的細胞培養(yǎng)箱2中。
[0035]QCM傳感器4為AT切型壓電石英晶體，其表面噴鍍兩個反對稱的“鑰匙孔”型的金膜電極，基頻在5?100MHz，或用3倍、5倍頻率，QCM的全稱是石英晶體微天平(QuartzCrystal Microbalance,QCM)。壓電傳感器是一種高靈敏的質量型化學傳感器,其研究始于1959年Sauerbrey的開創(chuàng)性工作，其基本原理就是傳感器的諧振頻率隨表面質量負載的增加而線性下降，由于這種傳感器對表面質量變化非常敏感，因此壓電傳感器又稱為石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance, QCM),在化學及生物傳感領域得到廣泛應用。
[0036]精密阻抗分析儀8與QCM傳感器4連接。
[0037]細胞培養(yǎng)箱2中填充有二氧化碳，二氧化碳濃度為4%-7%，所述培養(yǎng)箱的溫度為35-38°C，所述培養(yǎng)箱底部加有高純水5。
[0038]細胞培養(yǎng)池3中裝設有培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基高過壓電石英晶體的設置位置。
[0039]培養(yǎng)基為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中含有10%胎牛血清。
[0040]控制器9與多通道開關模塊6連接，驅動多通道開關模塊中各個開關的開、合。
[0041]電源7為精密阻抗分析儀8、控制器9和多通道開關模塊6提供電力。
[0042]本發(fā)明提供一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長過程的裝置與方法，包括如下步驟:
[0043]I)首先自行設計一個可連接壓電石英晶體多通道開關，此裝置包括:單片機、USB接口、交流電源插頭等。在PC機上設計VB程序，此程序包括:控制精密阻抗分析儀運行的程序和控制多通道開關輪流通斷的程序。此程序為一個整體程序，控制按鈕在同一個界面上，可靈活控制各個命令。
[0044]2)按照常規(guī)方法對壓電石英晶體進行處理清洗，備用。
[0045]在進行細胞傳代實驗前，先用pH = 7.3-7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS，
1.50-1.60g.IZ1Na2HPO4.Η20、0.15-0.25g.IZ1KH2PO4J.50-8.50g.IZ1NaCK
0.15-0.25g -L^1KCl0 )清洗培養(yǎng)瓶內待測貼壁細胞2_3次，洗去死細胞和未貼壁細胞。再用
0.20% -0.30%胰蛋白酶消化貼壁細胞，獲得懸浮細胞。懸浮細胞經(jīng)離心后，用RPM1-1640培養(yǎng)基(其中含有10%胎牛血清)重新分散，并用細胞計數(shù)板數(shù)出經(jīng)分散后待測細胞的個數(shù)。最后轉入一個新的培養(yǎng)瓶中。
[0046]3)細胞培養(yǎng)池在紫外燈光照下用體積分數(shù)75%的酒精浸泡消毒0.5-1小時，再用磷酸鹽緩沖液(同上)清洗3次。然后將RPM1-1640培養(yǎng)基加入該細胞培養(yǎng)池內，將各壓電石英晶體放入培養(yǎng)池內，再將整個細胞培養(yǎng)池放入培養(yǎng)箱中。
[0047]4)將多通道開關連接好，再打開PC機上相應的VB程序開始檢測，當測量基線達到穩(wěn)定后，將步驟3)中培養(yǎng)瓶內含相同數(shù)量待測細胞的培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)池中。開始監(jiān)測細胞貼壁和生長過程中的諧振頻率fo和動態(tài)電阻R1值的變化，監(jiān)測時間為12-36小時。
[0048]5)在整個監(jiān)測過程中，全部由計算機VB程序控制，不需人為干擾，分析數(shù)據(jù)以Txt格式存于計算機，方便處理。
[0049]6) —次實驗完成后，需及時清洗壓電石英晶體，除去上面的細胞，用0.20 % -0.30 %胰蛋白酶浸泡10-20小時，再滴加重鉻酸鉀洗液(20gK2Cr207+40mLH20+360mL濃H2SO4)洗滌，接著用高純水沖洗，反復清洗多次。
[0050]上述雖然結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。
【權利要求】
1.一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，其特征是:包括精密阻抗分析儀、多通道控制開關模塊、QCM傳感器陣列、細胞培養(yǎng)池陣列、細胞培養(yǎng)箱、控制器，其中，精密阻抗分析儀與多通道控制開關模塊相連，細胞培養(yǎng)池陣列中的QCM傳感器陣列的每個QCM傳感器分別接在多通道控制開關模塊的各個開關上，由控制器發(fā)送連接與斷開指令，實現(xiàn)各QCM傳感器的信息采集與分析，各個QCM傳感器放置在不同的細胞培養(yǎng)池中，各個細胞培養(yǎng)池放置于相同或不同的細胞培養(yǎng)箱中；所述控制器與多通道開關模塊連接，驅動多通道開關模塊中各個開關的開、合。
2.如權利要求1中所述的一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，其特征是:所述QCM傳感器為AT切型壓電石英晶體，其表面噴鍍兩個反對稱的“鑰匙孔”型的金膜電極，基頻在5?100MHz，或用3倍、5倍頻率；所述精密阻抗分析儀與QCM傳感器連接。
3.如權利要求1中所述的一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，其特征是:所述細胞培養(yǎng)箱中填充有二氧化碳，二氧化碳濃度為4% _7%，所述培養(yǎng)箱的溫度為35-38 0C，所述培養(yǎng)箱底部加有高純水。
4.如權利要求1中所述的一種多通道壓電監(jiān)測細胞生長動態(tài)過程的裝置，其特征是:所述細胞培養(yǎng)池中裝設有培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基高過壓電石英晶體的設置位置；所述培養(yǎng)基為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中含有10%胎牛血清。
5.一種基于如權利要求1-4中任一項所述的裝置的檢測方法，其特征是:包括以下步驟: (1)連接控制器、多通道開關模塊和精密阻抗分析儀； (2)清洗整個裝置，并制備懸浮細胞； (3)清洗培養(yǎng)池,加入培養(yǎng)基,將各壓電石英晶體放入培養(yǎng)池內，不加待測細胞； (4)培養(yǎng)池放入培養(yǎng)箱，將多通道開關與各壓電石英晶體連接，當測量基線達到穩(wěn)定后，同時將含相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)基加入各培養(yǎng)池中； (5)實時監(jiān)測細胞貼壁和生長過程中的QCM的諧振頻率和動態(tài)電阻隨時間的變化曲線，存儲分析數(shù)據(jù)； (6)清洗壓電石英晶體、培養(yǎng)池和培養(yǎng)箱。
6.如權利要求5中所述的檢測方法，其特征是:所述步驟(3)中，其具體方法為:在進行細胞傳代實驗前，先用PH = 7.3-7.5的磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)瓶內待測貼壁細胞2-3次，洗去死細胞和未貼壁細胞。再用0.20% -0.30%胰蛋白酶消化貼壁細胞，獲得懸浮細胞；懸浮細胞經(jīng)離心后，用RPM1-1640培養(yǎng)基重新分散，并用細胞計數(shù)板數(shù)出經(jīng)分散后待測細胞的個數(shù)，最后轉入一個新的培養(yǎng)瓶中。
7.如權利要求5中所述的檢測方法，其特征是:所述步驟(3)中:細胞培養(yǎng)池在紫外燈光照下用體積分數(shù)75%的酒精消毒0.5-1小時，再用磷酸鹽生理緩沖液清洗2-5次；然后加入培養(yǎng)基，將各壓電石英晶體放入培養(yǎng)池內，再將整個細胞培養(yǎng)池放入培養(yǎng)箱中。
8.如權利要求5中所述的檢測方法，其特征是:所述步驟(4)中，利用控制器控制多通道開關，當測量基線達到穩(wěn)定后，同時將含相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)基加入各培養(yǎng)池中，監(jiān)測細胞貼壁和生長過程中的&和R1值的變化，監(jiān)測時間為12-36小時。
9.如權利要求5中所述的檢測方法，其特征是:所述步驟(6)中，一次實驗完成后，需及時清洗壓電石英晶體，除去上面的細胞，用胰蛋白酶浸泡10-20小時，再滴加重鉻酸鉀洗液洗滌，接著用高純水沖洗，反復清洗多次。
10.如權利要求5中所述的檢測方法，其特征是:所述步驟(3)或步驟(4)中，所述磷酸鹽生理緩沖液的成分包括:1.50-1.60g.L-1Na2HPO4.Η20、0.15-0.25g.L^1KH2PO4,7.50-8.50g.L-1NaCl 和 0.15-0.25g.L-1KCl ； 所述重鉻酸鉀洗液的成分包括:20g K2Cr2O7,40mL H20、360mL濃H2S04。
【文檔編號】C12M1/34GK104232480SQ201410495310
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】康琪, 朱西雷, 孔令強, 申大忠 申請人:山東師范大學