一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速高效、經(jīng)濟環(huán)保的基于金磁微粒的微量組織總核酸純化方法，實現(xiàn)微量組織總核酸共同提取。該方法整個純化過程在無菌操作臺完成，包括以下步驟：(1)裂解樣品，其中裂解液為終濃度為2M-8M硫氰酸胍溶液與0.01-0.05M檸檬酸鈉的混合溶液，并在使用前以體積比25:1加入β-巰基乙醇；(2)形成含金磁微粒-核酸復合物的混合溶液；(3)將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中分離；(4)依次采用第一清洗液和第二清洗液進行清洗，其中第一清洗液是終濃度為2M-8M氯化鋰溶液和50％(V/V)乙醇混合溶液，第二清洗液是70％-85％(V/V)乙醇；(5)洗脫，分離，即為純化得到的總核酸。
【專利說明】一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁性納微米材料純化微量組織總核酸的方法。
【背景技術】
[0002]高質(zhì)量核酸提取是許多分子生物學研究中至關重要的步驟，分子生物學實驗研究對于核酸純度和完整性等方面有較高要求。針對于動物組織的分析，包括疾病診斷、克隆、測序、擴增及雜交等諸多實驗研究的核心是純化得到高質(zhì)量高濃度的核酸。隨著分子生物學、臨床醫(yī)學和藥物基因組學等學科的高速發(fā)展，總核酸純化方法應用于腫瘤穿刺組織可實現(xiàn)對于穿刺組織總核酸的快速高效純化，從而為患者的病理診斷、藥物代謝基因研究及個體化用藥研究等奠定基礎。動物組織樣本及人腫瘤穿刺組織樣本通常較難得到，可用于純化的樣本質(zhì)量較小；目前國內(nèi)外對于微量組織總核酸純化方法的相關研究較少，因此，關于針對微量組織的總核酸純化方法的研究具有其重要意義。
[0003]目前國內(nèi)外針對于動物組織核酸純化的方法和試劑盒可歸納為兩類:固相分離法和液相分離法。利用磁性微粒進行的核酸分離純化屬于固相分離法的一種，該方法操作簡便、無需使用有毒性的有機試劑、純化過程快速且得到的核酸質(zhì)量高。OMEGA等公司開發(fā)的類似產(chǎn)品可從同一組織中分步得到RNA與基因組DNA，但是不能實現(xiàn)兩者的同時提取，且價格昂貴，實驗結(jié)果不穩(wěn)定，難以得到普遍應用。 [0004]專利CN101724625A所涉及的總核酸的磁性微粒分離方法針對于大量組織(^ 15mg)效果較好，但針對于微量組織IOmg)則不能實現(xiàn)高質(zhì)量高濃度總核酸的分離純化。
[0005]金磁微粒，即組裝型磁性復合微粒及核/殼型超順磁性復合微粒，其制備方法及結(jié)構組成已在中國專利ZL03153486.4和ZL03124061.5分別進行了公開，本發(fā)明即為基于金磁微粒所建立的快速高效、經(jīng)濟環(huán)保的微量組織總核酸純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種快速高效、經(jīng)濟環(huán)保的基于金磁微粒的微量組織總核酸純化方法，實現(xiàn)微量組織總核酸共同提取。
[0007]本發(fā)明的技術解決方案是:
[0008]一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:整個純化過程在無菌操作臺完成，包括以下步驟:
[0009](I)裂解樣品
[0010]取待純化樣本，加入裂解液中，充分研磨至無固體組織存在的勻漿液(研磨組織的方式可根據(jù)具體情況選擇，如液氮研磨法或使用自動勻漿機)，加入稀釋液混勻備用；所述裂解液為終濃度為2M - 8M硫氰酸胍溶液與0.01 - 0.05M檸檬酸鈉的混合溶液，并在使用前以體積比25:1加入β -巰基乙醇；
[0011](2)形成含金磁微粒-核酸復合物的混合溶液[0012]取金磁微粒溶液置于一潔凈離心管中，磁性分離后去除上清液，加入結(jié)合液后與步驟(1)得到的勻漿液混合均勻，室溫下靜置使其充分結(jié)合，形成含金磁微粒-核酸復合物的混合溶液；
[0013](3)將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中分離
[0014]對混合溶液磁性分離，棄去管內(nèi)液體(管內(nèi)液體因含有組織成分而不澄清，屬于正常情況)，管內(nèi)的固體成分為所得到的金磁微粒-核酸復合物；
[0015]⑷清洗
[0016]依次采用第一清洗液和第二清洗液對收集到的金磁微粒-核酸復合物進行清洗，其中第一清洗液是終濃度為2M-8M氯化鋰溶液和50% (V/V)乙醇混合溶液，第二清洗液是70% - 85% (V/V)乙醇；
[0017](5)洗脫
[0018]將洗脫液與清洗后的金磁微粒-核酸復合物混合均勻，使DNA與RNA從磁性微粒上洗脫下來，在外加磁場的作用下，將磁性微粒與洗脫下的總核酸分離，收集上清液，即為純化得到的總核酸。
[0019]基于上述基本方案，本發(fā)明還做如下優(yōu)化限定和改進:
[0020]步驟(1)中的稀釋液為終濃度0.01M - 0.1MTris - HCl、0.0OlM - 0.01OM EDTA 以及質(zhì)量分數(shù)0.1% - 0.5% SSC和0.2 - 0.8% SDS的混合溶液。稀釋液成分可有效地螯合活化核酸酶所需的金屬陽離子，由此抑制核酸酶的活性；同時，稀釋液中含有離子型表面活性劑，可充分去除核蛋白及細胞中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
[0021]步驟(2)中的結(jié)合液為無水乙醇。在與PEG-8000等多種常用結(jié)合液比較之后，無水乙醇的純化效果最佳，不會影響磁粒與勻漿液的結(jié)合。
[0022]步驟(5)中的洗脫液為無核糖核酸酶水。
[0023]待純化樣本的質(zhì)量≤10mg。
[0024]步驟(4)中的第一清洗液可以采用氯化鋰與無水乙醇配制。金磁微粒-核酸復合物形成后，與核酸相連的蛋白質(zhì)和蛋白多糖不易被除去。該清洗液能夠較好地去除結(jié)合在磁粒上的細胞碎片、多糖、脂類與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，初步得到純化的核酸。第二清洗液進行兩次清洗以去除鹽離子，防止前面步驟中的鹽離子殘余，同時乙醇易于揮發(fā)，清洗結(jié)束后放置片刻即可去除殘留的乙醇。
[0025]上述方法中使用的金磁微粒是以磁性納米微粒為核、在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的磁性復合微粒；其中所述的磁性納米微粒包括Fe304、Y-Fe2O3等鐵的氧化物粒子，單質(zhì)Fe、Co、Ni粒子聚集體,或經(jīng)過修飾后形成的Fe與其他金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
[0026]上述步驟 (5)中得到的總核酸溶液含有基因組DNA和總RNA，可根據(jù)實驗需要進行處理。使用DNase水解DNA即可得到純凈的總RNA,反之使用RNase水解RNA即可得到純凈的基因組DNA。
[0027]根據(jù)本發(fā)明，可制作出適用于動物微量組織及臨床穿刺組織樣本的總核酸純化試劑盒。試劑盒的特點在于包括:分別放置的上述裂解液、稀釋液、結(jié)合液、第一清洗液、第二清洗液、金磁微粒溶液和洗脫液。
[0028]本發(fā)明將金磁微粒GoldMag?作為固相載體應用于微量樣本的總核酸純化，建立了硫氰酸胍裂解-氯化鋰清洗純化體系，可實現(xiàn)從質(zhì)量為10 rng -30 mg的微量組織中同時提取DNA與RNA，可滿足從臨床穿刺組織樣本中提取高質(zhì)量總核酸并應用于下游實驗研究；同時，該方法操作步驟快速、簡便，無需離心；具體有以下優(yōu)點:
[0029]1、該方法整個純化過程在無菌操作臺完成，無需離心:分離過程由磁性分離實現(xiàn)，從而避免了離心過程可能帶來的RNA酶污染，同時避免多次離心過程導致核酸的破壞。
[0030]2、純化得到的總核酸純度和濃度高:核酸-磁性微粒復合物充分懸浮于清洗液中，保證核酸可在清洗液中得到充分清洗，且清洗過程將使用兩種清洗液分步清洗，保證清洗后的核酸無其他物質(zhì)污染，能夠去除抑制酶反應的抑制劑。
[0031]3、純化過程快速:該方法以金磁微粒為固相載體，在試驗中無需對磁性微粒進行預處理，金磁微粒與結(jié)合液(即無水乙醇)混合后直接用于核酸純化，整個純化過程可在30分鐘左右完成，操作簡便，快速環(huán)保。
[0032]4、本發(fā)明在核酸純化過程中，核酸與金磁微粒的結(jié)合屬于非特異性吸附，因此純化得到的核酸不具有專一性，可以同時分離得到生物樣本中的RNA和基因組DNA并獲得兩者的混合溶液，便于下游實驗應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為實施例一紫外分光光度計測定的核酸吸收峰曲線。
[0034]圖2為實施例一 1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0035]圖3為實施例二 1.2 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0036]圖4為實施例三1.2%瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0037]以下給出三個具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，并分別限定了較佳的具體操作環(huán)節(jié)和參數(shù)，本領域技術人員應當知曉，這些具體優(yōu)化的操作環(huán)節(jié)和參數(shù)并非對本發(fā)明權利要求的限定。
[0038]實施例一:利用金磁微粒從SD大鼠肝臟微量組織純化總核酸的方法
[0039](I)裂解樣品
[0040]1.1)取5 -1Omg SD大鼠肝臟組織，加入200 μ I胍鹽裂解液，使用勻漿機勻漿至無固體組織存在。該裂解液為終濃度為4Μ的硫氰酸胍溶液和終濃度為0.025Μ的檸檬酸鈉溶液，使用前需加入8 μ I β -巰基乙醇；
[0041]1.2)取150 μ I勻漿液轉(zhuǎn)移至一潔凈的2ml離心管中，加入300ul稀釋液，該稀釋液為終濃度為0.01MTris -HCl、0.01OM EDTA溶液與終質(zhì)量分數(shù)為0.25% SSC溶液和0.2%SDS溶液)，混勻，備用；
[0042](2)形成含磁性微粒-核酸符復合物的混合溶液
[0043]2.1)取50 μ I金磁微粒溶液(5mg/ml)于一新的2ml離心管中，將其置于磁性分離器上分離，棄去上清液，加入300 μ I結(jié)合液，吹吸混勻，靜置3分鐘，使磁粒與核酸充分結(jié)合；
[0044](3)將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中分離；
[0045]將離心管置于磁性分離器上，對混合溶液進行磁性分離，棄去上清液，將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中分離；
[0046](4)清洗
[0047]4.1)取300 μ I清洗液I加入(3)得到的金磁微粒-核酸復合物中，吹吸混勻，靜置3分鐘。對混合溶液磁性分離，棄去上清液，將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中進行分離。該清洗液I為終濃度為5Μ氯化鋰溶液與50%乙醇溶液；
[0048]4.2)去300 μ I清洗液2加入4.1)得到的金磁微粒-核酸復合物中，吹吸混勻，靜置3分鐘。對混合溶液磁性分離，棄去上清液，將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中進行分離。該清洗液2為75%乙醇；
[0049]4.3)去300 μ I清洗液2加入4.2)得到的金磁微粒-核酸復合物中，吹吸混勻，靜置30秒。對混合溶液磁性分離，棄去上清液，將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中進行分離；
[0050]4.4)打開離心管蓋，靜置晾干5分鐘。
[0051](5)洗脫
[0052]加入50μ I洗脫液，吹吸混勻，靜置5分鐘。對混合溶液磁性分離，收集上清液，即為純化得到的總核酸。
[0053]按照該實施例的方法，純化SD大鼠肝臟微量組織總核酸的結(jié)果如下:
[0054]表1 SD大鼠肝臟微量組織總核酸紫外分光光度數(shù)據(jù)
[0055]
【權利要求】
1.一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于，整個純化過程在無菌操作臺完成，包括以下步驟: (1)裂解樣品 取待純化樣本，加入裂解液中，充分研磨至無固體組織存在的勻漿液，加入稀釋液混勻備用；所述裂解液為終濃度為2M - SM硫氰酸胍溶液與0.01 - 0.05M檸檬酸鈉的混合溶液，并在使用前以體積比25:1加入β -巰基乙醇； (2)形成含金磁微粒-核酸復合物的混合溶液 取金磁微粒溶液置于一潔凈離心管中，磁性分離后去除上清液，加入結(jié)合液后與步驟(I)得到的勻漿液混合均勻，室溫下靜置使其充分結(jié)合，形成含金磁微粒-核酸復合物的混合溶液； (3)將金磁微粒-核酸復合物從混合溶液中分離 對混合溶液磁性分離，棄去管內(nèi)液體，管內(nèi)的固體成分為所得到的金磁微粒-核酸復合物； (4)清洗 依次采用第一清洗液和第二清洗液對收集到的金磁微粒-核酸復合物進行清洗，其中第一清洗液是終濃度為2Μ-8Μ氯化鋰溶液和50% (V/V)乙醇混合溶液，第二清洗液是70% - 85% (V/V)乙醇； (5)洗脫 將洗脫液與清洗后的金磁微粒-核酸復合物混合均勻，使DNA與RNA從磁性微粒上洗脫下來，在外加磁場的作用下，將磁性微粒與洗脫下的總核酸分離，收集上清液，即為純化得到的總核酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:步驟(1)中的稀釋液為終濃度0.01M - 0.1MTris -HC1、0.0OlM - 0.01OM EDTA以及質(zhì)量分數(shù) 0.1% - 0.5% SSC 和 0.2% - 0.8% SDS 的混合溶液。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:步驟(2)中的結(jié)合液為無水乙醇。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:步驟(5)中的洗脫液為無核糖核酸酶水。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:所述待純化樣本的質(zhì)量≤10mg。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:步驟(4)中采用第二清洗液進行兩次清洗以去除鹽離子。
7.根據(jù)權利要求1所述的利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于:采用的金磁微粒是以磁性納米微粒為核、在核表面組裝納米金或銀粒子形成的磁性復合微粒；其中所述的磁性納米微粒包括Fe304、Y -Fe2O3或者單質(zhì)Fe、Co、Ni粒子聚集體、或者經(jīng)過修飾后形成的Fe與其他金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
8.一種適用于動物微量組織及臨床穿刺組織樣本的總核酸純化試劑盒，其特征在于:包括分隔放置的如權利要求1中所述裂解液、稀釋液、結(jié)合液、第一清洗液、第二清洗液、金磁微粒溶液和洗脫液。
【文檔編號】C12N15/10GK103952400SQ201410166272
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
【發(fā)明者】杜夢涵, 李董嬌, 惠杜鵑, 房欣宜, 崔亞麗 申請人:西安金磁納米生物技術有限公司