一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法。該方法的步驟為：制備濃度為2×102～2×105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，再將蛭弧菌稀釋液與谷氨酸鈉和蔗糖的混合溶液按體積比1:1混合，得到蛭弧菌制劑；將蛭弧菌制劑與預(yù)處理過的含鹵蟲的水樣進(jìn)行混合。本發(fā)明提供的方法簡單易行，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，其中所含有的谷氨酸鈉和蔗糖，對水體及鹵蟲本身無毒副作用，并不會(huì)引起水體的污染和鹵蟲等有益水生浮游生物的死亡。通過本發(fā)明的方法可有效控制鹵蟲攜帶的總菌，在9h內(nèi)即可控制總菌數(shù)在102～103cfu/mL以內(nèi)，并在較長時(shí)間內(nèi)減緩其再生。
【專利說明】一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛭弧菌【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種控制鹵蟲攜帶的縱細(xì)菌數(shù)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]齒蟲(Artemia)屬于甲殼動(dòng)物亞門觸足(Branch1poda),也稱鹽水豐年蟲。齒蟲體長約I?1.3cm，體積大的鹵蟲其體長可達(dá)1.5cm。鹵蟲也有兩性之分，就個(gè)頭而言，雌性大于雌性，游泳時(shí)為仰泳(腹部朝上)，身體的顏色可隨水體鹽度的變化而變化。鹵蟲主要生活于鹽度較高的高鹽水體中，分布于內(nèi)陸鹽湖和海岸鹽田。就全世界范圍內(nèi)，目前發(fā)現(xiàn)的鹵蟲棲息地有300多處。最適鹽度為30%。?100%。左右，鹽度高時(shí)蟲體呈紅褐色。蟲體可分為頭、胸、腹3個(gè)部分。鹵蟲是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種重要的餌料生物。1977年的研究數(shù)據(jù)就曾表明，85%的已被養(yǎng)殖的海洋動(dòng)物都需要投喂鹵蟲。我國鹵蟲資源非常豐富。包括沿海鹽田的孤雌生殖鹵蟲和內(nèi)陸鹽湖的兩性生殖鹵蟲，鹵蟲在未被作為水產(chǎn)動(dòng)物餌料前，產(chǎn)地附近的居民撈取鹵蟲成體和幼體作為家禽餌料。但是，鹵蟲作為某些病原菌和病毒的傳播載體，進(jìn)而為養(yǎng)殖業(yè)帶來不可估量的危害。因此，控制鹵蟲自身攜帶總菌數(shù)量，即對鹵蟲自身健康起著至關(guān)重要的影作用，也對防止某些病原菌和病毒的傳播載體起著至關(guān)重要的影響。對于鹵蟲自身總菌的控制而言，在水產(chǎn)育苗過程中，養(yǎng)殖戶們通常會(huì)對引入鹵蟲餌料使用抗菌素類藥物等藥物投喂，以達(dá)到減少其總菌的效果。但是這些方法有其致命的一面，它不但會(huì)導(dǎo)致鹵蟲自身攜帶總菌產(chǎn)生抗藥性，而且鹵蟲會(huì)將這些帶有抗藥性的細(xì)菌傳遞到養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，從而對水產(chǎn)生物的育苗產(chǎn)生不利影響。
[0003]因此，在使用鹵蟲作為水產(chǎn)餌料養(yǎng)殖時(shí)，我們應(yīng)當(dāng)對鹵蟲自身攜帶的總菌引起高度重視。目前國內(nèi)新出現(xiàn)了一種新型的控制鹵蟲總菌方法。利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，將蛭弧菌制劑施用于水體之中，可有效抵抗病原菌對水產(chǎn)生物的侵害，從源頭上控制水產(chǎn)生物病害的發(fā)生。但是，目前國內(nèi)將蛭弧菌制劑應(yīng)用于控制高濃度鹵蟲自身攜帶總菌的研究目前尚無報(bào)道。因此，利用蛭弧菌制劑控制鹵蟲自身總菌，從而從源頭上對水產(chǎn)養(yǎng)殖中可能存在的致病細(xì)菌進(jìn)行控制，這具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法。該方法創(chuàng)新性提出了一種蛭弧菌制劑在控制有益浮游生物鹵蟲所攜帶的總菌的方式；并可以適當(dāng)?shù)难娱L其制劑中的菌體活性。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，包括以下步驟:
[0006](I)制備蛭弧菌稀釋液；
[0007](2)將步驟⑴制備的蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行混合，即得到蛭弧菌制劑；
[0008](3)含齒蟲(Artemia saline)的水樣的預(yù)處理；
[0009](4)將步驟(2)的蛭弧菌制劑與步驟(3)的含鹵蟲的水樣進(jìn)行混合。
[0010]所述的蛭弧菌優(yōu)選為咸水蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.) BDMOl，于2008年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M208066 ;對所述的蛭弧菌進(jìn)行負(fù)染后透射電鏡觀察可知=BDMOl呈單細(xì)胞，弧形，菌體大小為:1.7 X 1.0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長3.5 μ m。BDMOl采用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)3天可形成直徑3?4_的透明的圓形噬菌斑；
[0011]所述的蛭弧菌稀釋液優(yōu)選通過以下步驟獲得:
[0012]①宿主菌濃縮液的制備:挑取枯草芽孢桿菌單菌落(枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GMT1.135)，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mL DNB(diluted nutrient broth)液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0013]②蛭弧菌稀釋液的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1: 1:50的比例進(jìn)行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液過濾，濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，制備得到2X 12?2X 15PFU(plaque-forming unit)/mL的蛭弧菌稀釋液；
[0014]所述的蛭弧菌優(yōu)選為咸水蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.) BDM01，于2008年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M208066 ；
[0015]步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基優(yōu)選為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫?br> [0016]步驟①中所述的培養(yǎng)的條件優(yōu)選為150rpm、28°C培養(yǎng)12h ；
[0017]步驟①中所述的離心的條件優(yōu)選為4°C、6000rpm離心1min ；
[0018]步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件優(yōu)選為150rpm、28°C培養(yǎng)；
[0019]步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件優(yōu)選為6000rpm、4°C離心20min ；
[0020]步驟②中所述的過濾優(yōu)選為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進(jìn)行過濾；
[0021]步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，優(yōu)選通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，30g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121 °C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆茫?br> [0022]步驟②中所述的質(zhì)量體積比(g/mL)3%鹽度的滅菌蒸餾水優(yōu)選用海水晶制備得到；
[0023]步驟(2)中所述的保護(hù)劑優(yōu)選為質(zhì)量體積比(g/mL) 5?25%谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比(g/mL) 5?25%鹿糖的混合溶液；
[0024]步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行混合優(yōu)選按照蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行體積比1:1混合；
[0025]步驟(3)中所述的含鹵蟲的水樣的預(yù)處理方法，包括如下步驟:采集自鹵蟲的養(yǎng)殖水體的水樣，將從養(yǎng)殖水體取得的水樣靜置30?35min，取上層帶有浮游鹵蟲的水樣，除去沉淀在底部的泥沙等雜質(zhì)，即為實(shí)驗(yàn)所使用含鹵蟲的水樣；經(jīng)觀察計(jì)數(shù)，其鹵蟲數(shù)目為I?2個(gè)/mL ;
[0026]步驟(4)中所述的混合優(yōu)選將蛭弧菌制劑與含鹵蟲的水樣按照體積比1: (10?100)混合；
[0027]本發(fā)明的機(jī)理是:通過向培養(yǎng)好的蛭弧菌中添加谷氨酸鈉及蔗糖，制備成為一種蛭弧菌制劑，分別探討不同濃度的蛭弧菌制劑對于鹵蟲所攜帶的總菌的控制效果。
[0028]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0029](I)本發(fā)明獲得了一種蛭弧菌制劑的制備方法，通過該方法制備得到的蛭弧菌制劑可以在較長的時(shí)間內(nèi)維持其制劑中蛭弧菌裂解活性。
[0030](2)本發(fā)明制備的蛭弧菌制劑中含有保護(hù)劑(谷氨酸鈉和蔗糖的混合液)，而谷氨酸鈉和蔗糖的混合液對水體及鹵蟲本身無毒副作用，同時(shí)不會(huì)引起水體的污染和鹵蟲等有益水生浮游生物的死亡。
[0031](3)本發(fā)明提供的蛭弧菌制劑的制備方法簡單易行，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)，其中所含有的谷氨酸鈉和蔗糖，選材廣泛價(jià)格低廉，適用于推廣使用。
[0032](4)本發(fā)明提供的該種蛭弧菌制劑可以有效的控制鹵蟲所攜帶的的總菌，在9h內(nèi)即可控制總菌數(shù)目在103cfu/mL以內(nèi)，并在較長的時(shí)間內(nèi)減緩其再生。
[0033](5)本發(fā)明中所述的蛭弧菌制劑的濃度可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到最佳的控制鹵蟲所攜帶的總菌目的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C和實(shí)驗(yàn)組Cl的實(shí)驗(yàn)效果比對圖。
[0035]圖2是實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組D和實(shí)驗(yàn)組Dl的實(shí)驗(yàn)效果比對圖。
[0036]圖3是實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組E和實(shí)驗(yàn)組El的實(shí)驗(yàn)效果比對圖。
[0037]圖4是實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組F和實(shí)驗(yàn)組Fl的實(shí)驗(yàn)效果比對圖。
[0038]圖5是實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C、實(shí)驗(yàn)組D、實(shí)驗(yàn)組E和實(shí)驗(yàn)組F的實(shí)驗(yàn)效果比對圖。

【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0040]下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件。
[0041]咸水蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.) BDMOl，于2008年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:M208066 ;對所述的蛭弧菌進(jìn)行負(fù)染后透射電鏡觀察可知=BDMOl呈單細(xì)胞，弧形，菌體大小為:1.7X 1.0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長3.5 μ m。BDMOl采用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)3天可形成直徑3?4mm的透明的圓形卩遼菌斑。蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDMOl在中國專利申請文件“申請?zhí)?201010268459.1，名稱為:蛭弧菌游泳體在制備防治大菱蝦紅嘴病菌劑中的應(yīng)用”中公開。
[0042]實(shí)施例1
[0043]具體實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0044]—、材料、培養(yǎng)基和溶液
[0045](I)材料
[0046]蛭弧菌:BDMOI。
[0047]宿主菌:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GMT1.135，購于廣東省微生物所菌種保減中心。
[0048]含鹵蟲(Artemia saline)的水樣:采集自山東省的蓬萊抹直口海水養(yǎng)殖廠的含有舊金山灣鹵蟲(Artemia franciscana)的養(yǎng)殖水體的水樣,經(jīng)觀察計(jì)數(shù),其鹵蟲數(shù)目為約在2個(gè)/mL。
[0049](2)培養(yǎng)基
[0050]2216E佐貝爾海洋細(xì)菌培養(yǎng)基:海水晶30g，蛋白胨5g，酵母浸膏l(xiāng)g，磷酸高鐵
0.0lg，蒸餾水100mL, ρΗ7.6?7.8，瓊脂15g。121。。0.1MPa下滅菌20min后傾注平板保存?zhèn)溆谩?br> [0051 ] TCBS瓊脂培養(yǎng)基(弧菌選擇性培養(yǎng)基):TCBS瓊脂89g，加入蒸餾水lOOOmL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，傾注滅菌平板保存?zhèn)溆谩?br> [0052]營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆谩?br> [0053]DNB液體培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯0.8g/L，酪蛋白酸水解物0.5g/L，酵母提取物0.lg/L,30g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆谩?br> [0054](3)溶液
[0055]PBS (磷酸緩沖液)緩沖液(0.1M):量取0.2mol/L磷酸二氫鈉(27.8g磷酸二氫鈉定容至100mL) 28mL和0.2mol/L磷酸氫二鈉(53.65g七水磷酸氫二鈉定容至100mL) 72mL混合均勻，用蒸餾水定容至200mL，即為0.1moI/LPBS溶液，pH約為7.2。
[0056]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0057](I)宿主菌濃縮液的制備
[0058]挑取枯草芽孢桿菌單菌落(枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號為GIM1.355)，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，150rpm、28°C培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液4°C、6000rpm離心lOmin，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mL DNB(diluted nutrient broth)液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0059](2)蛭弧菌稀釋液的制備
[0060]按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1:1:50的比例進(jìn)行混合，150rpm、28 V恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h,得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液6000rpm、4°C離心20min,取上清液用0.45 μ m醋酸纖維素膜進(jìn)行過濾,濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹽度的滅菌蒸懼水調(diào)整其濃度,分別得到I X 12PFU(plaque-forming unit)/mL、I X 103PFU/mL、I X 104PFU/mL、I X 105PFU/mL 和 2 X 12PFU (plaque-forming unit) /mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL、2X 105PFU/mL 的 8 種濃度的蛭弧菌稀釋液。
[0061](3)蛭弧菌制劑樣品的制備
[0062]將步驟⑵中培養(yǎng)稀釋后的2X 102PFU/mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL 和2X105PFU/mL4種濃度的蛭弧菌稀釋液按照體積比1:1的比例添加含有質(zhì)量體積比(g/mL)6% (w/v)鹿糖和質(zhì)量體積比(g/mL)6% (w/v)谷氨酸鈉的混合溶液,從而得到制備出的均含有質(zhì)量體積比(g/mL)3% (w/v)鹿糖和質(zhì)量體積比(g/mL)3% (w/v)谷氨酸鈉的4種濃度的蛭弧菌制劑。
[0063]使用DNB雙層平板法檢測其蛭弧菌制劑中蛭弧菌的活菌濃度并記錄，即作為蛭弧菌制劑，并可將其應(yīng)用于控制鹵蟲所攜帶的的總菌當(dāng)中。
[0064](4)實(shí)驗(yàn)用樣品的處理及實(shí)驗(yàn)組設(shè)置
[0065]實(shí)驗(yàn)用水樣的處理:從文獻(xiàn)中知道，鹵蟲體長約I?1.3cm，體積大的鹵蟲其體長可達(dá)1.5cm,因此我們可以肉眼將其從養(yǎng)殖水體中挑選出來。在處理實(shí)驗(yàn)用水樣時(shí)，將從養(yǎng)殖水體取得的水樣若干靜置30min，傾倒出上層帶有浮游鹵蟲的水樣，除去沉淀在底部的泥沙等雜質(zhì)，即為實(shí)驗(yàn)所使用的水體樣本。吸取1mL水樣進(jìn)行觀察，記錄其中的鹵蟲數(shù)目，SP為實(shí)驗(yàn)用所含鹵蟲的水樣。
[0066]實(shí)驗(yàn)組設(shè)置:對于所取養(yǎng)殖水體，通過設(shè)置對照組、不同濃度的蛭弧菌制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組別的具體設(shè)置如下，即實(shí)驗(yàn)組A?Fl:
[0067]實(shí)驗(yàn)組A:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL滅菌的質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹽度蒸餾水，作為對照組。
[0068]實(shí)驗(yàn)組B:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL含有質(zhì)量體積比(g/mL) 3% (w/v)谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比(g/mL) 3% (w/v)鹿糖的混合溶液。
[0069]實(shí)驗(yàn)組C:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為102PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0070]實(shí)驗(yàn)組Cl:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為102PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護(hù)劑的蛭弧菌制劑。
[0071]實(shí)驗(yàn)組D:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0072]實(shí)驗(yàn)組Dl:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為103PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護(hù)劑的蛭弧菌制劑。
[0073]實(shí)驗(yàn)組E:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0074]實(shí)驗(yàn)組El:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為104PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護(hù)劑的蛭弧菌制劑。
[0075]實(shí)驗(yàn)組F:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟(3)中制備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌制劑。
[0076]實(shí)驗(yàn)組Fl:每50mL實(shí)驗(yàn)水樣中添加ImL步驟⑵中制備的濃度為105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液，作為受試的不含保護(hù)劑的蛭弧菌制劑。
[0077]實(shí)驗(yàn)組A?Fl的10個(gè)實(shí)驗(yàn)組別，每個(gè)做3個(gè)平行，每個(gè)平行樣品水樣為50mL使用三角燒瓶盛裝，置于無菌恒溫箱內(nèi)，室溫25°C放置Id后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，容器上方覆蓋滅菌塑料膜密封，防止灰塵等雜物污染，以使水體中的細(xì)菌菌群達(dá)到穩(wěn)定。對于實(shí)驗(yàn)組A?F1，Oh時(shí)添加一次對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)樣品，按照后續(xù)的檢測要求進(jìn)行檢測。
[0078](5)取樣檢測
[0079]對于所有實(shí)驗(yàn)組別，在添加蛭弧菌制劑等后立即取樣檢測，即為Oh的檢測值，后續(xù)每隔311取樣進(jìn)行檢測，取樣時(shí)間點(diǎn)分別為011、311、611、911、1211、1511、1811、2111和2411，取樣的全過程都嚴(yán)格遵循無菌操作，具體操作方法如下:
[0080]對于鹵蟲的取樣處理方式:使用小鑷子夾取I個(gè)鹵蟲浮游生物個(gè)體放入滅菌培養(yǎng)皿，再通過研缽碾碎后，再通過ImL的質(zhì)量體積比(g/mL) 3%咸淡水反復(fù)沖洗多次，整個(gè)取樣過程都嚴(yán)格遵循無菌操作，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，所得的液體即為待檢測齒蟲樣品。
[0081](6)總細(xì)菌數(shù)的檢測
[0082]在到達(dá)設(shè)定的檢測時(shí)間點(diǎn)時(shí)，將步驟(5)中的取樣處理后的鹵蟲樣品使用PBS緩沖液按10倍梯度進(jìn)行稀釋，取各梯度稀釋液0.lmL，均勻涂布于2216E佐貝爾海洋細(xì)菌培養(yǎng)基平板，將平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?5d，計(jì)算出樣品中的總細(xì)菌濃度，單位為cfu/mL0
[0083](7)數(shù)據(jù)分析
[0084]實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組3個(gè)平行樣品菌數(shù)檢測的數(shù)值取平均值，使用MS Excel進(jìn)行顯著性分析，可信度高，菌數(shù)檢測結(jié)果均以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。
[0085]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0086]蛭弧菌制劑對鹵蟲所攜帶的總菌的控制
[0087](I)濃度為102PFU/mL的蛭弧菌制劑的實(shí)驗(yàn)效果比對
[0088]圖1可以清晰看出，實(shí)驗(yàn)期間，對照組中的總細(xì)菌數(shù)量隨著時(shí)間的推移變化不顯著，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?17CfVmL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.28X 107cfu/mL ;添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.17X10Tcfu/mL。添加濃度為102PFU/mL的不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組Cl)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至3.69 X 106cfu/mL，可以在一定程度上減緩細(xì)菌的增長；添加濃度為102PFU/mL的含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組C)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至1.24X 104cfu/mL,并且在隨后的12h內(nèi)維持穩(wěn)定，其相同時(shí)間點(diǎn)總細(xì)菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組存在顯著差異。
[0089](2)濃度為103PFU/mL的蛭弧菌制劑的實(shí)驗(yàn)效果比對
[0090]圖2可以清晰看出，實(shí)驗(yàn)期間，對照組中的總細(xì)菌數(shù)量隨著時(shí)間的推移變化不顯著，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.28X 107cfu/mL ;添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.17X10Tcfu/mL。添加濃度為103PFU/mL的不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組Dl)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至6.78 X 105cfu/mL，可以在一定程度上減緩細(xì)菌的增長；添加濃度為103PFU/mL的含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組D)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至6.31 X 103cfu/mL，并且在隨后的12h內(nèi)維持穩(wěn)定，其相同時(shí)間點(diǎn)總細(xì)菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組存在顯著差異。
[0091](3)濃度為104PFU/mL的蛭弧菌制劑的實(shí)驗(yàn)效果比對
[0092]圖3可以清晰看出，實(shí)驗(yàn)期間，對照組中的總細(xì)菌數(shù)量隨著時(shí)間的推移變化不顯著，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?17CfVmL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.28X 107cfu/mL ;添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.17X10Tcfu/mL。添加濃度為104PFU/mL的不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組El)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至5.44X 105cfu/mL，可以在一定程度上減緩細(xì)菌的增長；添加濃度為104PFU/mL的含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?9h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至3.98X 102cfu/mL,并且在隨后的15h內(nèi)維持穩(wěn)定，其相同時(shí)間點(diǎn)總細(xì)菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組存在顯著差異。
[0093](4)濃度為105PFU/mL的蛭弧菌制劑的實(shí)驗(yàn)效果比對
[0094]圖4可以清晰看出，實(shí)驗(yàn)期間，對照組中的總細(xì)菌數(shù)量隨著時(shí)間的推移變化不顯著，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到5.28X 107cfu/mL ;添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL) 3%鹿糖組，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在16?107cfu/mL左右，總體呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，達(dá)到
5.17X10Tcfu/mL。添加濃度為105PFU/mL的不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組Fl)，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?12h內(nèi)就對于總菌有一定程度的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至2.65 X 106cfu/mL，可以在一定程度上減緩細(xì)菌的增長；添加濃度為105PFU/mL的含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組別(即實(shí)驗(yàn)組F)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制劑后，O?9h內(nèi)就對于總菌有較好的控制，使總細(xì)菌數(shù)目快速下降，由初始的2.03X 107cfu/mL降至9.86X 103cfu/mL,并且在隨后的15h內(nèi)維持穩(wěn)定，其相同時(shí)間點(diǎn)總細(xì)菌數(shù)目的變化與對照組、3%谷氨酸鈉+3%蔗糖組以及不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑組存在顯著差異。
[0095]綜上所述，對比發(fā)現(xiàn)，所有不含有3%谷氨酸鈉+3%蔗糖的單純蛭弧菌制劑在控制鹵蟲攜帶細(xì)菌中的效果均沒有含有3%谷氨酸鈉+3%蔗糖的混合蛭弧菌制劑的效果好，其2者存在顯著差異，因此說明，添加了保護(hù)劑的蛭弧菌制劑在控制鹵蟲中總細(xì)菌數(shù)目的效果上，好于未添加的組別，因此后面的研究集中于對比不同濃度的含有保護(hù)劑蛭弧菌制劑對于鹵蟲攜帶細(xì)菌的控制效果。
[0096](5)不同濃度蛭弧菌制劑效果比對
[0097]圖5可以清晰看出，實(shí)驗(yàn)期間，對照組中的總細(xì)菌數(shù)量隨著時(shí)間的推移變化不顯著，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目維持在107cfu/mL左右；添加質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL)3%蔗糖組，其中的總細(xì)菌數(shù)的變化趨勢與對照組相同，在O?24h內(nèi)其總細(xì)菌數(shù)目對數(shù)值變化在±0.33個(gè)數(shù)量級，并且在24h時(shí)其終總菌數(shù)達(dá)到穩(wěn)定。上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，相同時(shí)間點(diǎn)差異不大，O?24h內(nèi)總細(xì)菌數(shù)變化無顯著差異，并且組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的總細(xì)菌數(shù)，在O?24h內(nèi)無明顯差異。添加含有保護(hù)劑的不同濃度蛭弧菌制劑的組別均對于鹵蟲所攜帶的的總菌有較好的控制效果，觀察對比102PFU/mL、103PFU/mL、14PFU/mL和105PFU/mL4種濃度的蛭弧菌制劑的控制效果發(fā)現(xiàn)，104PFU/mL濃度的蛭弧菌制劑可以對鹵蟲所攜帶的的總菌有較好的控制效果，其在9h就可以使其中的總細(xì)菌數(shù)目下降5個(gè)數(shù)量級，而其他濃度的蛭弧菌制劑在9h時(shí)，對于鹵蟲所攜帶的的總菌的控制效果沒有14PFU/mL濃度的蛭弧菌制劑好，在對于總菌對數(shù)值的控制上較104PFU/mL濃度的蛭弧菌制劑少2個(gè)數(shù)量級，但仍然具備一定的控制效果。
[0098]同時(shí)，對比對照組和質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL)3%蔗糖組發(fā)現(xiàn)，向含有鹵蟲的水體中投放濃度為質(zhì)量體積比(g/mL) 3%谷氨酸鈉+質(zhì)量體積比(g/mL)3%蔗糖的混合溶液并未使其中的總細(xì)菌數(shù)目有顯著變化，并且不含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑具有一定的控制效果，但是沒有與保護(hù)劑共同使用時(shí)的協(xié)同效果好，這表明在制備蛭弧菌制劑中添加的谷氨酸鈉和蔗糖對于含有鹵蟲的水體及鹵蟲本身無污染及毒副作用，還可以獲得更加優(yōu)異的控制效果。因此，其可以用于蛭弧菌制劑的制備當(dāng)中。
[0099]總之，濃度為104PFU/mL的含有保護(hù)劑的蛭弧菌制劑即可在9h快速的降低鹵蟲所攜帶的的總菌數(shù)目，對于鹵蟲所攜帶的總菌的控制效果可以在較長時(shí)間內(nèi)得到維持，是一種良好的防控水體及鹵蟲所攜帶的總菌的有益菌制劑，將其投入大規(guī)模生產(chǎn)后，相信其可以對當(dāng)前的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品加工行業(yè)都產(chǎn)生重大深遠(yuǎn)的影響。
[0100]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備蛭弧菌稀釋液； (2)將步驟(I)制備的蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行混合，即得到蛭弧菌制劑； (3)含鹵蟲的水樣的預(yù)處理； (4)將步驟(2)蛭弧菌制劑與步驟(3)的含鹵蟲的水樣進(jìn)行混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDM01,為2008年4月28日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M208066。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀釋液的濃度為2 X 12?2X 105PFU/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的保護(hù)劑為質(zhì)量體積比5?25%谷氨酸鈉和質(zhì)量體積比5?25%蔗糖的混合溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟(2)中所述的蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行混合按照蛭弧菌稀釋液與保護(hù)劑進(jìn)行體積比1:1混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的含鹵蟲的水樣中的鹵蟲數(shù)目在I?2個(gè)/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟(4)中所述的混合是將蛭弧菌制劑與含鹵蟲的水樣按照體積比1: (10?100)混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀釋液通過以下步驟獲得: ①宿主菌濃縮液的制備:挑取枯草芽孢桿菌單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每10mL培養(yǎng)液收集的沉淀用2?3mL DNB液體培養(yǎng)基懸浮，得到宿主菌濃縮液，4°C保存?zhèn)溆茫? ②蛭弧菌稀釋液的制備:按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1:1:50的比例進(jìn)行混合,恒溫培養(yǎng),每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液過濾，濾液使用質(zhì)量體積比3%鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，制備得到2X 12?2 X 105PFU/mL的蛭弧菌稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121°C高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆茫? 步驟①中所述的培養(yǎng)的條件為150rpm、28°C培養(yǎng)12h ； 步驟①中所述的離心的條件為4°C、6000rpm離心1min ； 步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為150rpm、28°C培養(yǎng)； 步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件為6000rpm、4°C離心20min ； 步驟②中所述的過濾為用0.45 μ m醋酸纖維素膜進(jìn)行過濾； 步驟②中所述的質(zhì)量體積比3%鹽度的滅菌蒸餾水用海水晶制備得到。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的控制鹵蟲攜帶的總細(xì)菌數(shù)的方法，其特征在于: 步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，.0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，30g/L海水晶，用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N1/20GK104126528SQ201410269823
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】蔡俊鵬, 郭衍彪 申請人:華南理工大學(xué)