歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因v1ap17及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明中公開了一種歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因V1AP17及其應(yīng)用。所公開的基因完整開放閱讀框序列全長1074bp，編碼358個氨基酸。發(fā)明人構(gòu)建了pCAMBIA2300-35S-V1AP17過量表達載體，通過花絮浸染法將其導(dǎo)入模式植物擬南芥。在擬南芥中過量表達V1AP17明顯提高了擬南芥對于滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。所公開的應(yīng)用是基因V1AP17用于提高植株的抗鹽脅迫能力和干旱脅迫能力的應(yīng)用。
【專利說明】歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 VIAP17及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物抗逆基因鑒定及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一個歐美雜交葡萄 品種巨峰抗逆基因 V1AP17。

【背景技術(shù)】
[0002] 天冬氨酸蛋白酶（APs)廣泛分布于植物，動物，微生物及病毒中。根據(jù)它們的氨基 酸序列同源性共分為14個不同的家族，根據(jù)它們的進化關(guān)系和三維結(jié)構(gòu)又可分為6個不同 的分支。植物天冬氨酸蛋白酶分布于AA分支的Al, A3, All和A12以及AD分支的A22家 族。大多數(shù)植物天冬氨酸蛋白酶與來源不同的類胃蛋白酶共同屬于Al家族。與Al家族的 其他成員相似，植物天冬氨酸蛋白酶在酸性PH條件下具有活性，受胃蛋白酶抑制劑的特異 抑制，有兩個具有催化活性的天冬氨酸殘基。
[0003] 目前已從多種植物中檢測并純化出天冬氨酸蛋白酶。然而，它們的生物學(xué)功能并 沒有像哺乳動物、微生物或病毒中的天冬氨酸蛋白酶那樣得到很好的表征，在這些物種中 天冬氨酸蛋白酶執(zhí)行多種不同的功能，包括特異的蛋白加工（如：高血壓蛋白原酶），蛋白 質(zhì)降解（如：胃酶如凝乳酶，胃蛋白酶和胃亞蛋白酶）或病毒多聚蛋白加工（人體免疫病 毒AP)。關(guān)于植物天冬氨酸蛋白酶功能的了解來自于假設(shè)的蛋白質(zhì)底物的共定位研究、特定 組織或特異條件下的這些底物在離體條件或特異表達下的加工或降解的實驗證據(jù)?？偟膩?說，植物APs參與不同植物器官的蛋白質(zhì)加工或降解，以及植物衰老，逆境響應(yīng)，程序性細 胞死亡和再生。
[0004] 在自然生長環(huán)境中，植物經(jīng)常暴露于復(fù)雜多變的生物與非生物脅迫中。為了改善 植物對脅迫和疾病的抵抗能力，研究各種脅迫途徑中抗逆基因的功能是很重要的。但現(xiàn)有 的關(guān)于AP基因在抗逆方面的研究還很少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供一個歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因V1AP17,并證明了 該基因在抗逆方面的功能。
[0006] 為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案：
[0007] -種歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17,其特征在于，該歐美雜交葡萄巨峰 抗逆基因 VlAP 17的編碼區(qū)序列如SED ID NO: 1所示。
[0008] 本發(fā)明首次構(gòu)建了 PCAMBIA2300-35S-V1AP17過量表達載體，并通過花絮浸染法 將其導(dǎo)入模式植物擬南芥。研究了歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17過量表達的轉(zhuǎn) 基因株系和野生對照在滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫處理下的生長情況。
[0009] 本發(fā)明的歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17能明顯提高擬南芥對于滲透脅 迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。
[0010] 在脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系中的活性氧（ROS)的積累也是明顯少于野生對照，而 活性氧清除劑SOD，CAT，POD的酶活性顯著高于野生型對照。在含有氯化鈉（NaCl)和甘露 醇（Mannitol)的培養(yǎng)基上，具有歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的株系萌發(fā)率顯 著高于野生對照，根長也明顯長于對照。以上結(jié)果都表明歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17在擬南芥中的過量表達提高了植株的抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是氯化鈉和甘露醇引起的滲透脅迫對野生對照（WT)和轉(zhuǎn)基因株系 V1AP17-15(L1)，V1AP17-33(L2)和 V1AP17-43(L3)萌發(fā)的影響。其中，A 圖是在 MS 培養(yǎng)基 上的圖片，B圖是在MS培養(yǎng)基+130mM的NaCl上的圖片，C圖是在MS培養(yǎng)基+200mM甘露醇 (Mannitol)上的圖片，圖D是野生對照WT、轉(zhuǎn)基因株系LI, L2, L3在MS培養(yǎng)基，含有130mM 氯化鈉和200mM甘露醇的滲透培養(yǎng)基上的萌發(fā)率，*表示與野生對照相比有顯著差異，** 表示與野生對照相比有極顯著差異（*〇. 〇1〈Ρ〈〇. 05, **P〈0. 01)。
[0012] 圖2是氯化鈉和甘露醇引起的滲透脅迫對野生對照WT、轉(zhuǎn)基因株系L1，L2，L3根系 發(fā)育的影響。A圖是將苗齡5天的野生對照WT、V1AP7轉(zhuǎn)基因株系LI, L2, L3分別移栽到在 MS培養(yǎng)基，含有130mM氯化鈉和200mM甘露醇的滲透培養(yǎng)基上生長一周后的根系生長圖。B 圖是野生型對照和轉(zhuǎn)基因株系在不同培養(yǎng)基上的根長。C圖是野生型對照和轉(zhuǎn)基因株系在 不同培養(yǎng)基上的側(cè)根數(shù)量，*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示與野生對照相比有 極顯著差異（*〇· 〇1〈Ρ〈〇· 05, #Ρ〈0· 01)。
[0013] 圖3是氯化鈉和甘露醇引起的滲透脅迫對野生對照WT、V1AP17轉(zhuǎn)基因株系 LI, L2, L3中葉綠素含量，電導(dǎo)率，丙二醛（MDA)含量，內(nèi)源ABA含量的影響。將苗齡7天的 無菌苗從萌發(fā)培養(yǎng)基中分別移栽到在MS培養(yǎng)基，含有130mM氯化鈉和200mM甘露醇的滲透 培養(yǎng)基上生長一周后測定葉片中的葉綠素含量（A圖），電導(dǎo)率（B圖），MDA含量（C圖）和 內(nèi)源ABA含量（D圖）。*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示與野生對照相比有極顯 著差異（*〇· 〇1〈Ρ〈〇· 05, **Ρ〈0· 01)。
[0014] 圖 4 是野生對照，轉(zhuǎn)基因株系 V1AP17-15 (LI)，V1AP17-33 (L2)和 V1AP17-43 (L3) 的盆栽苗對鹽脅迫和干旱脅迫的反應(yīng)。A圖為脅迫處理一周后的植株代表圖，a圖為對照，b 圖為200mM氯化鈉處理后的植株生長情況，c圖為干旱脅迫一周后的植株生長情況，d圖為 干旱脅迫一周后復(fù)水24小時后的植株生長情況。B圖是干旱脅迫一周后復(fù)水24后野生對 照和轉(zhuǎn)基因株系的復(fù)活率，*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示與野生對照相比有 極顯著差異（*〇. 〇1〈Ρ〈〇. 05, **P〈0. 01)。C圖是將正常生長條件下的苗齡3周的野生對照 和轉(zhuǎn)基因株系的葉片從植株上采集下來放于自然環(huán)境中進行失水處理。每隔15分鐘稱量 一次鮮重，失水率通過與初始鮮重之間的差值與初始鮮重之間的比值進行計算。D圖是用 臺盼蘭對鹽脅迫和干旱脅迫一周后的野生對照和轉(zhuǎn)基因株系中的死細胞進行染色的情況。
[0015] 圖 5 是野生對照，轉(zhuǎn)基因株系 V1AP17-15(L1), V1AP17-33(L2)和 V1AP17-43(L3) 盆栽苗在鹽脅迫和干旱脅迫條件下活性氧積累及活性氧清除劑的活性分析。A圖是用NBT 對超氧化物的陰離子（〇2_)進行染色后的葉片代表圖。B圖是用DAB對過氧化氫（H2O 2)進 行染色后的葉片代表圖。C圖是超氧化物歧化酶（SOD)的酶活性，D圖是過氧化氫酶（CAT) 的酶活性，E圖是過氧化物酶（POD)的酶活性，*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示 與野生對照相比有極顯著差異（*〇. 〇1〈Ρ〈〇. 05, **P〈0. 01)。
[0016] 圖6是正常生長條件下的野生對照和轉(zhuǎn)基因株系V1AP17-15(L1)，V1AP17-33(L2) 和V1AP17-43(L3)盆栽苗的葉片在不同濃度的外源ABA處理后的氣孔開張情況。A圖是外 源ABA處理后的氣孔張開情況代表圖。B圖是外源ABA處理后野生對照和轉(zhuǎn)基因株系葉片 上氣孔開度的平均值，*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示與野生對照相比有極顯 著差異（*〇· 〇1〈Ρ〈〇· 05, **Ρ〈0· 01)。
[0017] 圖7是脅迫相關(guān)基因在野生對照和轉(zhuǎn)基因株系V1AP17-15 (LI)，V1AP17-33 (L2)和 V1AP17-43(L3)中的表達情況。A圖是用200mM氯化鈉處理苗齡四周的成苗一周，采集葉片 提RNA并反轉(zhuǎn)錄后利用實時定量PCR技術(shù)測定脅迫基因表達量。B圖是對苗齡四周的野生 對照和轉(zhuǎn)基因株系成苗進行干旱處理一周，采集葉片提RNA并反轉(zhuǎn)錄后利用實時定量PCR 技術(shù)測定脅迫基因表達量。*表示與野生對照相比有顯著差異，**表示與野生對照相比有 極顯著差異（*〇· 〇1〈Ρ〈〇· 05, **Ρ〈0· 01)。
[0018] 以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

【具體實施方式】
[0019] 在自然生長環(huán)境中，植物經(jīng)常暴露于復(fù)雜多變的生物與非生物脅迫中。為了改 善植物對脅迫和疾病的抵抗能力，研究各種脅迫途徑中抗逆基因的功能是很重要的。但現(xiàn) 有的關(guān)于AP基因在抗逆方面的研究還很少。因此，在本申請中，發(fā)明人通過分析葡萄中AP 基因家族成員對各種生物和非生物脅迫以及激素處理的反應(yīng)篩選出響應(yīng)干旱和鹽脅迫的 ΑΡ17基因。
[0020] 迄今為止，關(guān)于AP基因在脅迫中發(fā)揮作用的研究還很少。但也有研究表明，在擬 南芥中，ASPGl基因（定位在保衛(wèi)細胞中的一個天冬氨酸蛋白酶基因）可以通過ABA信號 途徑使植物抵御干旱脅迫。此外，也有研究表明當大麥遭受不同的非生物脅迫時，其葉片中 的FeAP9基因上調(diào)表達。在本申請中，發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)C組的葡萄AP基因可能在抵抗非生物 脅迫方面起到了關(guān)鍵作用，如V1AP13, V1AP17, V1AP25, V1AP28, V1AP39,和V1AP44基因在巨 峰葡萄受到鹽或干旱脅迫后，表達量上調(diào)；此外，對巨峰葡萄進行外源ABA處理結(jié)果顯示， 處于C組中V1AP8, V1AP17, V1A25的基因表達量也明顯上調(diào)。
[0021] 植物根系的形成與植物的抗旱和抗鹽性密切相關(guān)，在130mM NaCl或200mM甘露醇 處理時，過量表達V1AP17可以增加擬南芥的根長及側(cè)根數(shù)，這將有利于植株吸收更多的水 分，提高植株的抗鹽，抗旱性。細胞膜具有選擇透過性，這是植物維持正常生理功能的重要 條件之一。它可以阻止不需要或?qū)毎泻Φ奈镔|(zhì)進入細胞，是植物的一種自我保護。但 當植物長期處于逆境時，細胞膜的選擇透性降低甚至消失，細胞內(nèi)物質(zhì)就會大量外滲，從而 引起植株電導(dǎo)率的變化。可以通過這種變化來了解植株細胞膜的受傷害程度進而說明所測 植株的抗逆性強弱。在本申請中，發(fā)明人對130mM NaCl或200mM甘露醇處理一周后的植株 測定電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，野生植株的電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因株系，說明在脅迫條件下，V1AP17基因 的轉(zhuǎn)入改善了擬南芥植株的抗逆性。另外，干旱脅迫和鹽脅迫往往伴隨著丙二醛的積累，而 丙二醛的積累會對細胞膜造成損傷并導(dǎo)致細胞死亡。本申請中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在受到鹽和甘 露醇脅迫后，V1AP17轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中的丙二醛含量明顯低于野生型。
[0022] 活性氧是一類具有比氧分子活潑的氧的某些衍生物，如過氧化氫（H2O2)、超氧化物 的陰離子（〇 2_)和羥基（-0H)等。正常條件下，植物細胞中的活性氧（ROS)并不會對植物產(chǎn) 生嚴重的傷害，但是髙鹽和干旱脅迫條件下，活性氧平衡被打破，植物細胞產(chǎn)生過量的ROS 而無法被及時清除，造成了嚴重氧化傷害，進而影響到了植物正常的生理代謝。所以及時清 除過量的ROS，維持植物體內(nèi)氧平衡，對于改善植物抗逆性具有重要的作用。最近的研究已 經(jīng)表明，擬南芥保衛(wèi)細胞中的一個天冬氨酸蛋白酶基因 ASPGl的過量表達能增強干旱脅迫 下葉片中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性。本申請中，發(fā)明人對干旱和鹽脅迫下的 擬南芥植株進行了活性氧清除劑的酶活性分析，結(jié)果表明在非生物脅迫下，V1AP17轉(zhuǎn)基因 植株中的超氧化物歧化酶（SOD)，過氧化氫酶（CAT)和過氧化物酶（POD)的活性均顯著提 高，同時，H 2O2和(V的積累明顯減少。
[0023] 發(fā)明人利用同源克隆技術(shù)，根據(jù)歐洲葡萄黑比諾基因組序列采用反轉(zhuǎn)錄 PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR),以歐美雜交葡萄 巨峰葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，擴增了歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17,該基因完整開放閱讀框序列全長1074bp，編碼357個氨基酸。
[0024] 分析表明該基因包括一個高度保守的ASP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含兩個DTG活性位 點和一個膜定位信號。
[0025] 為了一步研究歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17在植物抵御干旱脅迫和鹽 脅迫中的具體功能，發(fā)明人構(gòu)建了 PCAMBIA2300-35S-V1AP17 (酶切位點為XbaI和KpnI)過 量表達載體，將其在野生擬南芥植株中過量表達。發(fā)現(xiàn)具有歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基 因 V1AP17的株系在滲透脅迫培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率顯著高于野生對照，而且經(jīng)過長期培 養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)具有歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的植株可以在滲透培養(yǎng)基上長出 強壯根系，健康的子葉和真葉，而野生對照在種子萌發(fā)后，子葉和根系無法正常生長直至 植株枯黃變褐死亡。
[0026] 在研究中，發(fā)明人對幼苗轉(zhuǎn)基因植株和野生對照進行了鹽脅迫和甘露醇滲透脅迫 處理，并測定了植株中的葉綠素含量，電導(dǎo)率，丙二醛含量及內(nèi)源ABA含量。結(jié)果表明在滲 透脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株中的葉綠素含量及內(nèi)源ABA含量均比野生對照中的較高，而丙 二醛含量和電導(dǎo)率均比野生對照低。此外，發(fā)明人還對成苗轉(zhuǎn)基因植株進行了鹽脅迫和干 旱處理并利用化學(xué)染色的方法分別檢測了在鹽脅迫和干旱脅迫處理后葉片或植株中超氧 陰離子自由基（〇 2__)和過氧化氫（H2O2)的水平并分析了其中的活性氧清除劑超氧化物歧化 酶（SOD)，過氧化氫酶（CAT)和過氧化物酶（POD)的酶活性。結(jié)果表明在脅迫處理后，與野 生對照相比轉(zhuǎn)基因株系中活性氧積累較少，受的氧化脅迫也較小，同時三種活性氧清除劑 的酶活性較高。說明歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的過量表達可能參與了 ROS 的清除過程從而增強了植株的抗脅迫能力。
[0027] 以下是歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的編碼區(qū)序列以及抗鹽脅迫和干 旱脅迫功能實驗驗證的具體步驟。
[0028] A、在前期研究分析歐美雜交葡萄品種巨峰中30個AP家族基因在不同脅迫處理及 激素處理后的表達的基礎(chǔ)上，利用同源克隆技術(shù)，以歐美雜交葡萄品種巨峰葉片總RNA反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板，擴增得到了歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17序列，該 歐美雜交葡萄巨峰抗逆基因 V1AP17的編碼區(qū)序列如下：
[0029] I ATGGCGGCTC GATTTCTGGT TGCGATGCCG GTGGTGGTTC TCTTGATTGA GAGTTGTATG 61 GCGGCGATGT TTTCTGCTAG GCTCATTCAC CGGTTCTCCG ATGAGGTGAA GGCGTTCAGG 121 GCGGCGAGGA GCGGGGTGTC TGGGTCGTGG CCGGAGTGGA GGACTATGGA GTACTACAAA
[0030] 181 ATGCTGGTGA GGAGTGATTT GGAGAGGCAG MGGTGATGC TCGGGTCCAA GTATCAGTTT 241 CTGTTCCCGT CCGAGGGGAG CAAAACGATG TCGTTCGGTA ACGACTATGG ATGGTTGCAT 301 TATACTTGGA TTGATATAGG GACACCCAAT ATTTCTTTTC TTGTTGCATT GGATGCTGGG 361 AGTGATCTAC TATGGATTCC GTGTGATTGC ATACAATGCG CTCCCTTATC CGCCAGCTAT 421 TATGGTAGTC TGGATAGAGA TCTAAATCAG TACAGTCCAT CTGGTTCAAG CACCAGCAAG 481 CACCTATCTT GTAGCCATCA GTTATGTGAA TCAAGTCCTA ACTGTGATAG TCCTAAGCAG 541 CTATGCCCTT ACACTATMA CTACTACTCT GAAAATACAT CAAGCTCTGG GTTGCTGATT 601 GAGGACATCC TACATCTTAC ATCAGGCATT GATGATGCAT CTAACTCCTC TGTGCGGGCC 661 CCAGTCATCA TAGGATGTGG TATGAGGCAA ACTGGCGGTT ACTTGGATGG AGTTGCTCCT 721 GATGGTCTTA TGGGTTTGGG GCTTGGAGAA ATTTCAGTTC CAAGTTTTCT TTCAAAAGCA 781 GGACTGGTAA AGMCTCTTT CTCATTGTGT TTTAATGATG ATGATTCTGG GAGAATCTTT 841 TTTGGGGACC MGGACTAGC TACTCAACAA ACTACTCTCT TCTTGCCTTC AGATGGAAAA 901 TATGAMCCT ACATAGTTGG AGTAGAGGCA TGCTGTATTG GGAGTTCTTG TATTAAACAA 961 ACAAGCTTCA GAGCACTGGT TGACAGTGGG GCATCATTTA CATTTCTTCC AGATGAATCA 1021 TATAGMATG CTGTTGATGA GGTGTTGTTA TTTTCCATTA ATCTCTATAT ATAA
[0031] B、將歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17序列的完整開放閱讀框插入 CaMV35S啟動子下游，構(gòu)建了植株過量表達載體并將其通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法將其 導(dǎo)入野生型擬南芥哥倫比亞C0。篩選獲得了表現(xiàn)型良好的V1AP17轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)。
[0032] C、參見圖1-7,發(fā)明人鑒定了 V1AP17轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)能明顯提高擬南芥 對于滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。此外，在脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系 中的活性氧（ROS)的積累也是明顯少于野生對照，而其中的活性氧清除劑（SOD，CAT，P0D) 的酶活性顯著高于野生對照。在MS培養(yǎng)基中添加氯化鈉（NaCl)和甘露醇（Mannitol)， V1AP17轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的萌發(fā)率顯著高于野生對照。在氯化鈉（NaCl)和甘露醇 (Mannitol)脅迫培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系的根長明顯長于對照，側(cè)根數(shù)明顯多于對照。
[0033] 以上結(jié)果都表明歐美雜交葡萄巨峰抗逆基因 V1AP17在擬南芥中的過量表達提高 了植株的抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力。
[0034] 以下是發(fā)明人給出的具體實施例，以對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步解釋說明。
[0035] 實施例1 :過量表達的轉(zhuǎn)基因株系和野生對照在滲透脅迫情況下的萌發(fā)
[0036] 三個轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3)和野生對照（WT)在MS培養(yǎng)基上2d時開始萌發(fā)，4d 后萌芽率都能達到96%以上。而在含有氯化鈉和甘露醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)IOd后，氯化鈉培 養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的萌發(fā)率分別達到了 69. 15%、62. 79%、81.93%，而野生 對照（WT)的萌發(fā)率只有4. 39%，明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。在含有甘露醇的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因 株系（L1，L2，L3)的萌發(fā)率分別達到了 42. 95%，45. 58%，72. 18%，而野生對照（WT)的萌發(fā) 率只有11.76% (圖1)。
[0037] 實施例2 :歐美雜交葡萄巨峰抗逆基因 V1AP17轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代幼苗對滲透脅 迫的抗性
[0038] 為了進一步測定V1AP17轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3)的抗脅迫能力，發(fā)明人將播種在 萌芽培養(yǎng)基中的5天苗齡的幼苗分別移栽到在MS培養(yǎng)基，含有130mM氯化鈉和200mM甘露 醇的滲透培養(yǎng)基上觀察其根系發(fā)育情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系和野生對照在MS培養(yǎng)基 上根系可以正常生長，而在鹽脅迫和甘露醇脅迫培養(yǎng)基中，所有植株的根系生長都比較緩 慢。一周后觀察所有植株的根系生長情況，發(fā)現(xiàn)野生對照在鹽脅迫和甘露醇脅迫培養(yǎng)基上 根系較短，生長矮小，幼苗枯黃，而轉(zhuǎn)基因株系雖然比MS培養(yǎng)基上的苗子生長緩慢，但根系 強壯，基本可以正常生長（圖2A)。鹽脅迫和甘露醇脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的根長比野生 型較長，側(cè)根數(shù)量也比野生型較多（圖2B，C)。表明歐美雜交葡萄巨峰抗逆基因 V1AP17的 過量表達抵消了部分鹽脅迫和甘露醇脅迫對植株根系生長的抑制作用。
[0039] 為了進一步測定V1AP17轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3)對水分脅迫的響應(yīng)，發(fā)明人將播 種在萌芽培養(yǎng)基中的7天苗齡的幼苗分別移栽到在MS培養(yǎng)基，含有130mM氯化鈉和200mM 甘露醇的滲透培養(yǎng)基上進行滲透脅迫處理并測定了處理一周后的葉綠素含量，電導(dǎo)率，丙 二醛（MDA)含量和內(nèi)源ABA含量。結(jié)果表明三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)在氯化鈉脅迫 后的葉綠素含量分別為〇.39、0.39、0.32mg/g鮮重，而野生對照（WT)的葉綠素含量則為 0. 20mg/g鮮重。甘露醇處理后，三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的葉綠素含量分別為0.40、 0· 35、0· 37mg/g鮮重，而野生對照（WT)則為0· 19mg/g鮮重（圖3A)。氯化鈉脅迫后三個轉(zhuǎn) 基因株系（LI, L2，L3)的電導(dǎo)率分別為37. 18%、39. 15%、36. 07%，而野生對照（WT)的電 導(dǎo)率達到了 62. 44%。甘露醇脅迫后三個轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3)的電導(dǎo)率分別為25. 88%、 26. 79%、27. 16%，而野生對照（WT)的電導(dǎo)率達到了 33. 75% (圖3B)。氯化鈉脅迫后三個 轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)中的丙二醛（MDA)含量分別為23. 34、20. 51、19. 51nmol/g鮮重， 而野生對照（WT)中的丙二醛含量則為35. 61nmol/g鮮重。甘露醇脅迫后三個轉(zhuǎn)基因株系 (L1，L2，L3)中的丙二醛含量分別為20. 91、16. 86、18. 84nmol/g鮮重，而野生對照（WT)中 的丙二醛含量則為26. 51nmol/g鮮重（圖3C)。這些結(jié)果表明在鹽脅迫和甘露醇脅迫過程 中，轉(zhuǎn)基因株系受到的滲透傷害顯著低于對照，過量表達的歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基 因 V1AP17提高了植株對滲透脅迫的耐受力。氯化鈉脅迫后三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)中 的內(nèi)源ABA含量分別為83. 72、72. 44、80. 99ng/g鮮重，而野生對照（WT)中的內(nèi)源ABA含量 為69.06ng/g鮮重。甘露醇脅迫后三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)中的內(nèi)源ABA含量分別為 71.14、89.41、94.51叩/^鮮重，而野生對照（訂）中的內(nèi)源484含量為59.181^/^鮮重（圖 3D)。
[0040] 這些結(jié)果都表明歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17在擬南芥中的過量表 達明顯提高了幼苗對滲透脅迫的抗性。
[0041] 實施例3 :歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株對鹽 脅迫和干旱脅迫的抗性
[0042] 在前面的研究中已經(jīng)證明歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17對鹽脅迫和甘 露醇脅迫處理都有積極的響應(yīng)。所以發(fā)明人著重研究了擬南芥成年植株對各種脅迫的反 應(yīng)。
[0043] 為了避免外界和人為因素的影響，發(fā)明人將轉(zhuǎn)基因植株 [V1AP17-15(L1)，V1AP17-33(L2)和V1AP17-43(L3)]和野生對照種植于同一穴盤中。對生 長四周的成苗植株進行鹽脅迫和干旱脅迫處理，結(jié)果顯示鹽脅迫處理一周后，轉(zhuǎn)基因植株 (L1，L2，L3)和野生對照（WT)出現(xiàn)了明顯不同的性狀表現(xiàn)。未轉(zhuǎn)基因的野生植株都出現(xiàn) 了較為嚴重的枯黃和皺縮現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)雖然也出現(xiàn)了不同程度的黃斑， 但生長狀態(tài)明顯好于對照（圖4A-b)。干旱脅迫處理一周后，野生對照（WT)和轉(zhuǎn)基因株 系（L1，L2，L3)均出現(xiàn)葉片萎蔫及失水現(xiàn)象，但是轉(zhuǎn)基因株系的萎蔫癥狀較輕（圖4A-c)， 對干旱脅迫一周后的植株進行復(fù)水處理，24小時后發(fā)現(xiàn)三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的 成活率分別為69. 44%，79. 12% ,72.22%，而野生對照（WT)的成活率僅為1.85% (圖 4A-d，圖4B)。此外，發(fā)明人還對正常生長條件下的4周苗齡的野生對照（WT)和轉(zhuǎn)基因株 系（L1，L2，L3)進行了失水處理。結(jié)果顯示在整個失水處理過程中，轉(zhuǎn)基因株系失水率都 低于野生對照。在150min時，轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的失水率分別為27. 31%、25. 96%、 22. 15%，而野生對照（WT)失水率達到了 30. 84%，明顯髙于轉(zhuǎn)基因植株（圖4C)。由于轉(zhuǎn)基 因株系（L1，L2，L3)的失水率比野生對照（WT)較低，發(fā)明人比較了外源ABA處理后轉(zhuǎn)基因 株系（L1，L2，L3)和野生對照（WT)葉片上氣孔的開度。結(jié)果表明當外源ABA濃度為10 μ M 時，三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)的氣孔開度均比野生對照（WT)低（圖6)。為了進一步驗 證歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17在提高擬南芥抗非生物脅迫方面的作用，發(fā)明 人還對鹽脅迫和干旱脅迫后的轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)和野生對照（WT)葉片進行了臺盼蘭 染色，以觀察死細胞數(shù)量。結(jié)果顯示脅迫處理后，野生對照（WT)中的死細胞數(shù)量明顯多于 轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3)(圖4D)。
[0044] 這些結(jié)果都表明歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17在擬南芥中的過量表達 明顯提高了成年植株對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性。
[0045] 實施例4 :V1AP17轉(zhuǎn)基因擬南芥在非生物脅迫下活性氧的產(chǎn)生和活性氧清除劑的 活性分析
[0046] 植物細胞長期處于逆境脅迫時，活性氧就會大量積累造成氧化傷害，導(dǎo)致細胞損 傷甚至死亡。為了驗證歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17對于氧化脅迫的作用，發(fā)明 人利用化學(xué)染色的方法分別檢測了在鹽脅迫和干旱脅迫處理后葉片中超氧陰離子自由基 (〇 2__)和過氧化氫（H2O2)的水平。由圖可以明顯的看出在各種非生物脅迫下，用氯化硝基四 氮唑藍液（NBT)和二氨基聯(lián)苯胺（DAB)染色后各個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)都呈現(xiàn)出較淺 的顏色，而野生對照染色較重（圖5A，B)。表明在脅迫處理后，與野生對照相比較轉(zhuǎn)基因株 系中活性氧積累比較少，受的氧化脅迫也較小。同時，發(fā)明人還分析了鹽脅迫和干旱脅迫處 理后葉片中活性氧清除劑的活性。結(jié)果顯示脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)中的超氧 化物歧化酶（SOD)、過氧化氫酶（CAT)、過氧化物酶（POD)活性均高于野生對照（WT)，表明 歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的過量表達增強了植株的活性氧清除劑的活性， 從而減少了活性氧的積累，增強了植株對非生物脅迫的抗性。
[0047] 實施例5 :脅迫相關(guān)基因在野生對照和V1AP17轉(zhuǎn)基因株系中的表達
[0048] 干旱，高鹽，冷脅迫等都會引起植物缺水使植物處于水分脅迫下。為了進一步了解 V1AP17基因在植物響應(yīng)各種脅迫過程中的調(diào)控作用，發(fā)明人通過實時定量PCR檢測了鹽脅 迫和干旱脅迫后一些已知功能的脅迫相關(guān)基因 AtS0S2, AtS0S3, ATRD29A，AtRD29B，AtADHl， ATNCED3, AtFRYl，AtRD22, AtDREB2A 和 AtERDl 在野生對照（WT)及轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2, L3) 中的表達量（圖7)。
[0049] 實時定量結(jié)果表明，鹽脅迫后，在擬南芥中過量表達歐美雜交葡萄品種巨峰抗 逆基因 V1AP17 提高了 AtS0S2, AtS0S3, AtRD29A，AtRD29B，AtADHl 和 AtNCED3 的表達 量。在三個轉(zhuǎn)基因株系（L1，L2，L3)中，AtRD29B基因的表達量均達到了野生對照的5 倍左右；AtADHl基因的表達量均達到了對照的10倍以上；AtS0S2, AtS0S3和AtRD29A 基因的表達量也達到了對照的2倍左右。干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因株系（LI, L2，L3)中 AtRD29A，AtRD29B，AtRD22，AtNCED3的表達量均比野生對照（WT)高，而V1AP17在擬南芥中 的過量表達并不影響不依賴ABA途徑的AtDREB2A和AtERDl的表達。另外，鹽脅迫和干旱 脅迫后，歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17的過量表達對于AtFRYl的基因表達表現(xiàn) 出了抑制作用（圖7)。
【權(quán)利要求】
1. 一種歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17,其特征在于，該基因的編碼區(qū)序列如 SED ID NO: 1 所示。
2. 權(quán)利要求1所述的歐美雜交葡萄品種巨峰抗逆基因 V1AP17用于提高植株的抗鹽脅 迫能力和干旱脅迫能力的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK104212825SQ201410369675
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】王西平, 郭榮榮 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)