一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制100mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分：CAS藍(lán)色檢測液3-8mL，1mmol/L的CaCl2溶液0.1-0.3mL，1mmol/L的MgSO4·7H2O溶液0.1-0.3mL，質(zhì)量濃度為8-12％的酸水解酪蛋白溶液4-8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，瓊脂粉1-3g。本發(fā)明還公開了該培養(yǎng)基的制備方法。采用本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠快速獲得同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的細(xì)菌菌株，縮短了篩選或檢測的時(shí)間，提高了篩選效率。
【專利說明】一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002]解磷細(xì)菌通過溶解土壤中難溶性或不溶性的磷素，為作物提高可吸收的磷素，提高土壤中磷的利用效率，促進(jìn)植物生長，是一類重要的植物促生細(xì)菌(PlantGrowth-Promoting Bacteria,簡稱 PGPB)。
[0003]嗜鐵細(xì)菌通過分泌嗜鐵素，與病原微生物爭奪有限的鐵營養(yǎng)，抑制病原微生物的生長繁殖，發(fā)揮生物防治的作用，同時(shí)時(shí)利用嗜鐵素螯合的鐵，改善植物鐵營養(yǎng)，防治植物缺鐵失綠癥，促進(jìn)植物生長。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，嗜鐵細(xì)菌或解磷細(xì)菌是使用不同的選擇性培養(yǎng)基分別進(jìn)行篩選的，對于具有解磷能力的細(xì)菌主要通過無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基和有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；對于具有嗜鐵能力的細(xì)菌主要通過CAS檢測平板進(jìn)行篩選。
[0005]但是，由于土壤中嗜鐵細(xì)菌或解磷細(xì)菌的數(shù)量本來就不多，如果一次性篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的菌株，成功的概率會更低，即使有些菌株同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力，其嗜鐵或解磷能力是分別檢測用于驗(yàn)證所篩選出的菌株是否具有其他的促生機(jī)制，并不是直接作為篩選條件來進(jìn)行的，但采用兩種不同的促生機(jī)制分別檢測或篩選，所需時(shí)間長，步驟繁雜，篩選效率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基能夠快速獲得具有嗜鐵和解磷能力的細(xì)菌菌株，縮短了篩選或檢測的時(shí)間，提高了篩選效率。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供該培養(yǎng)基的制備方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0009]—種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
[0010]CAS 藍(lán)色檢測液 3_8mL, Immol /I,的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL, Immol /I,的 MgSO4.7H20溶液0.1-0.3mL，質(zhì)量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，瓊脂粉 l_3g。
[0011]優(yōu)選的，該用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
[0012]CAS 藍(lán)色檢測液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.2mL，質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，瓊脂粉2g。
[0013]該用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，具體步驟如下:
[0014]將lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL、lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液 0.1-0.3mL、質(zhì)量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液4-8mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.3-0.8g，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用水定容至10mL,加入l_3g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50_60°C時(shí)，再加入3-8mL CAS藍(lán)色檢測液，混勻后倒平板，即得，并將該平板命名為:CAS_P檢測平板。
[0015]所述CAS藍(lán)色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S, CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL),為溶液 A;將 0.06g 的溴化十六燒基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
[0016]調(diào)節(jié)pH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
[0017]所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
[0018]所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15分鐘。
[0019]本發(fā)明的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，其中，CAS藍(lán)色檢測液用于檢測和顯示能夠在該培養(yǎng)基上生長的菌株的嗜鐵能力；磷酸三鈣用于檢測和顯示能夠在該培養(yǎng)基上生長的菌株的解磷能力。
[0020]本發(fā)明的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，顏色由藍(lán)色變?yōu)樽攸S色，能夠在此培養(yǎng)基上生長的菌株均同時(shí)具有嗜鐵和解磷的能力。
[0021]本發(fā)明的培養(yǎng)基在篩選嗜鐵解磷細(xì)菌中的應(yīng)用，具體應(yīng)用方法為:將自然風(fēng)干并去除植物根系或石頭等雜質(zhì)的土壤接種于滅菌水中，于30°C，150-200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，靜置后取上清液200 μ L接種于CAS-P檢測平板，于30°C條件下培養(yǎng)3_5天，觀察平板上菌落的生長。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023](I)縮短了篩選或檢測時(shí)間，將細(xì)菌的嗜鐵和解磷能力的篩選或檢測步驟合二為一，能夠一次性同時(shí)篩選和檢測細(xì)菌的嗜鐵和解磷能力，可在較短的時(shí)間內(nèi)篩選獲得同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的菌株，顯著提高嗜鐵解磷細(xì)菌的分離篩選效率，縮短了篩選或檢測時(shí)間。
[0024](2)培養(yǎng)基的制備方法簡單，可操作性強(qiáng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAS-P檢測平板；
[0026]圖2為CAS-P檢測平板初篩結(jié)果；
[0027]圖3為CAS檢測平板初篩結(jié)果；
[0028]圖4為細(xì)菌嗜鐵能力的檢測結(jié)果，圖中a為菌株在CAS檢測平板上產(chǎn)生的嗜鐵圈子；b為陰性對照，即無嗜鐵能力的菌株在CAS檢測平板上的生長情況；c為空白CAS檢測平板；
[0029]圖5為細(xì)囷解憐能力的檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面通過具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0031]實(shí)施例中所用到的的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]實(shí)施例1
[0033]—種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
[0034]CAS 藍(lán)色檢測液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.2mL，質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，瓊脂粉2g。
[0035]該培養(yǎng)基的制備方法為:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7Η20溶液、質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨(dú)滅菌)；再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10 %的酸水解酪蛋白溶液，向其中加入Ca3 (PO4) 20.5g,用生物緩沖液 1，4-哌嗪二乙橫酸[piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid)，Pipes]，調(diào)ρΗ6.8?7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。滅完菌后，當(dāng)溫度降低到60°C時(shí)，以5mL CAS藍(lán)色檢測液/每10mL培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板。注意不要產(chǎn)生氣泡，影響平板檢測實(shí)驗(yàn)。將該平板命名為CAS-P檢測平板。
[0036]CAS藍(lán)色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S，CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液A ;將0.06g 的溴化十六燒基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于 40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
[0037]實(shí)施例2
[0038]—種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
[0039]CAS 藍(lán)色檢測液 3mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.3mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.3mL，質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液8mL，Ca3(PO4)20.3g，瓊脂粉3g。
[0040]該培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1，不再贅述。
[0041]實(shí)施例3
[0042]—種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
[0043]CAS 藍(lán)色檢測液 8mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.lmL，質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液4mL，Ca3(PO4)20.8g，瓊脂粉lg。
[0044]該培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1，不再贅述。
[0045]性能實(shí)驗(yàn)
[0046]無機(jī)磷細(xì)菌固體培養(yǎng)基:葡萄糖10g, (NH4)2SO40.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g,MgSO4.7Η200.3g, Ca3 (PO4)21g, FeSO4.7Η20 0.03g, MnSO4.4Η20 0.03g，瓊脂粉 18 ?20g,定容至100mL, ρΗ7.0?7.5。分裝后121。。，15分鐘滅菌。
[0047]CAS檢測平板:I) CAS藍(lán)色檢測液的制作:將0.07g的鉻天青(Chrome azurol S,CAS)溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液(含有10mmol/L的HCL)，為溶液 A ;將 0.06g 的溴化十六燒基三甲銨(Hexadecyltrimethylammonium bromide, HDTMA)溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中，輕輕晃動，使得溶液A與溶液B混合均勻，即得到溶液C =CAS藍(lán)色檢測液。121°C，15分鐘滅菌。2)CAS檢測平板的制作:先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgSO4.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15分鐘單獨(dú)滅菌);再分別取0.2mL的CaCl2溶液、0.2mL的MgSO4.7H20溶液、6mL的10%的酸水解酪蛋白溶液，用生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸[piperazine-N, N~bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes],調(diào) ρΗ6.8 ?7.0。去離子水定容到100mL。加入2g瓊脂粉，121°C，15分鐘滅菌。當(dāng)以上的固體培養(yǎng)基滅完菌后，溫度降低到60°C時(shí)，以5mL CAS藍(lán)色檢測液/每10mL培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后倒平板。注意不要產(chǎn)生氣泡，以免影響平板檢測實(shí)驗(yàn)。
[0048]1.嗜鐵解磷細(xì)菌的初步篩選
[0049]采集作物根圍土壤，自然風(fēng)干后去除植物根系或石頭等雜質(zhì)，接種于滅菌水中，于30°C,150-200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，靜置后取上清液200 μ L接種于本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAS-P檢測平板上(圖1)，以接種于CAS檢測平板為對照，于30°C條件下培養(yǎng)3_5天，觀察平板上菌落的生長。
[0050]結(jié)果顯示:在CAS-P檢測平板上僅長出少數(shù)幾個細(xì)菌菌落，沒有明顯的暈圈(圖2);而CAS檢測平板上的菌落密集，有明顯的橘黃色暈圈(圖3)。說明用CAS檢測平板篩選獲得的具有嗜鐵能力的菌落相對較多，但功能單一；而通過CAS-P檢測平板篩選獲得的菌落數(shù)相對偏少，這是因?yàn)橥寥乐芯哂惺辱F能力或解磷能力的細(xì)菌本身并不是很多，篩選同時(shí)具有嗜鐵能力和解磷能力的細(xì)菌，其獲得的數(shù)量必定顯著少于篩選單獨(dú)具有嗜鐵或解磷能力的細(xì)菌所獲得的數(shù)量，因此，盡管在平板上生長的菌落無暈圈產(chǎn)生，但能在此CAS-P平板上生長的菌落均同時(shí)具有嗜鐵和解磷的能力。說明本發(fā)明的CAS-P檢測平板對于嗜鐵解磷細(xì)菌的篩選針對性強(qiáng)。
[0051]2.細(xì)菌嗜鐵能力的檢測
[0052]將CAS-P平板上長出的菌落接種于CAS檢測平板上，將無嗜鐵能力的菌株接種于CAS檢測平板上作為陰性對照，未接種菌種的CAS平板作為空白對照，30°C條件下培養(yǎng)3天，觀察菌落生長狀況及橘黃色暈圈的產(chǎn)生，并測定菌落和橘黃色暈圈的直徑。
[0053]結(jié)果顯示，橘黃色暈圈/菌落直徑比值為3.58 (圖4)，說明該菌株具有較強(qiáng)的嗜鐵能力。
[0054]3.細(xì)菌解磷能力的檢測
[0055]將CAS-P平板上長出的菌落同時(shí)接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)3天，觀察菌落生長狀況及解磷圈的產(chǎn)生，并測定菌落和解磷圈的直徑。
[0056]結(jié)果顯示，解磷圈/菌落直徑比值為2.92(圖5)，說明該菌株具有較強(qiáng)的解磷能力。
[0057]由此可見，采用本發(fā)明的CAS-P檢測平板可以快速篩選獲得同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力的菌株。
【權(quán)利要求】
1.一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，其特征在于，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
CAS 藍(lán)色檢測液 3-8mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL, lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液0.1-0.3mL，質(zhì)量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液4_8mL，Ca3(PO4)20.3-0.8g，瓊脂粉l-3g。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基，其特征在于，配制10mL該培養(yǎng)基的配方中含有下列組分:
CAS 藍(lán)色檢測液 5mL, lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.2mL, lmmol/L 的 MgSO4.7Η20 溶液 0.2mL,質(zhì)量濃度為10%的酸水解酪蛋白溶液6mL，Ca3(PO4)20.5g，瓊脂粉2g。
3.權(quán)利要求1或2所述的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，具體步驟如下:
將 lmmol/L 的 CaCl2 溶液 0.1-0.3mL、lmmol/L 的 MgSO4.7H20 溶液 0.1-0.3mL、質(zhì)量濃度為8-12%的酸水解酪蛋白溶液4-8mL混合均勻，向其中加入Ca3(PO4)20.3-0.8g，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0，用水定容至10mL,加入l_3g瓊脂粉，滅菌，滅菌后待溫度降至50_60°C時(shí)，再加入3-8mL CAS藍(lán)色檢測液，混勻后倒平板，即得。
4.如權(quán)利要求3所述的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述CAS藍(lán)色檢測液的制備方法為:將0.07g的鉻天青溶于50mL去離子水中，再加入1mL lmmol/L的FeCl3溶液，為溶液A ;將0.06g的溴化十六烷基三甲銨溶于40mL去離子水中，為溶液B ;將溶液A加入到B溶液中，混合均勻，即得到CAS藍(lán)色檢測液。
5.如權(quán)利要求3所述的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，調(diào)節(jié)pH所用的試劑為生物緩沖液1，4-哌嗪二乙磺酸。
6.如權(quán)利要求3所述的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述定容用的水為去離子水、純化水或蒸餾水。
7.如權(quán)利要求3所述的用于篩選同時(shí)具有嗜鐵和解磷能力細(xì)菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為15分鐘。
8.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基在篩選嗜鐵解磷細(xì)菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/04GK104357537SQ201410433007
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】余賢美, 艾呈祥, 王海榮, 安淼, 付麗, 劉嘉芬 申請人:山東省果樹研究所