一種巧克力微桿菌磁性細胞及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種巧克力微桿菌磁性細胞及其制備方法和應(yīng)用，所述巧克力微桿菌磁性細胞，即首先制備殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、然后制備巧克力微桿菌的細胞懸浮液，最后將所得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料加入到的巧克力微桿菌細胞懸浮液中，控制溫度為30℃下，攪拌吸附10-600min即得巧克力微桿菌磁性細胞。該巧克力微桿菌磁性細胞用于催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4S,5R)-半酯,可以重復利用，并且重復利用10次后，巧克力微桿菌磁性細胞對底物生物素二甲酯的催化轉(zhuǎn)化率仍有70%以上。該巧克力微桿菌磁性細胞制備方法簡單，酶活回收率高，穩(wěn)定性好，可以在磁場中方便快速的回收和重復利用。
【專利說明】一種巧克力微桿菌磁性細胞及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種巧克力微桿菌磁性細胞及其制備方法和應(yīng)用，更具體地說是涉及一種利用殼聚糖-Fe3O4磁性納米顆粒固定巧克力微桿囷制備的巧克力微桿囷磁性細胞及其在催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)-半酯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞固定化是指利用化學或物理的手段將游離的細胞定位于有限空間區(qū)域并使其保持活性和可反復使用的一種基本技術(shù)。
[0003]相比于游離細胞而言，固定化細胞具有顯著的優(yōu)勢，例如固定化細胞能具有更高的穩(wěn)定性，可以重復利用，而且固定化方法較簡單，成本低。常用的固定化細胞的方法有包埋法、吸附法等。包埋法是通過一些有機或無機聚合物將菌體包裹在載體內(nèi)的一種方法，該方法的優(yōu)點是固定化效率高，但由于菌體被包裹造成傳質(zhì)阻力大，固定化細胞的催化效率較低。吸附法是利用載體與菌體表面之間的物理作用力，將菌體固定于載體表面，該方法的優(yōu)點是對菌體的活性回收率高，缺點是固定化效率不高，菌體與載體之間弱的作用力導致菌體易脫落而影響固定化細胞的重復利用率。
[0004]巧克力微桿菌所產(chǎn)的酯酶可以高立體選擇性的不對稱水解生物素中間體二甲酯，生成(4S，5R)-半酯。 但目前游離細胞的穩(wěn)定性較差，無法重復利用，限制了其工業(yè)用途。
[0005]運用磁性高分子微球作為結(jié)合細胞或酶的載體，具有以下優(yōu)點:①有利于固定化酶或細胞從反應(yīng)體系中分離和回收，操作簡便；②磁性載體固定化酶或細胞放入磁性穩(wěn)定地流化床反應(yīng)器中，可以減少持續(xù)反應(yīng)的操作，適合大規(guī)模持續(xù)化生產(chǎn)；③利用外部磁場可以控制磁性材料固定化酶或細胞的運動方式和方向，替代傳統(tǒng)的機械攪拌方式，提高固定化酶或細胞的催化效率。因此利用磁性材料固定細胞具有很好的應(yīng)用前景。申請公布號為CN103205413A的中國專利申請公開了一種碳-Fe3O4納米細胞固定材料并利用其固定巧克力微桿菌細胞，該材料是通過物理吸附的原理將細胞與磁性納米材料結(jié)合，能應(yīng)用于發(fā)酵液中細胞的分離。然而，單純通過物理吸附的方法得到的固定化細胞，細胞與材料的結(jié)合力較弱，穩(wěn)定性較低，在重復利用的批次反應(yīng)的過程中容易脫落而無法重復利用。
[0006]利用殼聚糖包裹四氧化三鐵制備的磁性納米材料具有性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好等優(yōu)點。截止到目前為止，尚未有利用該種材料固定化巧克力微桿菌細胞的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于為了解決上述的細胞與材料的結(jié)合力較弱，穩(wěn)定性較低，在重復利用的批次反應(yīng)過程中容易脫落而無法重復利用等技術(shù)問題而提供一種巧克力微桿菌磁性細胞。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供上述的一種巧克力微桿菌磁性細胞的制備方法。
[0009]本發(fā)明的目的之三在于將上述的一種巧克力微桿菌磁性細胞用于催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)-半酯。[0010]本發(fā)明的技術(shù)原理
首先制備一種帶有醛基的殼聚糖-Fe3O4磁性納米材料，該帶有醛基的殼聚糖-Fe3O4磁性納米材料的表面的醛基可以與細胞表面的氨基形成牢固的共價結(jié)合，因此可獲得穩(wěn)定性高的磁性細胞并用于多批次生物催化反應(yīng)。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如下步驟的方法制備而成: (1)、利用殼聚糖和Fe3O4磁性納米顆粒為原料制備殼聚糖包裹Fe3O4的磁性納米材料； 所述的殼聚糖包裹Fe3O4的磁性納米材料的制備過程如下:
首先，將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液中，待殼聚糖完全溶解后，加入Fe3O4顆粒，超聲混合均勻得到混合液；
然后，強烈攪拌下將所得的混合液分散于裝有液體石蠟和司班80的容器中，在40°C下攪拌30min后加入質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液，機械快速攪拌反應(yīng)4h后，即得殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品；
最后，用石油醚充分超聲洗滌所得的殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品，每次用磁鐵分離，并用丙酮洗滌脫水，再用乙醇和蒸餾水各洗滌3次，即得純化的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料；
因為上述所得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料本身含有一定量水，所以此時稱重即為殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重；
所述的殼聚糖、質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液、Fe3O4顆粒、液體石蠟、司班80和質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液的用量，按殼聚糖:質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液=Fe3O4顆粒:液體石蠟:司班80:質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液為0.2g:20ml:
0.2g:40ml:5ml:3ml 的比例計算；
所述的殼聚糖，其粘度為400-600mPa.s ；
(2)、培養(yǎng)巧克力微桿菌，然后將所得的細胞離心洗滌后重新懸浮于緩沖溶液中，獲得巧克力微桿菌細胞懸浮液；
所述的巧克力微桿菌為產(chǎn)酯酶的巧克力微桿菌SITlOl CGMCC N0.4436 ；
所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖溶液，其濃度為0.1M，pH為7.0 ;
(3)、將步驟(1)所得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料加入到步驟(2)所得的巧克力微桿菌細胞懸浮液中，控制溫度為30°C下，攪拌吸附10-600min，即得巧克力微桿菌磁性細胞；
所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞懸浮液的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為10~300g:IOg:1L的比例計算，優(yōu)選為150~300g:10g:1L。
[0012]利用上述的一種巧克力微桿菌磁性細胞催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)-半酯。催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)結(jié)束后的巧克力微桿菌磁性細胞經(jīng)磁場分離收集后即可用于下一批次催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解的反應(yīng)，即可實現(xiàn)巧克力微桿菌磁性細胞的重復利用，重復利用10次后，巧克力微桿菌磁性細胞對底物生物素二甲酯的催化轉(zhuǎn)化率仍有70%。
[0013]本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的一種巧克力微桿菌磁性細胞，由于在制備殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料過程中添加適量的戊二醛，使得制備獲得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料表面帶有一定量的游離醛基。殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料與巧克力微桿菌細胞表面的結(jié)合既有醛基的交聯(lián)作用又有吸附作用，這可以使得制備的巧克力微桿菌磁性細胞足夠的牢固而又對活性影響較小，使得巧克力微桿菌細胞內(nèi)酶活得到較好的保持。
[0014]進一步，本發(fā)明的一種巧克力微桿菌磁性細胞的制備方法，最終所得的一種巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率可達到100%，活力回收率達92%。在催化合成(4?，57?)-半酯的反應(yīng)中，連續(xù)使用10批次以上，巧克力微桿菌磁性細胞依然保持70%以上的活性，而巧克力微桿菌游離細胞只剩余10%活性。
[0015]本發(fā)明的一種巧克力微桿菌磁性細胞的制備方法，簡單易行，只需將殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料與巧克力微桿菌細胞在水溶液中混合吸附即可制得、巧克力微桿菌細胞的固定化率、活力回收率和穩(wěn)定性高的巧克力微桿菌磁性細胞，并且在制備過程中無需外加任何化學試劑。該磁性細胞只需外加磁場即可方便的分離，簡化了操作步驟。克服了傳統(tǒng)固定化方法活性回收率低或細胞容易脫落等問題，因此具有相當?shù)膽?yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1、巧克力微桿菌磁性細胞作為催化劑催化內(nèi)消旋二酯不對稱水解產(chǎn)生(4?，5/?)-半酯的反應(yīng)過程示意圖；
圖2、實施例2所得的巧克力微桿菌磁性細胞和實施例2中步驟(2)所得的巧克力微桿菌游離細胞在水相中連續(xù)10批次催化內(nèi)消旋二酯不對稱水解產(chǎn)生(4?，57?)-半酯的催化轉(zhuǎn)化率的曲線圖。
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例對本`發(fā)明進一步詳細描述，但并不限制本發(fā)明。
[0018]本發(fā)明所用的試劑皆為分析純或化學純規(guī)格。磁性納米Fe3O4顆粒來源于商品化的試劑公司。
[0019]本發(fā)明所用的巧克力微桿菌為產(chǎn)酯酶的巧克力微桿菌SITlOl (CGMCC N0.4436),關(guān)于該菌株的培養(yǎng)方法和產(chǎn)物(45； 57?)-半酯的分析方法參見中國專利“一種巧克力微桿菌及利用其制備(4?，57?)-半酯的方法，專利號:ZL 201010603789”。
[0020]本發(fā)明的巧克力微桿菌細胞的固定化率的計算公式如下:
AD= (AO-Al)/AOX100% ；
其中AD為巧克力微桿菌細胞的固定化率，AO為未加入殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料前巧克力微桿菌細胞緩沖溶液在600nm處的OD值，Al為加入殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料后獲得的巧克力微桿菌磁性細胞經(jīng)磁場分離后，上清液在600nm處測定的OD值。
[0021]實施例1
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如下步驟的方法制備而成:
(I)、殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的制備
將0.2g殼聚糖(粘度為400-600mPa.s)溶于20ml質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液中，待殼聚糖完全溶解后，加入Fe3O4顆粒0.2g，超聲20min混合均勻得到混合液；然后在40°C水浴中強烈攪拌下將所得的混合液分散于裝有40ml液體石蠟和5ml司班80的三口燒瓶中，攪拌30min后加入質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液3ml，機械攪拌反應(yīng)4h,即得殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品；
用石油醚充分超聲洗滌所得的殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品，每次用磁鐵分離，并用丙酮洗滌脫水，再用乙醇和蒸餾水各洗滌3次，得純化的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料；
因為上述所得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料本身含有一定量水，所以此時稱重即為殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重；
(2)、巧克力微桿菌細胞懸浮液的制備； 取 4°C保存的巧克力微桿菌 iMicrobacterium chocolaturn SITlOl, CGMCC N0.4436)斜面菌種，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30°C下，160rpm振搖培養(yǎng)48h，離心收獲巧克力微桿菌細胞；
然后將所得的上述巧克力微桿菌細胞置于緩沖溶液中，得巧克力微桿菌細胞的濃度為10g/L的巧克力微桿菌細胞懸浮液；
所述的培養(yǎng)基按每升計算，由葡萄糖15.0g,酵母膏5.0g,蛋白胨10.0g,MgSO4 Ig和余量的水組成，PH7.0 ；
所述的緩沖溶液為濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.0 ;
(3)、巧克力微桿菌磁性細胞的制備
取干重為0.1g的巧克力微桿菌細胞懸浮在IOmL磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L，pH7.0)中，加入濕重為2g的磁性殼聚糖Fe3O4納米材料，在室溫下攪拌4h，即得巧克力微桿菌磁性細胞溶液；
即上述所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為200g:10g:IL的比例計算。
[0022]用磁鐵吸附上述產(chǎn)生的巧克力微桿菌磁性細胞溶液，與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料結(jié)合的巧克力微桿菌細胞，即巧克力微桿菌磁性細胞會被吸附在磁鐵的附近，而未與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料結(jié)合的巧克力微桿菌細胞將會被轉(zhuǎn)移到洗滌液中，通過測定加入殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料前后巧克力微桿菌細胞在緩沖溶液中OD值的變化，計算巧克力微桿菌細胞的固定化率。通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為100%，酶活回收率達92%。
[0023]實施例2
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如實施例1所述的步驟的方法制備而成:只是步驟(3)中所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比和攪拌時間與實施例1不同，其它均同實施例1 ;
所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比:即所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為150g:10g:1L的比例計算；
攪拌時間為Ih。
[0024]其他同實施例1。[0025]通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為38.9%。
[0026]實施例3
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如實施例1所述的步驟的方法制備而成:只是步驟(3)中所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比和攪拌時間與實施例1不同，其它均同實施例1 ;
所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比:即所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為150g:10g:1L的比例計算；
攪拌時間為3h。
[0027]其他同實施例1。
[0028]通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為70.8%。
[0029]實施例4
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如實施例1所述的步驟的方法制備而成:只是步驟(3)中所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比和攪拌時間與實施例1不同，其它均同實施例1 ;
所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比:即所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞 的干重:磷酸鹽緩沖溶液為150g:10g:1L的比例計算； 攪拌時間為4h。
[0030]其他同實施例1。
[0031]通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為100%。
[0032]實施例5
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如實施例1所述的步驟的方法制備而成:只是步驟(3)中所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比和攪拌時間與實施例1不同，其它均同實施例1 ;
所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比:即所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、濃度為10g/L的巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為100g:10g:1L的比例計算；
攪拌時間為4h。
[0033]其他同實施例1。
[0034]通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為80.5%。
[0035]實施例6
一種巧克力微桿菌磁性細胞，具體通過包括如實施例1所述的步驟的方法制備而成:只是步驟(3)中所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比和攪拌時間與實施例1不同，其它均同實施例1 ;
所用的巧克力微桿菌細胞與殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的重量比:即所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為50g:10g:1L的比例計算；攪拌時間為4h。
[0036]其他同實施例1。
[0037]通過固定化率公式計算出巧克力微桿菌磁性細胞的固定化率為49.3%。
[0038]通過上述實施例2-6進行對比，可以看出，殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料與巧克力微桿菌細胞的重量比和攪拌時間對固定化率有顯著的影響，當殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重與巧克力微桿菌細胞的干重的比達到15:1以上，攪拌時間為4h，固定化率可以達到100%。
[0039]應(yīng)用實施例1
利用實施例2所得的巧克力微桿菌磁性細胞催化生物素二甲酯水解生成(4?，57?)-半酯，其催化水解反應(yīng)過程示意圖如圖1所示，其催化水解過程的具體步驟如下:
在2份IOmL磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L, pH 8.0)中，分別加入生物素二甲酯lOOmg，然后將實施例2最終所得的含有IOOmg干重巧克力微桿菌細胞的巧克力微桿菌磁性細胞、實施例2步驟(2)所得的IOOmg干重巧克力微桿菌游離細胞分別加入到IOmL上述含有底物的溶液中，控制溫度為40°C分別進行反應(yīng)24h，分別得到含有巧克力微桿菌磁性細胞的反應(yīng)液和含有巧克力微桿菌游離細胞的反應(yīng)液；
上述所得的含有巧克力微桿菌磁性細胞的反應(yīng)液通過磁鐵分離，上清液取樣后用HPLC測定(4?，57?)-半酯含量并計算轉(zhuǎn)化率，巧克力微桿菌磁性細胞用適量磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L, pH8.0)洗滌三次后用于下一批次巧克力微桿菌磁性細胞催化生物素二甲酯水解生成(4?，57?)-半酯的反應(yīng)，具體步驟同上，如此將巧克力微桿菌磁性細胞循環(huán)利用10次;每一次反應(yīng)結(jié)束后計算巧克力微桿菌磁性細胞催化生物素二甲酯水解生成(4?，5/?)-半酯的轉(zhuǎn)化率，其結(jié)果見圖2中的固定化細胞曲線所示；
上述所得的含有巧克力微桿菌游離細胞的反應(yīng)液`通過離心分離，上清液取樣后用HPLC測定(4?，57?)-半酯含量并計算轉(zhuǎn)化率，巧克力微桿菌游離細胞用適量磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L, pH 8.0)洗滌三次后用于下一批次巧克力微桿菌細胞催化生物素二甲酯水解生成(4?，57?)-半酯的反應(yīng)，具體步驟同上，如此將巧克力微桿菌游離細胞循環(huán)利用10次；每一次反應(yīng)結(jié)束后計算巧克力微桿菌游離細胞催化生物素二甲酯水解生成(4?，57?)-半酯的轉(zhuǎn)化率，其結(jié)果見圖2中的游離細胞曲線所示。
[0040]上述所得的含有巧克力微桿菌磁性細胞的反應(yīng)液和含有巧克力微桿菌游離細胞的反應(yīng)液中產(chǎn)物(4?，57?)-半酯含量的檢測方法為:
取離心分離后的上清液300μ L，加入600μ L甲醇，混勻后常溫，12000 rpm，離心IOmin，取上清液微孔濾膜過濾，高效液相色譜法分析。
[0041 ] 采用反相液相色譜分析，采用島津LC-20A液相色譜儀，色譜柱為C18柱，分析條件為流動相為甲醇:水=65:35，紫外檢測波長210nm，流速lml/min。
[0042]從圖2中可以看出，相對于巧克力微桿菌游離細胞而言，巧克力微桿菌磁性細胞具有更好的操作穩(wěn)定性。經(jīng)過5次重復使用后，巧克力微桿菌游離細胞的轉(zhuǎn)化率迅速下降，到反應(yīng)到第10批時，轉(zhuǎn)化率僅有10%左右，而此時巧克力微桿菌磁性細胞對底物生物素二甲酯的催化轉(zhuǎn)化率仍有70%。由此表明了本發(fā)明的一種巧克力微桿菌磁性細胞具有更高的操作穩(wěn)定性。
[0043]以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于 本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種巧克力微桿菌磁性細胞，其特征在于所述的巧克力微桿菌磁性細胞通過如下步驟的方法制備而成: (1)、利用殼聚糖和Fe3O4磁性納米顆粒為原料制備殼聚糖包裹Fe3O4的磁性納米材料； (2)、培養(yǎng)巧克力微桿菌，然后將所得的巧克力微桿菌細胞離心洗滌后重新懸浮于緩沖溶液中，獲得巧克力微桿菌細胞懸浮液； (3)、將步驟(1)所得的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料加入到步驟(2)所得的巧克力微桿菌細胞懸浮液中，控制溫度為30°C下，攪拌吸附10-600min，即得巧克力微桿菌磁性細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的巧克力微桿菌磁性細胞，其特征在于其制備過程步驟(1)所述的殼聚糖包裹Fe3O4的磁性納米材料的制備過程如下: 首先，將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液中，待殼聚糖完全溶解后，加入Fe3O4顆粒，超聲混合均勻后得到混合液； 然后，在強烈的攪拌下將所得的混合液分散于裝有液體石蠟和司班80的容器中，在40°C下攪拌30min后加入質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液，機械快速攪拌反應(yīng)4h后即得殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品； 最后，用石油醚充分超聲洗滌所得的殼聚糖包裹Fe3O4磁性納米材料粗品，每次用磁鐵分離，并用丙酮洗滌脫水，再用乙醇和蒸餾水各洗滌3次，即得純化的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料； 所述的殼聚糖、質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液、Fe3O4顆粒、液體石蠟、司班80和質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液的用量，按殼聚糖:質(zhì)量百分比濃度為5%的醋酸水溶液=Fe3O4顆粒:液體石蠟:司班80:質(zhì)量百分比濃度為25%的戊二醛水溶液為0.2g:20ml:0.2g:40ml:5ml:3ml 的比例計算； 所述的殼聚糖，其粘度為400-600mPa.S。
3.如權(quán)利要求1所述的一種巧克力微桿菌磁性細胞，其特征在于其制備過程步驟(2)中所述的巧克力微桿菌為產(chǎn)酯酶的巧克力微桿菌SITlOl CGMCC N0.4436 ； 所述的巧克力微桿菌細胞懸浮液的制備過程如下: 取 4°C保存的巧克力微桿菌 iMicrobacterium chocolaturn SITlOl, CGMCC N0.4436)斜面菌種，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在30°C下，160rpm振搖培養(yǎng)48h，離心收獲巧克力微桿菌細胞； 然后將上述所得的巧克力微桿菌細胞置于緩沖溶液中，即得細胞濃度為10g/L的巧克力微桿菌細胞懸浮液； 所述的培養(yǎng)基按每升計算，由葡萄糖15.0 g，酵母膏5.0 g,蛋白胨10.0 g, MgSO4 Ig和余量的水組成，PH7.0 ； 所述的緩沖溶液為濃度為0.1M的磷酸鹽緩沖溶液，pH為7.0。
4.如權(quán)利要求1所述的一種巧克力微桿菌磁性細胞，其特征在于其制備過程步驟(3)中所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞懸浮液的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4 磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為10~300g:10g:1L的比例計算。
5.如權(quán)利要求4所述的一種巧克力微桿菌磁性細胞，其特征在于所用的殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料、巧克力微桿菌細胞懸浮液的量，按殼聚糖包裹的Fe3O4磁性納米材料的濕重:巧克力微桿菌細胞的干重:磷酸鹽緩沖溶液為150~300g:10g:1L的比例計算。
6.如權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的一種巧克力微桿菌磁性細胞用于催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)-半酯。
7.如權(quán)利要求6所述的一種巧克力微桿菌磁性細胞用于催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)_半酯，其特征在于所述的巧克力微桿菌磁性細胞在水相中能連續(xù)10批次催化內(nèi)消旋二甲酯不對稱水解反應(yīng)生成(4?，57?)-半`酯的反應(yīng)。
【文檔編號】C12P17/10GK103756992SQ201410053836
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】徐毅, 陳建波, 周音卉, 鄭蒙蒙, 吳范宏, 朱勇剛, 吳小梅, 徐峰, 蒲強, 卞蒙璐, 周敏, 何梨梨 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學院