一種用于檢測脆性x染色體綜合征的cgg重復(fù)數(shù)及agg插入信息的pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測脆性X染色體綜合征的CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒，包括DNA聚合酶套裝、PCR增強(qiáng)劑、引物群及校正Marker；所述的引物包括：1）用于檢測CGG重復(fù)數(shù)的引物F、R；2）用于檢測AGG插入信息的檢測引物M1、R1和驗(yàn)證引物M2、F1。本發(fā)明的試劑盒能精確快速分析樣品CGG重復(fù)數(shù)以及AGG插入信息；能夠突破現(xiàn)有脆性X染色體綜合征檢測方法采用熒光探針、MLPA、SouthernBlot、測序等難度高、耗時長、成本高的壁壘；通過凝膠電泳結(jié)果可直接分析CGG重復(fù)數(shù)的范圍及AGG的插入個數(shù)從而快速診斷樣品特征；采用高分辨率設(shè)備分離產(chǎn)物得到產(chǎn)物分離度，通過數(shù)學(xué)模型獲得CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息。
【專利說明】—種用于檢測脆性X染色體綜合征的CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測脆性X染色體綜合征的CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒，屬于分子生物學(xué)及遺傳病臨床診斷領(lǐng)域，尤其是涉及脆性X染色體綜合征及其他因三聯(lián)、四聯(lián)核苷酸高度重復(fù)引起的遺傳疾病臨床診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]脆性X染色體綜合征是一種發(fā)病率僅次于先天愚型的遺傳性智能低下綜合征，也是目前已知自閉癥最常見的發(fā)病原因之一。發(fā)病率占全部兒童的0.05%,呈X連鎖遺傳，占X連鎖智能低下的40%。95%以上的脆性X綜合征患者發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是FMR-1基因(CGG)n結(jié)構(gòu)擴(kuò)展的動態(tài)突變引起的，約5%以下則是由于FMR-1基因的錯義突變和缺失型突變影響了脆性X智能低下基因蛋白(FMRP)的正常結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。FMR-1基因是一個高度保守基因，其位于染色體Xq27.3，在基因組序列約38kb，由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成，編碼FMRP。在其5’端外顯子上的非翻譯區(qū)有一個(CGG) η三核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，(CGG) η在重復(fù)片段長度和AGG嵌入模式上都存在多態(tài)性，并且可以遺傳，在其上游大約250bp處有一個CpG島。正常FMR-1基因(CGG) η中η介于7_55之間。當(dāng)η擴(kuò)展到55-200時，攜帶者雖表型正常，但在傳代過程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，稱FMR-1基因的前突變。當(dāng)η擴(kuò)展達(dá)200以上時，男性表現(xiàn)100%為典型的脆性X綜合征，女性也有30%-50%表現(xiàn)輕重程度不等的智能低下。這種FMR-1基因的突變稱全突變。(CGG)n重復(fù)序列大量擴(kuò)展，引起FMR-15’ (CGG)η側(cè)CpG島異常甲基化，使FMR-1基因失活，導(dǎo)致FMRP的缺失引起智能低下。已知的FMR-1突變有三種類型。超 過99%的脆性X綜合征的患者是由三核苷酸重復(fù)順序擴(kuò)增和超甲基化所致。少于1%的患者因FMR-1基因部分缺失或點(diǎn)突變而致病。影響重復(fù)序列擴(kuò)增的主要因素有三:重復(fù)序列的總長度，AGG中斷的數(shù)目和位置以及重復(fù)序列的親源性別。重復(fù)序列的高度擴(kuò)增只見于母親向子代的傳遞，而父親的不穩(wěn)定重復(fù)序列在向子代傳遞時，擴(kuò)增的幾率較低。約30%子代的重復(fù)序列比其父親的縮短，這是所謂的重復(fù)序列收縮。
[0003]脆性X綜合征發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，遺傳規(guī)律獨(dú)特，目前無有效的治療方法，要降低其發(fā)病率，關(guān)鍵是查出攜帶者及病人，然后通過遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、阻止患兒出生。
[0004]檢測脆性X綜合征CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息，可得到FMR-1第一個外顯子5’端非翻譯區(qū)的(CGG)n重復(fù)序列的信息。正常人群中，CGG重復(fù)數(shù)在7_55之間，常含有2_3個AGG,稱為AGG中斷。當(dāng)CGG重復(fù)數(shù)超過60個或當(dāng)AGG中斷丟失導(dǎo)致連續(xù)的CGG超過35-40個重復(fù)后，則可能成為不穩(wěn)定的三核苷酸重復(fù)序列。CGG重復(fù)數(shù)在55-200之間，通常無CpG島超甲基化稱為(CGG) η重復(fù)序列的前突變。約有20%的卵巢早衰患者被檢出攜帶FMR-1前突變，因此，脆性X相關(guān)的卵巢早衰和前突變的病理作用有關(guān)。本發(fā)明適用于疑似卵巢功能早衰的患者的FMR-1前突變的分子檢測。
[0005]現(xiàn)有脆性X染色體綜合征檢測方法采用突光探針、MLPA、SouthernBlot、測序等技術(shù)，所述現(xiàn)有技術(shù)操作難度高、檢測耗時長、耗費(fèi)成本高。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種用于檢測脆性X染色體綜合征的CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒。
[0007]本發(fā)明是用于檢測脆性X染色體綜合征CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒，包括DNA聚合酶套裝、PCR增強(qiáng)劑、引物群及校正Marker。
[0008]本發(fā)明所述的引物包括:用于檢測CGG重復(fù)數(shù)的引物F、R，及用于檢測AGG插入信息的檢測引物Ml、Rl和驗(yàn)證引物M2、Fl ;所述的檢測引物和驗(yàn)證引物均包含有搜索探針的第一引物以及位于CGG重復(fù)區(qū)側(cè)翼相應(yīng)的退火引物；所述的檢測CGG重復(fù)數(shù)的上游引物F，其核苷酸序列為SEQIDN0:l-3中的任意一種，下游引物R的核苷酸序列為SEQIDN0:4_6中的任意一種；所述的檢測AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列為SEQIDN0:11-13中的任意一種，下游引物Rl的核苷酸序列為SEQIDN0:17-19中的任意一種；所述的驗(yàn)證AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列為SEQIDN0:20-22中的任意一種，下游引物M2的核苷酸序列為SEQIDN0:14-16中的任意一種；所述的引物M1、M2在其5’端包含一段與人類基因組無關(guān)的序列S，其中序列S的核苷酸序列為SEQID NO:7-10中的任意一種，以上引物信息詳見表1。
[0009]表1引物序列信息
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測脆性X染色體綜合征的CGG重復(fù)數(shù)及AGG插入信息的PCR試劑盒，其特征在于，包括DNA聚合酶套裝、PCR增強(qiáng)劑、引物群及校正Marker。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物包括:用于檢測CGG重復(fù)數(shù)的引物F、R，及用于檢測AGG插入信息的檢測引物Ml、Rl和驗(yàn)證弓丨物M2、Fl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測引物和驗(yàn)證引物均包含有搜索探針的第一引物以及位于CGG重復(fù)區(qū)側(cè)翼相應(yīng)的退火引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測CGG重復(fù)數(shù)的上游引物F，其核苷酸序列為SEQ ID N0:l-3中的任意一種，下游引物R的核苷酸序列為SEQ ID NO: 4-6中的任意一種，以上引物信息詳見表1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 11-13中的任意一種，下游引物Rl的核苷酸序列為SEQ IDNO: 17-19中的任意一種，以上引物信息詳見表1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的驗(yàn)證AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 20-22中的任意一種，下游引物M2的核苷酸序列為SEQ IDNO: 14-16中的任意一種，以上引物信息詳見表1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物M1、M2在其5’端包含一段與人類基因組無關(guān)的序列S，其中序列S的核苷酸序列為SEQ ID N0:7-10中的任意一種，以上引物信息詳見表1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶套裝為任意商業(yè)化PCR試劑盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增添加劑在另一專利中進(jìn)行詳述。
10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的試劑盒中的校正Marker具有用于檢測設(shè)備的校正的用途，檢測設(shè)備校正曲線的R2應(yīng)大于0.995。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的檢測設(shè)備，可以有效分離核苷酸樣品，其中結(jié)果的表現(xiàn)形式為瓊脂糖凝膠電泳圖及微流體毛細(xì)管電泳分離曲線。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的檢測設(shè)備為安捷倫2100生物分析儀、HPLC、ABI3730、BECKMAN MDQ系列及其他具有同等性能的分離分析設(shè)備，優(yōu)選安捷倫2100生物分析儀。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測方法提供一種分析致病基因FMR-1的數(shù)學(xué)模型。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述檢測結(jié)果是通過建立數(shù)學(xué)模型來確定CGG重復(fù)數(shù)以及AGG插入信息。
15.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的試劑盒應(yīng)用于不限于脆性X染色體綜合征臨床診斷，還可以應(yīng)用于其他三聯(lián)、四聯(lián)核苷酸高度重復(fù)引起的遺傳疾病臨床診斷。
【文檔編號】C12Q1/68GK103981253SQ201410119503
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】潘海波, 華琴, 邢楠楠, 謝陽 申請人:江蘇佰齡全基因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司