一種基于ssr標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提出的是一種水稻指紋圖譜的構(gòu)建方法。具體的方法包括提取水稻基因組DNA，篩選多態(tài)性好的SSR熒光引物，對(duì)水稻品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，通過數(shù)據(jù)分析獲得0-1矩陣圖，并將0-1矩陣圖轉(zhuǎn)化為指紋模式圖譜。本發(fā)明應(yīng)用SSR的多態(tài)性與毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)高分辨率的特性，不僅可以分辨出條帶大小相差1bp的多態(tài)性條帶，且易于自動(dòng)化，操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠，易于大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)整合與分析，適用于大量水稻品種指紋圖譜的構(gòu)建。
【專利說明】—種基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物信息【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及的是一種基于SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國主要糧食作物之一，也是我國植物新品種保護(hù)條例涵蓋的第一批保護(hù)作物之一。水稻種苗的真實(shí)性是衡量種苗質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前我國水稻種子和種苗存在純度低、品質(zhì)混雜、以次充好的現(xiàn)象，各級(jí)農(nóng)作物品種審定機(jī)構(gòu)和種子種苗生產(chǎn)部門對(duì)水稻品種偽劣鑒定日益重視，但是，水稻種子資源形態(tài)特征較為相似，特別是雜交種子表面上很難區(qū)分。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法依賴于表型差異，而形態(tài)性狀受到氣候、環(huán)境、營養(yǎng)狀態(tài)和生物期等多種因素的影響，使得形態(tài)鑒定法的工作量加大，鑒定周期長。構(gòu)建水稻指紋圖譜，是現(xiàn)階段控制水稻內(nèi)在質(zhì)量的有效手段。
[0003]DNA分子標(biāo)記能反映生物個(gè)體或種群基因組中某種差異特征的DNA片段，可以從根本上揭示植物內(nèi)在的基因差異，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用到作物品種鑒定和種質(zhì)資源分類等研究領(lǐng)域。其中SSR (Simple sequence repeat)標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遺傳上呈共顯性、結(jié)果穩(wěn)定可靠、實(shí)驗(yàn)操作簡單、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，在水稻指紋圖譜構(gòu)建中表現(xiàn)出更為突出的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]傳統(tǒng)的SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物主要通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯凝膠電泳等生物技術(shù)來進(jìn)行多態(tài)性分析的，這些方法雖然比較成熟但卻非自動(dòng)化，耗時(shí)、耗力，且不能準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增片段大小，難以統(tǒng)一處理不同批次的反應(yīng)數(shù)據(jù)，在大規(guī)模、多批收集和分析數(shù)據(jù)時(shí)，仍具有相當(dāng)大的難度。毛細(xì)管電泳(Capillay Electrophoresis, CE)是20世紀(jì)80年代后期在全球范圍內(nèi)迅速崛起的一種分離分析技術(shù)，該技術(shù)利用與遺傳系統(tǒng)相匹配的電腦軟件完成對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)一處理，操作簡便，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記研究與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合，并且能準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增等位基因片段的大小，減少了人為誤差，使得鑒定結(jié)果更為精確，更適用于水稻指紋圖譜的建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高通量、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的水稻品種的鑒定方法，解決水稻純度和真?zhèn)蔚蔫b定難題，也可以對(duì)商品大米進(jìn)行品種鑒定，保護(hù)品種所有人的合法知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
[0006]本發(fā)明所提供的水稻品種的鑒定方法，包括以下步驟:
(I)提取高質(zhì)量水稻基因組DNA ; (2)用篩選的SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)；(4)得出所擴(kuò)得條帶大??；(5)通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析獲得0-1矩陣圖；(6)根據(jù)0-1矩陣圖繪制指紋模式圖譜的膠板圖。
[0007] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述水稻基因組DNA的提取方法為:(1)剪取0.02~0.04 cm2的水稻新鮮嫩葉裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩沖液，加入0.2 μ I的100mg/ml蛋白酶K和1μ I的10 mg/ml核糖核酸酶,用PCR板硅膠蓋封蓋好后于漩渦振蕩儀上混勻；(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存:首先設(shè)置溫度為37°C，時(shí)間為30 min ;接著設(shè)置溫度為68°C，時(shí)間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37°C，時(shí)間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4°C，時(shí)間為; (3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10 min ; (5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4°C下3000 rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0008]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述SSR熒光引物為適用于水稻指紋圖譜構(gòu)建的5對(duì)核心引物，其中正向引物5’端以“CY5 ”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存，所述的5對(duì)核心引物信息如下:
引物名稱:RM206，引物序列:正向:5’ -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，反向:5’ -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’，堿基重復(fù):CT ；
引物名稱:RM71，引物序列:正向:5’ -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3’，反向:5’ -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3’，堿基重復(fù):(ATT) IOT (ATT) 4 ；
引物名稱:觀85，引物序列:正向:5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’，反向:5’ -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’，堿基重復(fù):(TGG) 5 (TCT) 12，；
引物名稱:RM311，引物序列:正向:5’ -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3’，反向:5’ -TCCTATACACATACAAACATAC-3’，堿基重復(fù)= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ；
引物名稱:RM297，引物序列:正向:5’-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3’，反向:5’ -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3’，堿基重復(fù):(GA)13。
[0009]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?首先94°C預(yù)變性5 min ；隨后的30個(gè)循環(huán)為:94°C變性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸30 sec ;最后72°C下延伸 10 min。
[0010]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法為:首先打開BECKMANCOULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀毛細(xì)管通道蓋，卸下毛細(xì)管陣列，清洗毛細(xì)管檢測(cè)窗口，安裝毛細(xì)管和凝膠，將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重復(fù)3次模式進(jìn)行初級(jí)管路沖洗，執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次，執(zhí)行光路聚集，監(jiān)控儀器基線，使系統(tǒng)背景值低于6000RFU ;然后輸入樣品名，選擇電泳分離方法和數(shù)據(jù)分析方法，保存樣本信息；最后使用去離子水沖洗水 槽三次，加入去離子水至標(biāo)線,擦干水槽外表面,裝入水槽,放入樣本板和緩沖液板，開始運(yùn)行樣本，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
[0011]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述系統(tǒng)背景值應(yīng)低于6000RFU，清洗檢測(cè)窗口后，執(zhí)行光學(xué)校正和監(jiān)控基線，如果背景值仍在6000RFU之上，需重復(fù)清洗程序，直至背景值低于6000RFU ；
作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述程序中使用的水必須是滅菌去離子水；所用的去離子水電導(dǎo)率一般為18.2MQ/CM ；
作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述樣板中為Gemescan-400 (分子量內(nèi)標(biāo)_400)，上樣緩沖液甲酰胺(SLS)和稀釋后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的混合液，將上樣板在渦旋震蕩器上震蕩30s或者用槍頭混勻10次，且不能出現(xiàn)氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品；在緩沖液板與上樣板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步限定，所述數(shù)據(jù)分析方法為:用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同參試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小。在所有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“1”，無擴(kuò)增出記為“0”，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
[0013]本發(fā)明篩選出了 5對(duì)多態(tài)性豐富、帶型清晰、穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的SSR核心引物。
[0014]本發(fā)明應(yīng)用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)利用與遺傳分析系統(tǒng)相匹配的電腦軟件完成對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)一處理，操作簡便，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記研究與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合，將PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品(內(nèi)標(biāo))在同一泳道中進(jìn)行電泳，精確分析擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度，避免了人為誤差，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。
[0015]除此之外，按照本發(fā)明所述方法還可以將本發(fā)明所選水稻品種之外的其他水稻品種或者將現(xiàn)有所知的所有水稻品種構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)水稻品種的SSR指紋圖譜，如此便可鑒定更多的待測(cè)水稻品種。
[0016]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)從遺傳本質(zhì)上對(duì)水稻品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，解決了長期以來水稻品種鑒定困難的問題，且具有高通量，簡單、易操作，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為我國水稻品種的準(zhǔn)確鑒定、育種利用和新品種權(quán)保護(hù)提供了重要依據(jù)，為我國水稻品種標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1、圖2、圖3分別為引物RM297、RM206、RM311對(duì)22個(gè)水稻品種的擴(kuò)增指紋模式圖譜，圖譜中黑色區(qū)域代表每個(gè)樣品的指紋，由圖可以看出篩選出的SSR引物能夠?qū)?2個(gè)水稻品質(zhì)特異的區(qū)分開。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例:水稻品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)材料為選取的22種常用水稻品種。
[0019]1、基因組DNA的提取
(1)用75%的酒精擦洗過的剪刀剪取0.02、.04 cm2的葉片裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩沖液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板硅膠蓋封蓋好后于漩渦振蕩儀上混勻10 sec ；
(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存:首先設(shè)置溫度為37°C，時(shí)間為30min ；接著設(shè)置溫度為68°C，時(shí)間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37°C，時(shí)間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4°C，時(shí)間為無窮； (3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；
(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10min ；
(5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4°C下3000rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?.PCR擴(kuò)增
PCR 反應(yīng)體系(10 μ I):1 μ I 25 ng/μ I DNA 模板、I μ I IOXBuffer (含 20 mMMg2+)>0.2 μ I 10 mM dNTP、0.4 μ I 10 mol/L SSR 引物、0.I μ I DNA pfu 酶(5 U/μ I),加ddH20至20 μ I (試劑購自生工生物工程股份有限公司)。
[0020]PCR擴(kuò)增程序:首先94°C預(yù)變性5 min ;隨后的30個(gè)循環(huán)為:94°C變性30 sec,55°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 10 min。
[0021] 3.毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)
(1)打開BECKMANCOULTER CEQ 8000 (美國，BECKMAN公司生產(chǎn))遺傳分析系統(tǒng)儀毛細(xì)管通道蓋，卸下毛細(xì)管陣列，清洗毛細(xì)管檢測(cè)窗口 ；
(2)安裝毛細(xì)管和凝膠，將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重復(fù)3次模式進(jìn)行初級(jí)管路沖洗，執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次，執(zhí)行光路聚集，監(jiān)控儀器基線，使系統(tǒng)背景值低于6000RFU，如果背景值仍在6000RFU之上，需重復(fù)清洗程序；
(3)將所得到的PCR產(chǎn)物稀釋100倍，在96孔上樣板的各孔中分別加入20μL SLS(上樣緩沖液，甲酰胺)、0.2 μL Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品和I μL稀釋后的PCR產(chǎn)物，在渦旋震蕩器上震蕩30 sec混勻，且不能出現(xiàn)氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品，即得上樣板。
[0022](4)在緩沖液板與上樣板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液；
(5)在基因分析儀Setup程序中輸入樣品名，設(shè)定電泳分離程序?yàn)?0°C變性2 min；進(jìn)樣電壓2 kV，時(shí)間30 sec ;分離電壓7.5 kV，時(shí)間40 min，保存樣本信息；
(6)使用去離子水沖洗水槽三次，加入去離子水至標(biāo)線，擦干水槽外表面，裝入水槽，放入配制好的樣本板和緩沖液板,開始運(yùn)行樣本，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存；
4.數(shù)據(jù)分析
用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)BECKMAN COULTER CEQ 8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出各供試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，軟件系統(tǒng)將根據(jù)擴(kuò)增片段目標(biāo)峰的位置與同一泳道中的Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，得到SSR標(biāo)記片段長度大小。在所有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“1”，無擴(kuò)增出記為“0”，建立各個(gè)SSR引物在22份水稻材料中擴(kuò)增片段的0-1矩陣圖，根據(jù)0-1矩陣圖繪制指紋模式圖譜的膠板圖。圖1、圖2、圖3分別為引物RM297、RM206、RM311對(duì)22份水稻材料的擴(kuò)增指紋模式圖，黑色區(qū)域代表每個(gè)樣品的指紋。由圖中可以看出，每個(gè)樣品的指紋都是唯一的，說明所選引物都能很好的區(qū)分每個(gè)供試品種，可用于水稻指紋圖譜的構(gòu)建。
[0023]按照本實(shí)施例方法構(gòu)建指紋圖譜，共重復(fù)3次，每次結(jié)果均一致。說明SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于水稻指紋圖譜的構(gòu)建。
【權(quán)利要求】
1.一種基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟:(I)提取水稻基因組DNA ; (2)用篩選的SSR熒光引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)；(4)得出所擴(kuò)得條帶大??；(5)通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析獲得0-1矩陣圖；(6)根據(jù)0-1矩陣圖繪制指紋模式圖譜的膠板圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述提取水稻基因組DNA的方法為:(I)剪取0.02、.04 cm2的水稻新鮮嫩葉裝入96孔PCR板的孔中，加入100 μ I DNA提取緩沖液，加入0.2 μ I的100 mg/ml蛋白酶K和I μ I的10 mg/ml核糖核酸酶，用PCR板硅膠蓋封蓋好后于漩渦振蕩儀上混勻；(2)在PCR擴(kuò)增儀中設(shè)置以下反應(yīng)程序并保存:首先設(shè)置溫度為37 °C，時(shí)間為30 min;接著設(shè)置溫度為68 °C,時(shí)間為20 min ;然后設(shè)置溫度為37 °C,時(shí)間為30 min ;最后設(shè)置溫度為4°C，時(shí)間為無窮；(3)將步驟(1)得到的PCR板放入設(shè)置好的PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)；(4)反應(yīng)結(jié)束后立刻將PCR板轉(zhuǎn)置于冰面上進(jìn)行冰浴10 min ; (5)將PCR板放入冷凍離心機(jī)中，在4℃下3000 rpm離心10 min，取上清液即得DNA溶液，置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述SSR熒光引物為適用于水稻指紋圖譜構(gòu)建的5對(duì)核心引物，其中正向引物5’端以“CY5”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存，所述的5對(duì)核心引物信息如下: 引物名稱:RM206，引物序列:正向:5’ -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，反向:5’ -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3’，堿基重復(fù):CT ； 引物名稱:RM71，引物序列:正向:5’ -CTAGAGGCGAAAACGAGATG-3’，反向:5’ -GGGTGGGCGAGGTAATAATG-3’，堿基重復(fù):(ATT) IOT (ATT) 4 ； 引物名稱:觀85，引物序列:正向:5’ -CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’，反向:5’ -GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’，堿基重復(fù):(TGG) 5 (TCT) 12，； 引物名稱:RM311，引物序列:正向:5’ -TGGTAGTATAGGTACTAAACAT-3’，反向:5’ -TCCTATACACATACAAACATAC-3’，堿基重復(fù)= (GT)3(GTAT)8(GT)5 ； 引物名稱:RM297，引物序列:正向:5’-TCTTTGGAGGCGAGCTGAG-3’，反向:5’ -CGAAGGGTACATCTGCTTAG-3’，堿基重復(fù):(GA)13。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增程序?yàn)?首先94 °C預(yù)變性5 min;隨后的30個(gè)循環(huán)為:94 °C變性 30 sec, 55 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 30 sec ;最后 72 °C下延伸 10 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)方法為:首先打開遺傳分析系統(tǒng)儀毛細(xì)管通道蓋，卸下毛細(xì)管陣列，清洗毛細(xì)管檢測(cè)窗口，安裝毛細(xì)管和凝膠，將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重復(fù)3次模式進(jìn)行初級(jí)管路沖洗，執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次，執(zhí)行光路聚集，監(jiān)控儀器基線，使系統(tǒng)背景值低于6000RFU ;然后輸入樣品名，選擇電泳分離方法和數(shù)據(jù)分析方法,保存樣本信息；最后使用去離子水沖洗水槽三次,加入去離子水至標(biāo)線,擦干水槽外表面，裝入水槽，放入樣本板和緩沖液板，開始運(yùn)行樣本，PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由基因分析儀自動(dòng)保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法的系統(tǒng)背景值應(yīng)低于6000RFU，清洗檢測(cè)窗口后，執(zhí)行光學(xué)校正和監(jiān)控基線，如果背景值仍在6000RFU之上，需重復(fù)清洗程序，直至背景值低于6000RFU。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，程序中使用的水必須是滅菌去離子水。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，樣品板中為Gemescan-400，上樣緩沖液甲酰胺和稀釋后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的混合液，將上樣板在渦旋震蕩器上震蕩30 sec或者用槍頭混勻10次，且不能出現(xiàn)氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品；在緩沖液板與上樣板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SSR標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的水稻指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征在于，所述的數(shù)據(jù)分析方法為:用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)BECKMAN COULTER CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同參試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到 SSR標(biāo)記片段長度大小，在所 有SSR標(biāo)記片段上，參試材料中若擴(kuò)增出記為“ 1”，無擴(kuò)增出記為“0”，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911442SQ201410094041
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】梁俊, 陳遠(yuǎn)孟, 劉守廷, 覃紅萍, 甘國勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 蔣天成, 趙晶, 蘇小玲, 劉廣林, 陳傳華, 唐梅, 張宗瓊, 羅群昌, 梁益珍, 李碧紅 申請(qǐng)人:南寧益譜檢測(cè)技術(shù)有限公司, 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心, 南寧泰格瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司