幽門(mén)螺桿菌活菌的定量測(cè)定、藥敏測(cè)定試劑盒及測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了幽門(mén)螺桿菌活菌的定量測(cè)定、藥敏測(cè)定試劑盒及測(cè)定方法，該方法采用活的幽門(mén)螺桿菌作為待測(cè)樣本，利用活的幽門(mén)螺桿菌能夠產(chǎn)生尿素酶這一特性，借助幽門(mén)螺桿菌菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法（CFU/ml，即每ml菌液中的細(xì)菌個(gè)體數(shù)量，菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線）能夠快速準(zhǔn)確讀取幽門(mén)螺桿菌的數(shù)量，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、可信度高，解決了現(xiàn)有幽門(mén)螺桿菌臨床微生物學(xué)鑒定因培養(yǎng)難，操作繁雜的計(jì)數(shù)難題，并且本發(fā)明擴(kuò)展的藥敏測(cè)定試劑盒和制備方法，能夠同時(shí)進(jìn)行多種藥敏試驗(yàn)，臨床醫(yī)生能快速方便篩選出合適的抗幽門(mén)螺桿菌藥物，省時(shí)省力，節(jié)約成本，為臨床科學(xué)治療提供了有益的技術(shù)解決方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】幽門(mén)螺桿菌活菌的定量測(cè)定、藥敏測(cè)定試劑盒及測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種幽門(mén)螺桿菌的測(cè)量方法及其試劑盒的制備方法，具體涉及一種方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏的幽門(mén)螺桿菌定量測(cè)量方法、其試劑盒以及改進(jìn)的抗幽門(mén)螺桿菌敏感藥物的快速篩選方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]1983年幽門(mén)螺桿菌pylori簡(jiǎn)稱(chēng)Hp)被澳大利亞的Warren和Warshail發(fā)現(xiàn)，已被確認(rèn)為最常見(jiàn)的慢性感染性疾病的病原之一。現(xiàn)階段臨床檢測(cè)Hp主要分為侵人性和非侵人性兩大類(lèi)，前者有胃鏡檢測(cè)、血清抗體檢測(cè)；后者有“C一UBT”檢測(cè)和幽門(mén)螺桿菌抗原的檢測(cè)，但是都存在檢測(cè)不方便、檢測(cè)有一定創(chuàng)傷和檢測(cè)滯后性等缺點(diǎn)。
[0003]幽門(mén)螺桿菌感染的檢查方法很多，主要包括細(xì)菌的直接檢查、尿素酶活性測(cè)定，但是上述方法均以定性檢測(cè)為主，并且采用的是死去的幽門(mén)螺桿菌，這樣就可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性等不準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，后果嚴(yán)重。
[0004]尿素酶活性測(cè)定的原理:Hp是人胃內(nèi)定植的唯一含尿素酶的細(xì)菌，因而可通過(guò)檢測(cè)尿素酶來(lái)診斷Hp感染，尿素酶分解胃內(nèi)尿素生成氨氣和二氧化碳，基于此原理發(fā)展了多種檢測(cè)方法:胃活檢組織尿素酶實(shí)驗(yàn)、呼吸試驗(yàn)、胃液尿素或尿素氮測(cè)定和15N-尿素試驗(yàn)。
[0005]胃活檢組織尿 素酶試驗(yàn)雖然有效又經(jīng)濟(jì)，但是病人需承受胃鏡檢查或者胃插管的痛苦。
[0006]酶呼吸試驗(yàn)簡(jiǎn)便易行，需要用13C或者14C同位素標(biāo)記尿素，讓病人口服標(biāo)記后的尿素，從而定性檢測(cè)Hp，但是13C為無(wú)放射性元素，測(cè)試儀器昂貴、收費(fèi)高，檢驗(yàn)程序復(fù)雜，14C相較而言更經(jīng)濟(jì)、更靈敏，但卻具有放射性，危害性大。
[0007]綜上，尿素酶活性測(cè)定現(xiàn)有檢測(cè)方法因?yàn)闀?huì)造成病人痛苦或者太貴或者傷害性高，并且還只能定性檢測(cè)Hp，可能存在假陽(yáng)性的診斷結(jié)果。
[0008]并且之前的檢測(cè)都是利用的是破壞幽門(mén)螺桿菌細(xì)胞，直接進(jìn)行DNA檢測(cè)，這種利用死去的幽門(mén)螺桿菌測(cè)試方法較為復(fù)雜繁瑣，也容易漏檢幽門(mén)螺桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]基于現(xiàn)在的檢測(cè)情況，本發(fā)明提供了一種采用活的幽門(mén)螺桿菌定量檢測(cè)方法，該方法采用活的幽門(mén)螺桿菌作為檢測(cè)樣本，利用活的幽門(mén)螺桿菌能夠產(chǎn)生尿素酶這一特性，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠快速準(zhǔn)確讀取幽門(mén)螺桿菌的數(shù)量而不用破壞幽門(mén)螺桿菌，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、可信度高，解決了現(xiàn)有技術(shù)只能定性、操作繁瑣，并且費(fèi)用昂貴、給病人帶來(lái)高傷害和痛苦、耗時(shí)費(fèi)力等問(wèn)題。并且本發(fā)明提供的藥敏試劑盒檢測(cè)方法，能夠同時(shí)進(jìn)行多種藥敏試驗(yàn)，快速方便，省時(shí)省力，節(jié)約成本，適宜臨床醫(yī)學(xué)的科學(xué)個(gè)性化治療。
[0010]為解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒，其制備方法為配置幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒:配置無(wú)菌尿素酶試劑；繪制OD值對(duì)應(yīng)的CFU/ml值即每ml菌液中的幽門(mén)螺桿菌菌體數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；用高分子材料的板孔或者玻璃材料的瓶子中加入或不加入幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基，封口作為反應(yīng)板孔；并配裝有OD值對(duì)應(yīng)的CFU/ml值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖卡和無(wú)菌尿素酶試劑。
[0011]一種幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法，包括以下步驟:配置幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒，將待檢樣本加入幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的板孔，或者加入幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的含幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基的板孔并按幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，再在含待檢驗(yàn)本和空白對(duì)照板孔中加入等體積的上述(I)所述無(wú)菌尿素酶試劑，在相同的孵育條件下孵育，在酶標(biāo)儀578-630nm處讀數(shù)，得到OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取活的Hp具體的CFU/ml數(shù)?？瞻讓?duì)照一般設(shè)置PBS溶液。
[0012]所述步驟(3)的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基為哥倫比亞培養(yǎng)基或布什肉湯等適宜幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中添加家畜血液成分；所述步驟(3)的待檢樣本為疑似幽門(mén)螺桿菌的食品、物品以及病人糞便、血液、分泌物；所述步驟(3)加入尿素酶試劑孵育的條件為溫度36-38°C，時(shí)間10-60min ;所述步驟(3)的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)條件為:溫度36_38°C的微需氧環(huán)境下培養(yǎng)72-96 h,微需氧環(huán)境為5%氧氣、85%氮?dú)狻?0% 二氧化碳。
[0013]所述待檢樣本和無(wú)菌尿素酶試劑體積均相同為10-1000微升。
[0014]所述無(wú)菌尿素酶試劑體積配比為:wt2%的尿素8-10份、wt 0.04%酚紅0.1-0.5份、wt 0.04%NaH2P04.H2O 3-5 份，wt 的 0.l%Na2HP04 2-3 份。
[0015]一種幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定試劑盒，將所述幽門(mén)螺桿菌活菌測(cè)定試劑盒中的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基添加抗生素，按配置幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的方法配置幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定試劑盒。 [0016]幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定方法，如幽門(mén)螺桿菌活菌測(cè)定方法進(jìn)行藥敏測(cè)定。每次加入不同抗生素的量均相等且為臨床上常用的添加的抗生素劑量。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明采用活的幽門(mén)螺桿菌進(jìn)行檢測(cè)，利用活的幽門(mén)螺桿菌能產(chǎn)生尿素酶的特性，通過(guò)檢測(cè)尿素酶的量來(lái)定量檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌，解決了現(xiàn)有技術(shù)僅能定性檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的不足；
(2)本發(fā)明具體的是基于尿素酶分解胃內(nèi)尿素生成氨氣和二氧化碳的原理，采用制備尿素酶試劑，通過(guò)吸收法檢測(cè)特定波長(zhǎng)的OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取相應(yīng)的CFU數(shù)，從而能夠定量檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌，方法簡(jiǎn)單、快速，可得定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，并且因?yàn)闄z測(cè)的活菌不需要提取DNA而直接進(jìn)行檢測(cè)，能夠節(jié)約操作步驟，同時(shí)試劑相對(duì)便宜，比其他方法更加經(jīng)濟(jì)有效省時(shí)省力；
(3)本發(fā)明還能測(cè)定不同藥物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的作用敏感性，在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶增添配置了藥敏測(cè)定試劑盒，利用該測(cè)定方法的藥敏測(cè)定試劑盒能夠同時(shí)進(jìn)行多種抗幽門(mén)螺桿菌藥物敏感性測(cè)定，能快速方便篩選出最適宜的抗幽門(mén)螺桿菌的敏感藥物。此操作簡(jiǎn)單、迅速，可減少抗生素濫用引起的耐藥和機(jī)體菌群失調(diào)，適宜臨床醫(yī)學(xué)的科學(xué)個(gè)性化治療。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面根據(jù)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
[0019]但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。[0020]實(shí)施例1
幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法
將 wt2% 的尿素 8-10 份、wt 0.04% 酚紅 0.1-0.5 份、wt 0.04%NaH2P04 ? H2O 3-5 份，wt的0.l%Na2HP04 2-3份配置成無(wú)菌尿素酶試劑。
[0021]繪制OD值對(duì)應(yīng)的CFU/ml值即每ml菌液中的細(xì)菌個(gè)體數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。OD值對(duì)應(yīng)的CFU的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)(菌落平板計(jì)數(shù))確定的，菌落平板計(jì)數(shù)具體操作簡(jiǎn)述如下:
將一定濃度的菌液按10倍梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩木喝?00微升涂板到培養(yǎng)基上，平行3個(gè)平板，培養(yǎng)72h后數(shù)菌落數(shù)，稀釋梯度直到平板上只有1-5菌落時(shí)為IO1菌液，再將梯度稀釋的菌液做快速尿素酶實(shí)驗(yàn)，測(cè)其OD值。
【權(quán)利要求】
1.一種幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒，其特征在于，其制備方法為:配置無(wú)菌尿素酶試劑；繪制OD值對(duì)應(yīng)的CFU/ml值即每ml菌液中的幽門(mén)螺桿菌菌體數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；用高分子材料的板孔或者玻璃材料的瓶子中加入或不加入幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基，封口作為反應(yīng)板孔；并配裝有OD值對(duì)應(yīng)的CFU/ml值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖卡和無(wú)菌尿素酶試劑。
2.—種幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟:將待檢樣本加入幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的板孔，或者加入幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的含幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基的板孔并按幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，再在含待檢驗(yàn)本和空白對(duì)照板孔中加入等體積的上述(I)所述無(wú)菌尿素酶試劑，在相同的孵育條件下孵育后，在酶標(biāo)儀578-630nm處讀數(shù)，得到OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀取活的Hp具體的CFU/ml數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟(3)的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基為哥倫比亞培養(yǎng)基或布什肉湯添加家畜血液成分；所述步驟(3)的待檢樣本為疑似幽門(mén)螺桿菌的食品、物品以及病人糞便、血液、分泌物；所述步驟(3)加入無(wú)菌尿素酶試劑孵育的條件為溫度36-38°C，時(shí)間10-35 min ;所述步驟(3)的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)條件為:溫度36-38°C的微需氧環(huán)境下培養(yǎng)72-96 h，微需氧環(huán)境為5%氧氣、85%氮?dú)狻?0%二氧化碳。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法，其特征在于，所述待檢樣本和無(wú)菌尿素酶試劑體積均相同為10-1000微升。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法，其特征在于，所述無(wú)菌尿素酶試劑體積配比 為:wt2%的尿素8-10份，wt 0.04%酚紅0.1-0.5份，wt 0.04%NaH2P04.H2O 3-5 份，wt 0.l%Na2HP04 2-3 份。
6.一種幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定試劑盒，其特征在于，其制備方法為:將權(quán)利要求1中所述的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基添加抗生素，按權(quán)利要求1所述的配置幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定試劑盒的方法配置幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定試劑盒。
7.幽門(mén)螺桿菌藥敏測(cè)定方法，其特征在于，如權(quán)利要求2-5所述的幽門(mén)螺桿菌活菌定量測(cè)定方法進(jìn)行藥敏測(cè)定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103757088SQ201410023375
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】祝潔, 周永君, 張勇 申請(qǐng)人:四川萬(wàn)可泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司