微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，利用重組恥垢分枝桿菌單水相發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)去氫表雄酮，包括如下步驟：敲除原件5228up-kan-5228down的構建；重組菌株的構建；菌種繁殖及發(fā)酵轉(zhuǎn)化。本發(fā)明利用分子生物學方法敲除3β-羥基類固醇脫氫酶編碼基因MSMEG_5228，得到重組恥垢分枝桿菌，之后在單水相發(fā)酵體系中以植物甾醇為原料生產(chǎn)去氫表雄酮。本發(fā)明降低了生產(chǎn)成本，去氫表雄酮質(zhì)量收率達90％以上，同時簡化了提取工藝，降低了提取成本，污染小、環(huán)保壓力小、極具工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)勢。
【專利說明】微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及留體類藥物中間體的生產(chǎn)方法，特別是利用重組恥垢分枝桿菌的微生 物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法。

【背景技術】
[0002] 去氫表雄酮（dehyroepiandrosterone，DHEA)是一種C19類固醇載體化合物，化學 名稱為3 β -羥基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C19H2802，結(jié)構式為：
[0003]

【權利要求】
1. 一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：利用重組恥垢分枝桿菌單水 相發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物留醇生產(chǎn)去氫表雄酮，包括如下步驟： 第一步，敲除原件5228up-kan_5228down的構建； 第二步，重組菌株的構建； 第三步，菌種繁殖及發(fā)酵轉(zhuǎn)化。
2. 根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：第一步 中： 首先，通過PCR技術獲得來源于恥垢分枝桿菌mc2155帶有酶切位點EcoRI及Hindlll 的MSMEG_5228全基因片段；以帶有EcoRI及Hindlll的MSMEG_5228全基因片段為模板， PCR擴增出帶有EcoRI及Acc65I位點的MSMEG_5228上游片段；將其連接于克隆載體pUC18 上構建質(zhì)粒pUC-5228up ; 其次，以恥垢分枝桿菌表達載體PMV261作為模板，通過PCR技術獲得帶有Acc65I及 Xbal位點的kan基因片段，將其連接于pUC-5228up構建質(zhì)粒pUC-5228up-kan ; 接著，以帶有EcoRI及Hindlll的MSMEG_5228全基因片段為模板，PCR擴增出帶 有Xbal及Hindlll位點的MSMEG_5228下游片段，將其連接于pUC-5228up-kan構建 pUC-5228up-kan-5228down ； 最后，通過PCR技術獲得大量敲除原件5228up-kan-5228down。
3. 根據(jù)權利要求2所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：所述 MSMEG_5228上游片段全長540bp，MSMEG_5228下游片段全長575bp。
4. 根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：第二步中， 先制備恥垢分枝桿菌感受態(tài)細胞，再將第一步獲得的敲除原件5228up-kan-5228down電轉(zhuǎn) 入到恥垢分枝桿菌感受態(tài)細胞中。
5. 根據(jù)權利要求4所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于： 恥垢分枝桿菌感受態(tài)細胞的制備方法為： 將濃度1〇7_1〇9個/ml的恥垢分枝桿菌以10 %的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，LB液 體培養(yǎng)基中含有重量百分比0. 05%的吐溫80,在30°C下培養(yǎng)至0D6QQ = 0. 4-0. 5時，添加終 濃度為1 %的甘氨酸繼續(xù)培養(yǎng)，當〇D6(?達到0. 8-1. 0時開始制備感受態(tài)； 首先，將菌懸液以ll〇〇〇g、4°C離心20min后，棄去上層清液；接著，以培養(yǎng)基體積1/6 量添加含有重量百分比0.05%吐溫80的甘油吐溫溶液重懸菌體，甘油溶液的質(zhì)量百分比 為10%，400(^、41：離心101^11，離心完畢后棄去上層清液 ；以上述方法再次洗菌2次，使用 的甘油吐溫溶液體積分別為培養(yǎng)基體積的1/15及1/30 ;最后，以2mL、重量百分比10%的 甘油重懸菌體，分裝于50μ 1/1. 5mLEP管內(nèi)-70°C保藏備用。
6. 根據(jù)權利要求1所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：第三步中， 先在種子培養(yǎng)基中進行菌種繁殖，待種子培養(yǎng)基〇D 6(15時，以30-50%的接種量將其接 入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基和植物留醇的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化。
7. 根據(jù)權利要求6所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：第三步中 發(fā)酵轉(zhuǎn)化的條件為：溫度29-31°C、罐壓0. 05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速150-200rpm、培養(yǎng)周期4-5day。
8. 根據(jù)權利要求6所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：所述 種子培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖 8-15g/L、Κ2ΗΡ040· 3-0. 8g/L、MgS04 · 7Η200· 3-0. 8g/L、 (NH4)2Fe(S04)2 · 6Η200· 02-0. 06g/L、CaC034. 5-5. 5g/L 和檸檬酸 1· 0-3. Og/L，所述種子培養(yǎng) 基的 pH 為 6. 0-8.0。
9. 根據(jù)權利要求6所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)去氫表雄酮的方法，其特征在于：所述發(fā)酵 培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖15_30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆餅粉10-25g/L，K 2HP040 . 5-1. 0g/ L，MgS04 · 7Η200· 5-1. Og/L，（NH4)2Fe(S04)2 · 6Η200· 02-0. 06g/L，CaC034. 5-5 . 5g/L，檸檬酸 1. 0-3. Og/L 和 NH4N030. 5-1. 5g/L，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 為 6. 0-8. 0。
10. 根據(jù)權利要求6所述的微生物發(fā)酵生產(chǎn)9 α -羥基雄烯二酮的方法，其特征在于： 植物甾醇與發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比為1-2. 5%。
【文檔編號】C12N15/66GK104232673SQ201410414313
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月21日 優(yōu)先權日:2014年8月21日
【發(fā)明者】宋浩雷, 劉倩, 孟祥雷, 張亞朋 申請人:宋浩雷