鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法及其專(zhuān)用分子標(biāo)記和引物的制作方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法及其專(zhuān)用分子標(biāo)記和引物。該方法包括以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀：如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQ?ID?No.3的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番茄；如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQ?ID?No.3的DNA片段，所述待鑒定番茄為非抗晚疫病番茄；所述R2M1S由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的單鏈DNA組成?！緦?zhuān)利說(shuō)明】鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法及其專(zhuān)用分子標(biāo)記和引物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法及其專(zhuān)用分子標(biāo)記和引物?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]番茄屬于茄科植物，一年生或多年生。番茄染色體數(shù)2n=24，基因組約為950Mb。番茄由于具有風(fēng)味獨(dú)特、食用多樣、適應(yīng)性廣、容易栽培等特點(diǎn)，早已成為世界上重要的蔬菜作物。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，2010年世界番茄總產(chǎn)量達(dá)1.45億噸。隨著生產(chǎn)上長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)栽培，以及全球范圍的氣候的變化，番茄生產(chǎn)面臨越來(lái)嚴(yán)重的生物和非生物逆境的挑戰(zhàn)，同時(shí)消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)以及產(chǎn)品的多樣性的要求也越來(lái)越高。利用不斷發(fā)展的育種理論和技術(shù)，培育滿(mǎn)足生產(chǎn)和市場(chǎng)需求的優(yōu)良品種，是番茄育種的根本目的。從上世紀(jì)80年代后期開(kāi)始，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和基因工程技術(shù)為核心的生物育種技術(shù)得到了快速的發(fā)展。同時(shí)作為重要的模式植物，番茄在分子遺傳學(xué)、分子生理學(xué)、基因組學(xué)以及生物進(jìn)化領(lǐng)域等得到了廣泛而深入的研究。這一切共同推動(dòng)番茄育種比其他任何蔬菜作物都更早地進(jìn)入到了分子操作的新階段。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記的應(yīng)用得到廣泛推廣，分為形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記等表現(xiàn)型標(biāo)記和DNA片段標(biāo)記等基因型標(biāo)記。DNA片段標(biāo)記能夠直接反映生物個(gè)體或種群間基因組的某種差異，具有不受環(huán)境和基因表達(dá)的影響，而且具有數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。常用的分子標(biāo)記有基于Southern雜交的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)，基于PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增方法的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)，特定序列擴(kuò)增標(biāo)記(SCAR)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)，以及基于PCR與酶切相結(jié)合的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)、切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列標(biāo)記(CAPS)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。[0003]晚疫病由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起,是最具毀滅性的番爺田間病害之一。在有利病原菌生長(zhǎng)的條件下，晚疫病可以以驚人的速度蔓延，7至10天便可殺死宿主。由于近幾年番茄晚疫病的不`斷流行，挖掘抗番茄晚疫病的分子標(biāo)記也顯得越來(lái)越重要?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法及其專(zhuān)用分子標(biāo)記和引物。[0005]本發(fā)明提供了四種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法。[0006]本發(fā)明所提供的第一種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:[0007]如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番茄；[0008]如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番爺為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺;[0009]所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。[0010]本發(fā)明所提供的第二種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:[0011]如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番爺為抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番爺;[0012]如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番爺為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺。[0013]上述第二種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法中，所述檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段的方法為:以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段:[0014]如果所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄的基因組DNA中含有SEQIDN0.3的DNA片段；如果所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄的基因組DNA中不含有SEQIDN0.3的DNA片段；所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。[0015]本發(fā)明所提供的第三種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列和所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:[0016]如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番爺;[0017]如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺;[0018]所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.5所示的單鏈DNA和SEQIDN0.4所示的單鏈DNA組成。[0019]本發(fā)明所提供的第四種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:[0020]如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中既含有SEQIDN0.3的DNA片段也含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番茄；[0021]如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中既不含有SEQIDN0.3的DNA片段也不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為非抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番茄。[0022]上述第四種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法中，所述檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3和SEQIDN0.6的DNA片段的方法為以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄是否含有SEQIDN0.3和SEQIDN0.6的DNA片段:[0023]如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄含有SEQIDN0.3和SEQIDN0.6的DNA片段；如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄不含有SEQIDN0.3和SEQIDN0.6的DNA片段；[0024]所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.5所示的單鏈DNA和SEQIDN0.4所示的單鏈DNA組成。[0025]上述四種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法中，所述用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件可為55°C退火30s;和/或，所述用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件可為55°C退火30s。[0026]上述四種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法中，所述用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序可以是:94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min;所述用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增中采用的PCR反應(yīng)溫度程序可以是:94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min。[0027]上述方法可用于番茄育種、番茄抗晚疫病的早期預(yù)測(cè)和篩選抗晚疫病番茄。[0028]在番茄育種中，可選擇上述方法鑒定出的抗晚疫病番茄或候選抗晚疫病番茄進(jìn)行育種。[0029]本發(fā)明還提供了兩種鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的分子標(biāo)記。一種分子標(biāo)記是核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的DNA片段。另一種分子標(biāo)記是鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套DNA片段，由DNA片段I和DNA片段2組成，所述DNA片段I和所述DNA片段2獨(dú)立包裝；所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。[0030]上述鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套DNA片段中，DNA片段I和DNA片段2的摩爾比可為1:1。[0031]下述A1)_A4)中任一種產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0032]Al)鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的引物對(duì)，名稱(chēng)為R2M1S，所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。[0033]A2)含有Al)的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的試劑或試劑盒；[0034]A3)鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套引物對(duì)，由獨(dú)立包裝的R2M1S和M67-3組成，所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.4所示的單鏈DNA和SEQIDN0.5所示的單鏈DNA組成；[0035]A4)含有A3)的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的試劑或試劑盒。[0036]上述鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套引物對(duì)中，R2M1S和M67-3的摩爾比可為1:1。[0037]下述BI)-B4)中的任意一種用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0038]BI)上述任一種方法在番茄育種中的應(yīng)用；[0039]B2)上述任一種方法在番茄抗晚疫病性狀的早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用；[0040]B3)上述任一種方法在篩選抗晚疫病番爺中的應(yīng)用；[0041]B4)A1)_A4)中任一種產(chǎn)品在番爺育種中的應(yīng)用；[0042]B2)Al)-A4)中任一種產(chǎn)品在番茄抗晚疫病性狀的早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用；[0043]B3)Al)-A4)中任一種產(chǎn)品在篩選抗晚疫病番爺中的應(yīng)用。[0044]上文中，SEQIDN0.1由22個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQIDN0.2由20個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQIDN0.3由440個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQIDN0.4由18個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQIDN0.5由18個(gè)脫氧核苷酸組成，SEQIDN0.6由615個(gè)脫氧核苷酸組成。[0045]上文中，所述晚疫病具體由致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]生理小種Tl，2，4引起。[0046]上文中，所述抗晚疫病番茄是指晚疫病的病害等級(jí)<4的番茄品種或品系；所述非抗晚疫病番茄是指晚疫病的病害等級(jí)>4的番茄品種或品系。[0047]上文中，所述待鑒定番茄具體可為選自LA4084XCLN2037B的雜種后代，如LA4084XCLN2037B的F2及其以`后世代的株系。[0048]上文中，所述R2M1S中，SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA的摩爾比可為1:1。[0049]上文中，所述M67-3中，SEQIDN0.4所示的單鏈DNA和SEQIDN0.5所示的單鏈DNA的摩爾比可為1:1。[0050]實(shí)驗(yàn)證明，利用成套引物對(duì)(由獨(dú)立包裝的R2M1S和M67-3組成)和/或成套DNA片段(由DNA片段I和DNA片段2組成)對(duì)番茄育種群體進(jìn)行輔助選擇得到了抗晚疫病株系，利用引物對(duì)R2M1S和/或DNA片段I對(duì)番茄育種群體進(jìn)行輔助選擇得到了抗晚疫病株系，這表明由獨(dú)立包裝的R2M1S和M67-3組成的成套引物對(duì)和/或由DNA片段I和DNA片段2組成的成套DNA片段和/或引物對(duì)R2M1S和/或DNA片段I用于番茄抗花葉病毒育種的分子標(biāo)記輔助選擇是切實(shí)有效的，利用本發(fā)明進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可提高番茄抗晚疫病育種的選擇效率，加快育種進(jìn)程。【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0051]圖1為引物對(duì)R2M1S的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。[0052]圖1中，M為IOObpDNAladder,pi為父本CLN2037B，p2為母本LA4084，其余為L(zhǎng)A4084XCLN2037B的F2株系編號(hào)?！揪唧w實(shí)施方式】[0053]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0054]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0055]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0056]下述實(shí)施例中的番爺(Solanumlycopersicum)CLN2037B(AVRDCReportl999)在AsianVegetableResearchandDevelopmentCenter(AVRDC)的AccessionNumber是CLN2037B,公眾可從AVRDC獲得該生物材料。在下述實(shí)施例中簡(jiǎn)稱(chēng)CLN2037B。[0057]下述實(shí)施例中的番爺(Solanumlycopersicum)LA4084在TomatoGeneticsResourceCenter(TGRC)的AccessionNumber是LA4084,公眾可從TGRC獲得該生物材料。在下述實(shí)施例中簡(jiǎn)稱(chēng)LA4084。[0058]下述實(shí)施例中的致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]生理小種Tl，2，4(中國(guó)18省市番茄晚疫病菌生理小種的鑒定.園藝學(xué)報(bào)2004，31(6):758~761)公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。[0059]在以下的實(shí)施方案中，除非特別說(shuō)明，否則所有操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(黃培堂等譯，北京:科學(xué)出版社，2002)所提供的方法進(jìn)行。[0060]實(shí)施例1、鑒定LA4084XCLN2037B的F2株系的抗晚疫病性狀[0061]一、鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑[0062]本實(shí)施例的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑有兩種，分別是鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑A和鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑B0`[0063]本實(shí)施例的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑A由引物對(duì)R2M1S、引物對(duì)M67-3、10XTaq緩沖液，dNTP混合物，MgCl2溶液、TaqDNA聚合酶和ddH20組成。其中，引物對(duì)R2M1S和引物對(duì)M67-3單獨(dú)包裝，其摩爾比為1:1。[0064]本實(shí)施例的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑B由引物對(duì)R2M1S、IOXTaq緩沖液，dNTP混合物，MgCl2溶液、TaqDNA聚合酶和ddH20組成。[0065]其中，PCR引物對(duì)R2M1S由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:[0066]正向引物:5，-CGAGTTGCAACCTCTAGACTCA-3’(SEQIDN0.1),[0067]反向引物:5’-GGAAATCCTCCGCCTTACTT-3’(SEQIDN0.2)。[0068]其中，PCR引物對(duì)M67-3由正向引物和反向引物這兩條單鏈DNA組成，其序列如下:[0069]正向引物:5，-TGCGAATCCTTGTGGTAT-3，(SEQIDN0.4),[0070]反向引物:5，-CTTACTGTGGACTGTGGG-3’(SEQIDN0.5)。[0071]二、待鑒定番茄[0072]LA4084XCLN2037B的F2株系是按照如下方法獲得:LA4084(作為母本)和CLN2037B(作為父本)雜交，得到FpF1自交收獲F1植株所結(jié)的種子獲得F2的種子。隨機(jī)取F2的種子進(jìn)行種植，得到F2植株，取編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的F2植株分別進(jìn)行扦插繁殖，每個(gè)株系得到3株扦插株，得到編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的株系。[0073]三、鑒定晚疫病抗性[0074](一)溫室接種致病疫霉鑒定晚疫病抗性[0075]參照Chen等(CHIEN-HUACHEN,etal.PhenotypicandGenotypicChangesinthePhytophthorainfestansPopulationinTaiwan-1991to2006.J.Phytopathol157:248-255(2009))和Brouwer等(DouglasJ.Brouwer,ElizabethS.Jones,andDinaA.St.Clair.QTLanalysisofquantitativeresistancetoPhytophthorainfestans(lateblight)intomatoandcomparisonswithpotat0.Genome47:475-492(2004))方法進(jìn)行致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]生理小種Tl，2，4活體接種鑒定CLN2037B(株系編號(hào)為pi)、LA4084(株系編號(hào)為p2)、編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的株系對(duì)晚疫病抗性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次具體實(shí)驗(yàn)方法如下:將5片葉完全展開(kāi)的植株移到接種室內(nèi)適應(yīng)1-2天，接種室溫度調(diào)至20°C，每天12h光照12h黑暗。接種之前，給植株澆足水分，保證接種室的高濕環(huán)境。采用噴霧法進(jìn)行接種，致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)deBary]生理小種Tl,2,4菌液濃度為1000抱子囊/mL。接種時(shí)噴霧一定要均勻，保證各層葉片都能接上，噴菌液直至植株滴水為止。接種后24h內(nèi)，保證室溫20±2°C，黑暗，100%相對(duì)濕度，之后室溫不變，將濕度控制在60%-95%之間，光照12h。接種后第7天調(diào)查每一植株葉面積被害率(病斑面積占葉面積的百分?jǐn)?shù))，進(jìn)而鑒定每一植株的病害嚴(yán)重度，即單株病害等級(jí)。[0076]單株病害等級(jí):根據(jù)葉片發(fā)病情況，病情分為0-6級(jí)。O級(jí):無(wú)病癥；1級(jí):葉部病斑細(xì)小，葉面積被害率≤5%;2級(jí):葉部形成限制性病斑，5%<葉面積被害率≤15%;3級(jí):葉部有病斑，莖部無(wú)病斑，15%<葉面積被害率≤30%；4級(jí):莖部病斑少量，30%<葉面積被害率≤60%;5級(jí):莖部病斑擴(kuò)展型，60%<葉面積被害率≤90%；6級(jí):莖部嚴(yán)重受害，葉面積被害率>90%，甚至植株死亡。其中，0-4級(jí)為對(duì)晚疫病具有抗性，5-6級(jí)為對(duì)晚疫病敏感。[0077]溫室鑒定結(jié)果如表3和表4所示，表明株系編號(hào)為pl、l、2、3、4、6、7、9、10、ll、12、13、15、16、17、21、23、24、26、28、29、30和31的單株病害等級(jí)均小于4，是抗晚疫病番茄；株系編號(hào)為p2、5、8、14、18、19、20、22、25、27和32的單株病害等級(jí)均大于5，是非抗晚疫病番茄。[0078](二)利用鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑A、以及鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的PCR試劑B鑒定番茄的抗晚疫病性狀[0079]在步驟(一)編號(hào)為1-32的株系、LA4084(株系編號(hào)為p2)和CLN2037B(株系編號(hào)為Pl)的3葉期分別采集番茄葉片提取其基因組DNA，其中，編號(hào)為1-32的株系每個(gè)株系采集3株扦插株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA，LA4084采集3株植株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA，CLN2037B采集3株植株的葉片等質(zhì)量混合后提取基因組DNA。[0080]分別以提取的各個(gè)株系的基因組DNA為模板，利用引物對(duì)R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表1:[0081]表1.弓丨物對(duì)R2M1S的PCR擴(kuò)增體系[0082]【權(quán)利要求】1.鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番茄；如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番爺為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺；所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。2.鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番爺;如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番爺為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段的方法為:以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段:如果所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄的基因組DNA中含有SEQIDN0.3的DNA片段；如果所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，所述待鑒定番茄的基因組DNA中不含有SEQIDN0.3的DNA片段；所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。4.鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列和所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番爺;如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為非抗晚疫病番爺或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番爺;所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.4所示的單鏈DNA和SEQIDN0.5所示的單鏈DNA組成。5.鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段，按照下述方法確定所述待鑒定番茄的抗晚疫病性狀:如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中既含有SEQIDN0.3的DNA片段也含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x抗晚疫病番茄；如果所述待鑒定番茄的基因組DNA中既不含有SEQIDN0.3的DNA片段也不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄為非抗晚疫病番茄或?yàn)楹蜻x非抗晚疫病番茄。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述檢測(cè)待鑒定番茄的基因組DNA中是否含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段的方法為以待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用R2M1S進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；以所述待鑒定番茄的基因組DNA為模板，用M67-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，按照下述方法確定所述待鑒定番茄是否含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段:如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段；如果所述待鑒定番茄的所述R2M1S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.3的DNA片段，且所述M67-3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQIDN0.6的DNA片段，所述待鑒定番茄不含有SEQIDN0.3的DNA片段和SEQIDN0.6的DNA片段；所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.4所示的單鏈DNA和SEQIDN0.5所示的單鏈DNA組成。7.DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。8.鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套DNA片段，由DNA片段I和DNA片段2組成，所述DNA片段I和所述DNA片段2獨(dú)立包裝；所述DNA片段I的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。9.下述A1)_A4)中任·一種產(chǎn)品:Al)鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的引物對(duì)，名稱(chēng)為R2M1S，所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成。A2)含有Al)的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的試劑或試劑盒；A3)鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的成套引物對(duì)，由獨(dú)立包裝的R2M1S和M67-3組成，所述R2M1S由SEQIDN0.1所示的單鏈DNA和SEQIDN0.2所示的單鏈DNA組成；所述M67-3由SEQIDN0.4所示的單鏈DNA和SEQIDN0.5所示的單鏈DNA組成；A4)含有A3)的鑒定或輔助鑒定番茄抗晚疫病性狀的試劑或試劑盒。10.BI)-B4)中的任意一種用途:BI)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在番茄育種中的應(yīng)用；B2)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在番茄抗晚疫病性狀的早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用；B3)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法在篩選抗晚疫病番茄中的應(yīng)用；B4)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在番茄育種中的應(yīng)用；B2)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在番茄抗晚疫病性狀的早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用；B3)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品在篩選抗晚疫病番爺中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C12N15/11GK103849686SQ201410059173【公開(kāi)日】2014年6月11日申請(qǐng)日期:2014年2月21日優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日【發(fā)明者】劉磊,鄭崢,李君明,張春芝,李濤,杜永臣申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所