專利名稱：一種基于位點特異性重組的基因打靶載體快速構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于ΦΒΤ1整合酶及其 突變識別位點的基因打靶載體快速構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
基因打靶技術(shù)通常是指含已知序列的DNA片段與受體細(xì)胞基因組中的同源序列 發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中，在靶位點增加外源DNA片段或基因，或者定向敲 除或增加某些相關(guān)基因的技術(shù)。基因打靶技術(shù)作為現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳操作的重要手 段，在對單個基因、基因組和基因家族進(jìn)行深入分析和定性研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 通過該技術(shù)，可實現(xiàn)對生物遺傳信息的定向改造，改造后的遺傳信息在細(xì)胞或生物活體內(nèi) 穩(wěn)定遺傳，表達(dá)相應(yīng)突變的性狀。以此可確定相關(guān)基因的功能，幫助揭示各種生化途徑和信 號傳導(dǎo)通路；闡明疾病發(fā)生的分子機(jī)制，并為相關(guān)疾病的治療提供可選藥物、評價模型及預(yù) 防、治療疫苗等?；虼虬屑夹g(shù)是后基因組時代基因功能研究的重要技術(shù)手段。構(gòu)建基因打靶載體是基因打靶技術(shù)的第一步。以雙交換實現(xiàn)基因敲除載體為例， 常規(guī)的基因打靶載體一般包括同源雙臂(分別為待敲除基因的上游和下游DNA序列)、可 篩選的抗性基因、供體菌復(fù)制元件以及不同物種間基因轉(zhuǎn)移的相關(guān)元件。為實現(xiàn)基因敲除， 需要把多個相關(guān)元件集中到單一質(zhì)粒DNA上，而這一過程目前主要是通過常規(guī)克隆方法， 即通過基于限制性內(nèi)切酶和連接酶作用的酶切/連接體系。然而，傳統(tǒng)的限制性酶切/連 接不僅操作繁瑣(以構(gòu)建基因敲除載體為例，需要經(jīng)過至少六步的亞克隆和驗證)，需要耗 費大量的時間，試劑成本也隨之增加，同時合適單一酶切位點的選擇也成為大片段操作和 大規(guī)模基因克隆無法回避的問題。隨著技術(shù)的不斷更新，基于同源重組和位點特異性重組的克隆方法也先后被開發(fā) 出來并被研究者使用，這兩種方法都很好的克服了傳統(tǒng)克隆方法的缺點。同源重組克隆的 原理，是重組酶能夠識別并催化同源序列間的鏈交換，達(dá)到重組的目的。將這一原理應(yīng)用到 體外，使用純化的重組酶，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，實驗載體與目的基因的重組。重組完成之 后，不會在載體上留下任何不必要的序列，但是一方面，同源重組有可能產(chǎn)生非預(yù)期的鏈交 換，專一性有待進(jìn)一步研究；另一方面，同源重組的效率一般比較低。由于這兩個方面的缺 陷，使用同源重組的方法實現(xiàn)多個長片段的串聯(lián)克隆幾乎成為了不可能的任務(wù)。位點特異性重組廣泛發(fā)生在噬菌體整合到宿主染色體上的過程中。噬菌體編碼一 種位點特異性重組酶，能特異性的識別自身的attP位點和宿主染色體attB位點，并介導(dǎo) 兩位點的切割和鏈交換，將噬菌體基因組整合進(jìn)宿主染色體。對位點特異性重組酶的體外 研究發(fā)現(xiàn)，該類酶催化的重組反應(yīng)不僅專一性高，而且快速高效。很快，研究較早且機(jī)理清 楚的λ整合系統(tǒng)被應(yīng)用到體外的重組克隆中，率先突破了傳統(tǒng)克隆的缺點。進(jìn)一步的研究 發(fā)現(xiàn)絲氨酸酶類(Φ031 integrase, ΦBTl integrase)的重組效率要高于酪氨酸類重組酶 (λ integrase)，且參與重組反應(yīng)所需要的蛋白因子單一，便于純化和體外重組系統(tǒng)的建立 和應(yīng)用。對位點特異性重組發(fā)生機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn)，核心序列(即切割和鏈交換發(fā)生的
3序列)在重組反應(yīng)中只負(fù)責(zé)鏈切割和交換后粘性末端的配對，而不參與酶特異性識別和結(jié) 合的過程，核心堿基的突變并不會影響重組反應(yīng)的發(fā)生以及重組效率；且反應(yīng)只在含有相 同核心突變的底物對間進(jìn)行，核心不匹配，重組反應(yīng)則不能發(fā)生。利用絲氨酸重組酶的這一 特性，即可很方便的獲得可用于同一反應(yīng)體系的不兼容底物對，實現(xiàn)對片段的串聯(lián)或者多 重重組?；谝陨咸匦裕z氨酸重組酶的重組和突變不兼容底物對系統(tǒng)可以為基因打靶載 體的構(gòu)建提供更加高效快速的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種簡單，高效，快速構(gòu)建基因打靶載體的方法。本發(fā)明提出的構(gòu)建基因打靶載體方法，是一種基于大型絲氨酸重組酶ΦΒΤ1 integrase的基因打靶載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明通過嚴(yán)格突變篩選和驗證，提供三對突變的 整合酶識別序列，突變的底物對參與反應(yīng)效率與野生型相當(dāng)，且在同一體系中表現(xiàn)為不兼 容，即可同時使用。在此基礎(chǔ)上，以構(gòu)建重要模式和工業(yè)菌種天藍(lán)色鏈霉菌的基因敲除載體 為例，構(gòu)建一整套相關(guān)載體，包括一個可實現(xiàn)大腸桿菌_天藍(lán)色鏈霉菌穿梭的骨架載體，以 及三個含有突變底物對用于同源臂構(gòu)建和篩選的TA克隆載體。并提供四個DNA片段體外 串聯(lián)重組反應(yīng)的具體方法和步驟。本發(fā)明提供的基因打靶載體構(gòu)建方法簡單、快速并且高效，可廣泛用于鏈霉菌的 基因打靶載體的構(gòu)建；另外，針對不同實驗材料和對象的具體需求，只要在骨架載體上加入 相應(yīng)實驗對象所需的原件(例如轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞所需的相應(yīng)元件)，獲得 相應(yīng)的入門載體，即可實現(xiàn)用于該物種基因打靶載體的快速構(gòu)建。本發(fā)明提出的上述方法與應(yīng)用具體如下本發(fā)明以敲除模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)中放線紫紅素 (Act)生物合成相關(guān)部分結(jié)構(gòu)基因，導(dǎo)致Act的合成中斷為例。1、Φ BTl整合酶兼容底物對的獲取及重組效率確定。為獲取三組突變底物對，并測算突變底物對的反應(yīng)效率以及交叉反應(yīng)的效率，設(shè) 計了一套藍(lán)白篩選系統(tǒng)。將野生型和三個突變的attB位點克隆到通用載體pBC-SK(-)中， 精確插入到IacZa基因的開放閱讀框當(dāng)中，不破壞β-半乳糖苷酶基因α亞基的表達(dá)；通 過PCR的方法，獲得野生型和三個突變的attP位點，均插入到TA克隆載體pMD19-T中。構(gòu)建含有野生型和突變attB位點質(zhì)粒所用核苷酸序列依次為primer 1 (SEQ No. 1)和primer 2 (SEQ No. 2)在同一體系退火后插入pBC_SK(_)獲得質(zhì)粒pZLBOO，以 primer 3 (SEQNo. 3)和 primer 4(SEQ No. 4)獲得質(zhì)粒 pZLB06，以 primer 5 (SEQ No. 5)和 primer 6 (SEQ No. 6)獲得質(zhì)粒 pZLB13，以 primer 7 (SEQ No. 7)和 primer 8 (SEQ No. 8) 獲得質(zhì)粒PZLB15。構(gòu)建含有野生型和突變attP位點質(zhì)粒所用核苷酸序列依次為primer 9 (SEQ No. 9) ^PprimerlO (SEQ No. 10)分別為上下游引物，以pRT802為模板，獲得含有attP 位點的PCR產(chǎn)物后克隆到PMD19-T獲得質(zhì)粒pZLPOO ；以primer 9 (SEQ No. 9)和primer 11 (SEQ No. 11)獲得質(zhì)粒 pZLP06 ；以 primer 9 (SEQ No. 9)和 primer 12 (SEQ No. 12)獲得 質(zhì)粒 pZLP13 ；以 primer9 (SEQ No. 9)和 primer 13 (SEQ No. 13)獲得質(zhì)粒 pZLP15。將pZLB系列和pZLP系列質(zhì)粒在整合酶的作用下發(fā)生體外重組反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌，在含有IPTG和X-gal的抗性平板上生長，進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選。如果反應(yīng)發(fā)生，則呈現(xiàn)白色菌落；以此即可測算不同底物對之間的反應(yīng)效率。分析發(fā)現(xiàn)突變型和野生型底物參與 反應(yīng)效率相當(dāng)，均大于90%，且反應(yīng)嚴(yán)格發(fā)生在同種突變底物之間，沒有交叉反應(yīng)發(fā)生(附 圖1)。因此突變型底物對3 86/^ 6、3 813/^ 13、3 815/^ 15和野生型底物對3 8。/ attPQ可以組合應(yīng)用到同一反應(yīng)體系當(dāng)中，實現(xiàn)單因子(只需要ΦΒΤ1 integrase)催化下 的多片段串聯(lián)重組。2、用于基因敲除的整套入門載體的構(gòu)建。要實現(xiàn)基因打靶載體的快速串聯(lián)重組構(gòu)建，需要首先獲得相應(yīng)的入門載體 (EntryVectors)。包括一個可實現(xiàn)大腸桿菌-天藍(lán)色鏈霉菌穿梭的骨架載體，以及三個含 有突變底物對用于同源臂構(gòu)建和篩選的TA克隆載體。以限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒pHZ1358，獲得大小為9706bp的骨架片 段；該片段包含有青霉素抗性基因(bla)、大腸桿菌-鏈霉菌穿梭元件(oriT)、硫鏈絲菌素 抗性基因(tsr)和大腸桿菌及鏈霉菌復(fù)制起始位點(ori和rep)。以天藍(lán)色鏈霉菌基因組 為模板，以 primer 14 (SEQ No. 14)和 primer 15 (SEQ No. 15)擴(kuò)增大小為 460bp 的 DNA 片 段；以質(zhì)粒PCY104 為模板，以 primer 16 (SEQ No. 16)和 primer 17 (SEQ No. 17)擴(kuò)增大小為 1906bp的DNA片段；以該兩片段為模板，以引物primer 14 (SEQ No. 14)和primer 17 (SEQ No. 17)通過重疊PCR獲得大小為2346bp的DNA片段；將該片段連入pMD19_T載體，得到中 間質(zhì)粒 1。以質(zhì)粒 pIJ6021 為模板，以 primer 18 (SEQ No. 18)和 primer 19 (SEQ No. 19)擴(kuò) 增大小為550bp的DNA片段；以質(zhì)粒pSET152為模板，以primer 20 (SEQ No. 20)和primer 21 (SEQ No. 21)擴(kuò)增大小為927bp的DNA片段；以該兩片段為模板，以引物primerl8 (SEQ No. 18)和primer 21 (SEQ No. 21)通過重疊PCR獲得大小為1456bp的DNA片段；將該片段 連入pMD19-T載體，得到中間質(zhì)粒2。以限制性內(nèi)切酶NheI酶切中間質(zhì)粒1，以限制性內(nèi)切 酶XbaI酶切中間質(zhì)粒2，連接，即獲得質(zhì)粒T-Bxbatt 1-Bxbatt2 (SEQ No. 22)。以限制性內(nèi)切 酶NheI和BglII酶切質(zhì)粒T-Bxbatt 1-Bxbatt2，獲得大小為2049bp的DNA片段；該片段含 有氯霉素抗性基因(cat)，該基因兩側(cè)分別含有突變位點attPjP attB15。將分別從pHZ1358 和T-BXbattl-BXbatt2獲得的兩片段連接，即得到可實現(xiàn)大腸桿菌_天藍(lán)色鏈霉菌穿梭的 骨架載體 pFDZlOO (SEQ No. 23，附圖 2)。本發(fā)明還包括所述重組克隆骨架質(zhì)粒的相應(yīng)元件，包括質(zhì)粒復(fù)制起始位點、抗藥 性基因(完整或部分)、接合轉(zhuǎn)移起始位點以及位點特異性重組識別位點attB15和attP。。以質(zhì)粒PSET152為模板，用引物PTl (SEQ No. 24) ^PPTF(SEQ No. 25)擴(kuò)增得到兩側(cè) 分別帶有整合位點attB。和attP6的阿泊拉霉素抗性基因片段(aac (3) IV)，將該片段克隆到 PMD19-T載體上，即得到用于攜帶上游片段的載體pTA0006(SEQ No. 26，附圖3)；在整合位 點和抗性基因之間引入了一對限制性內(nèi)切酶XcmI的識別位點，酶切后，可以方便的通過TA 克隆的方式將同源片段插入到該載體(附圖3)。以同樣的方法獲得含有整合位點
attP13 的質(zhì)粒 pTA0613 (SEQ No. 27，附圖 4)，以及含有 BttB13 和 attP15 的質(zhì)粒 pTA1315 (SEQ No. 28，附圖 5)。3、上游和下游同源臂序列的擴(kuò)增和克隆。本發(fā)明示例中擬敲除Act生物合成基因簇中相關(guān)基因actl、actVII和actIV的 全部或部分，實現(xiàn)Act合成的中段。以天藍(lán)色鏈霉菌基因組為模板，用引物primer 22 (SEQ No. 29)和primer 23 (SEQ No. 30)擴(kuò)增得到含有actIII和actl部分基因的上游同源臂片段，將該片段插入到PTA0006中，獲得質(zhì)粒pTA0006-upstrearn ；以引物primer 24(SEQ No. 31)和primer25(SEQ No. 32)擴(kuò)增得到含有部分actVB基因的下游同源臂片段，插入到 PTA1315 中，獲得質(zhì)粒 pTA1315-downstream。4、體外一步重組克隆獲取最終基因敲除載體。為獲得較高的陽性克隆率，可將質(zhì)粒pTA0006-upstream、pTA0613和 pTAl315-downstream線性化；尤其是pTA0613，線性化至只含有阿泊拉霉素抗性基因 (aac (3) IV)和一對整合位點為佳。將適當(dāng)摩爾量的質(zhì)粒pTA0006-upstream、pTA0613、 pTA1315-downstream和pFDZlOO混合于統(tǒng)一體系中，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下由Φ BTl integrase催化發(fā)生串聯(lián)重組，重組反應(yīng)完成后，滅活整合酶并將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 陽性率不低于95%，即實現(xiàn)基因敲除載體的一步構(gòu)建。本發(fā)明涉及的質(zhì)粒pRT802[l)、pSET152[l]、pHZ1358[2]、pCY104[3]和 pIJ6021[4]相關(guān)信息見對應(yīng)參考文獻(xiàn)；質(zhì)粒pBC-SK(-)購于德國默克公司，pMD19_T購于 寶生物工程(大連)有限公司；pZLB00、pZLB06、pZLB13、pZLB15、pZLP00、pZLP06、pZLP13、 pZLP15、T-Bxbatt 1-Bxbatt2、pFDZlOO、pTA0006、pTA0613、pTA1315、pTA0006_upstream 禾口 pTA1315-downstream為本專利設(shè)計中構(gòu)建。


圖1 體外重組反應(yīng)及交叉反應(yīng)效率測算方法示意。以attBQ/attPQ、attB6/attP6 重組反應(yīng)和attBQ/attP6、attB6/attP0交叉反應(yīng)示意，白色菌落即為重組反應(yīng)發(fā)生，藍(lán)色菌 落示意未發(fā)生。圖2 大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pFDZlOO結(jié)構(gòu)圖。其中
圖譜標(biāo)注對應(yīng)基因或功能位置
權(quán)利要求
三對突變的φBT1整合酶識別的重組位點序列，其特征在于為attP6、attP13、attP15和attB6、xattB13、attB15位點，其序列依次如SEQ No.11、SEQ No.12、SEQ No.13以及序列SEQNo.3和SEQ No.4、SEQ No.5和SEQ No.6、SEQ No.7和SEQ No.8所示。
2.一種基于如權(quán)利要求1所述位點進(jìn)行相應(yīng)底物對重組及交叉反應(yīng)效率測定的方法， 其特征為將含有野生型或突變型位點質(zhì)粒進(jìn)行體外重組、轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及藍(lán)白斑篩選相纟口口。
3.—個重組克隆骨架質(zhì)粒，其特征在于為基于權(quán)利要求1所述的突變整合位點序列所 構(gòu)建，其序列如SEQ No. 14所示，記為pFDZlOO。
4.如權(quán)利要求3所述重組克隆骨架質(zhì)粒的相應(yīng)元件，其特征在于包括質(zhì)粒復(fù)制起始位 點、抗藥性基因、接合轉(zhuǎn)移起始位點以及位點特異性重組識別位點attB15和attP。。
5.如權(quán)利要求3所述重組克隆骨架質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下以限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切質(zhì)粒pHZ1358，獲得大小為9706bp的骨架片段；以 限制性內(nèi)切酶NheI和BglII酶切質(zhì)粒T-Bxbattl-Bxbatt2，獲得大小為2049bp的DNA片 段；將兩片段連接，即得到可實現(xiàn)大腸桿菌_天藍(lán)色鏈霉菌穿梭的骨架載體pFDZlOO。
6.基于權(quán)利要求1所述的突變整合位點序列所構(gòu)建的重組克隆入門質(zhì)粒，其特征在于 其序列為 SEQ No. 17,SEQ No. 18或SEQ No. 19所示，依次記為pTA0006、pTA0613和pTA1315。
7.如權(quán)利要求6所述質(zhì)粒的相應(yīng)元件，其特征在于包括質(zhì)粒復(fù)制起始位點、抗藥性 基因以及位點特異性重組識別位點，依次為attB。和attP6、attB6和attP13以及attB13和& Ρ^5 0
8.如權(quán)利要求6或7所述質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下以質(zhì)粒PSET152為模板，用引物PTl和PTF擴(kuò)增得到兩側(cè)分別帶有整合位點attB。和 attP6的抗性基因片段，將該片段克隆到PMD19-T載體上，即得到用于攜帶上游片段的載體 PTA0006 ；以同樣的方法獲得含有整合位點attBe* attP13的載體pTA0613，以及含有attB13 和BttP15的載體pTA1315 ；其中引物PTl的序列為SEQ No. 15，引物PTF的序列為SEQ No. 16 ；載體pTA0006的序列為 SEQ No. 17 ；載體 ρΤΑ0613 的序列為 SEQ No. 18，載體 ρΤΑ1315 的序列為 SEQ No. 19。
9.一種將同源臂片段克隆到入門載體的方法，其特征在于具體步驟為用限制性內(nèi)切 酶XcmI消化入門載體，以TA克隆的方式插入同源臂片段。
10.一種基于權(quán)利要求3、4、6或7所述質(zhì)粒，實現(xiàn)體外一步串聯(lián)重組構(gòu)建基因打靶載體 的方法，其特征在于具體步驟如下將適當(dāng)摩爾量的質(zhì)粒 pTA0006-upstream、pTA0613、pTA1315-downstream和 pFDZlOO 混 合于統(tǒng)一體系中，在合適的反應(yīng)條件下由ΦΒΤ1 integrase催化發(fā)生串聯(lián)重組，重組反應(yīng)完 成后，滅活整合酶并將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性率不低于95%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于φBT1整合酶及其突變識別位點的基因打靶載體快速構(gòu)建方法。本發(fā)明通過嚴(yán)格突變篩選和驗證，提供三對突變的整合酶識別序列，突變的底物對參與反應(yīng)效率與野生型相當(dāng)，且在同一體系中表現(xiàn)為不兼容。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建一整套相關(guān)載體，包括一個可實現(xiàn)大腸桿菌-天藍(lán)色鏈霉菌穿梭的骨架載體，以及三個含有突變底物對用于同源臂構(gòu)建和篩選的TA克隆載體，并提供四個DNA片段體外串聯(lián)重組反應(yīng)的具體方法。本發(fā)明方法簡單、快速并且高效，可用于鏈霉菌的基因打靶載體的構(gòu)建；并可通過相應(yīng)原件替換，廣泛用于不同物種基因打靶載體的快速構(gòu)建。
文檔編號C12N15/66GK101967475SQ20101019795
公開日2011年2月9日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者丁曉明, 張渤, 張霖, 趙國屏 申請人:復(fù)旦大學(xué)