酵母展示脂肪酶生產乳香富硒藍莓醋的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶生產乳香富硒藍莓醋的方法，一方面將稻米脂肪酶展示在畢赤酵母表面，擴增培養(yǎng)48~96h，使稻米脂肪酶隨酵母產量大幅增加，以重量計將該展示了稻米脂肪酶的酵母菌1~4份（濕重）加入200-300份乳脂液中于35~55℃進行酯解反應2~6h后，過濾得到增香的乳液；另一方面以富硒藍莓和富硒酵母為基本原料采用半固態(tài)法生產出富含有機硒的藍莓醋，在此基礎上將增香乳和富硒藍莓醋按1：9~3：7（w/w）的比例混合制成受消費者喜愛的乳香富硒藍莓醋保健飲料；不但方便消費者安全高效補充人體必需微量元素硒，而且發(fā)揮了藍莓醋明目、美膚、抗衰老的保健作用。
【專利說明】酵母展示脂肪酶生產乳香富砸藍莓醋的方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及食品加工【技術領域】，尤其涉及一種利用酵母表面展示脂肪酶使脂肪酯解增香及富硒酵母生產出乳香富硒藍莓醋的方法。
【背景技術】
[0002]水果醋兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能，是集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的深受消費者喜愛的飲品；而藍莓被譽為“水果皇后”，近年來也出現了如公布號為CN2475343A的中國專利所公開的具有消除眼睛疲勞、營養(yǎng)皮膚、延緩衰老的藍莓醋。
[0003]硒是人體必需的微量元素，我國有72%地區(qū)屬缺硒或低硒地區(qū)，嚴重威脅著人們的身體健康，開發(fā)具豐富乳香和安全補充有機硒的藍莓醋飲料可有效緩解這種現象，而脂肪酶酯解脂肪及藍莓富硒、酵母富硒分別是增香富硒的有效手段。
[0004]目前，一方面脂肪酶由于穩(wěn)定性差、價格偏高，在我國主要依賴進口，而限制了脂肪酶的大規(guī)模使用，另一方面在稻米加工過程中，對脂肪酯解成中短鏈脂肪酸具有特異優(yōu)勢的稻米脂肪酶很難從稻米中分離出來，一直未能實際應用而被當作有害物遭滅酶鈍化而被廢棄。
[0005]近幾年，現代生物技術的飛速發(fā)展使得脂肪酶的開發(fā)利用達到一個新的水平階段，如博士論文(劉文山.脂肪酶在釀酒酵母中的表面展示研究[D]武漢，華中科技大學，2010)所述，酵母菌表面展示脂肪酶具有可提高脂肪酶的產量，在使用過程中不用分離純化等優(yōu)點，但并不能保證所有脂肪酶均能展示成功且具酶活性，也尚未見酵母成功展示稻米脂肪酶及其應用的報道。`
【發(fā)明內容】

[0006]目前，尚無利用畢赤酵母固定稻米脂肪酶酯解乳脂增香并利用富硒藍莓和富硒酵母制造乳香富硒藍莓醋的報道，本發(fā)明填補了該項空白。
[0007]本發(fā)明將一種對脂肪酯解成中短鏈脂肪酸具有特異優(yōu)勢的稻米脂肪酶DNA序列，綜合其它信息進行序列組合設計得序列SEQ NOl (如后附序列表)，委托生物公司進行序列合成和多個相關基因工程菌構建，然后通過驗證實驗，選定了巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白展示該稻米脂肪酶，將合成得到的基因克隆在PUC57載體上，進一步亞克隆到PPIC9K載體中，再轉化到酵母中在葡萄糖培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，最后通過檢測篩選，將擴增得到的表面展示有稻米脂肪酶的酵母液離心過濾后加入乳脂液中，使其發(fā)生酯解反應生成中短鏈脂肪酸，然后與富硒藍莓醋混合，在飲料調配和熱殺菌過程中進一步生成豐富的乳香并提高飲料的口感，同時又使無機硒通過藍莓或酵母轉化為能被人體安全利用的有機硒。
[0008]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖1。[0010]圖2為瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖2。
[0011]圖3為本發(fā)明生產工藝示意圖。
[0012]實施例1
一、畢赤酵母展示稻米脂肪酶
1、Rlipase基因合成委托生物公司(本例由南京金斯瑞生物科技有限公司)完成，基因克隆在pUC57載體上(pUC57-Rlipase)，DNA序列如SEQl所示。
[0013]2、Rlipase亞克隆到pPIC9K載體中
分別將pUC57-Rlipase和pPIC9K載體進行Eco RI和Not I雙酶切，酶切反應體系分別如下:
pUC57-Rlipase 質粒 34 ml 10* buffer4 ml
Eco RII ml
Not II ml
總共40ml體系， pPIC9K 質粒6 ml
10* buffer2 ml` Eco RII ml
Not II ml
ddH2010 ml
總共20 ml體系，
分別混勻后放在37°C水浴鍋中反應4 h，之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖1所示。
[0014]3、采用膠回收試劑盒回收目的基因片斷Rlipase和pPIC9K載體片斷，分別用20ml水洗脫，
之后用T4 DNA Ligase進行連接反應，反應體系如下:
Rlipase 片段3ml
PPIC9K 片段I ml
10* T4 Ligase buffer2 ml
T4 LigaseI ml
ddH2013 ml
總共20 ml體系；22°C過夜連接，之后轉化到DH5a感受態(tài)細胞中，涂布在含有amp和kana 抗性的 LB (Miller broth (l%NaCl):1% peptone, 0.5% yeast extract, and 1%NaCl)固體培養(yǎng)基上進行37°C過夜培養(yǎng)；挑取克隆進行搖菌，質粒抽提，并進行Eco RI和Not I雙酶切鑒定。酶切反應體系如下:
pPIC9K- Rlipase8 ml
10* buffer2 ml
Eco RII ml
Not II ml
ddH208 ml總共20 ml體系，
混勻后放在37°C水浴鍋反應4 h，之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功構建了pPIC9K-Rlipase載體，電泳圖如圖2所示。
[0015]4、pPIC9K-Rlipase 轉化到畢氏酵母 GS115 中 I)、試劑
(1)IM LiCl:用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌；
(2)50% PEG3350 =Sigma P3640用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝；
(3)2 mg/ml salmon sperm DNA / TE (IOmM Tris-Cl, ρΗ8.0，1.0mM EDTA)_2(TC保存；注:醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用。
[0016]2)、畢氏酵母的轉化
Cl)煮沸I ml鮭魚精DNA 5 min，迅速冰浴以制備單鏈擔體DNA ；
(2)將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；
(3)對于每一個轉化，按以下順序加入:
50% PEG3350240 ml
1M LiCl36 ml
2mg/ml 單鏈 Salmon sperm DNA25 ml 5 ~10 mg/50ul H2O 質粒 DNA 50 ml
(4)劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻(約Imin)；
(5)30°C水浴孵育30 min ; (6) 42°C水浴熱休克20~25 min ；
(7)6000~8000 rpm離心收集酵母菌體；
(8)重懸酵母于ImlYH)培養(yǎng)基(1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，30°C搖床孵育；
(9)I~4 h后，取25~100 ml菌液鋪YD選擇性培養(yǎng)基平板(1.67%YNB+2%葡萄糖+1%瓊脂粉)，于30°C培養(yǎng)2~3天鑒定(將表達菌株和對照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)至轉化子出現)。
[0017]3)備注:
(1)YNB從化學試劑商店訂購，其配方為:YNB IL含:維生素:生物素類:2 mg，尼克酸:400 mg,鹽酸硫銨:400 mg,葉酸:2 mg,肌醇:2000 mg,對氨基苯甲酸:200 mg,核黃素:200mg，泛酸鈣:400 mg，鹽酸吡哆醇:400 mg ;微量元素:括號內表示所含微量元素，硼酸(B):500 mg,硫酸銅(Cu):40 mg,碘化鉀:100 mg,氯化鐵(Fe):200 mg,硫酸猛(Mn):400 mg,.酸鈉(Mo):200 mg,硫酸鋅:400 mg ;大量元素:括號內表示所含大量元素,硫酸鎂(Mg):0.5g，氯化鈉(Na):0.1g,磷酸二氫鉀(K):lg ;硫酸銨(N):5g,可溶性氯化鈣:0.1g ；
(2)GS115是組氨酸缺陷性菌，因此在YD培養(yǎng)基上不能生長，只有成功轉化了 PPIC9K的GSl 15菌才能在YD培養(yǎng)基上生長。
[0018]4)擴增培養(yǎng):
(1)、從平板中挑取單菌落，接種于Yro培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)過夜；
(2)測0D_，取適量菌液，離心，棄凈上清，沉淀物用無菌水洗滌一次，然后轉接于25mL葡萄糖培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB (amino free), 10 mL/100 mL I M磷酸鹽緩沖液，2%葡萄糖)，使初始OD6tltl約為I，30°C，250 rpm發(fā)酵96 h，每隔24 h取樣，于第24 h和48 h補加葡萄糖混合液500 μ L (該混合液由葡萄糖和I M K2HPO4混合組成，甘油和現1(2即04各占50%(￥八)，1151:高壓滅菌20 min);然后轉接到發(fā)酵罐5 L全自動發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)即可。
[0019]二、富硒藍莓醋的制作
1、原料處理:富硒藍莓(含硒29 ng/g)經自來水洗凈后，放入榨汁機中榨碎，所得漿液收集，加入0.2%的果膠酶制劑，混勻，在48°C條件下酶解3 h，用蔗糖調整糖度至11.5%，煮沸滅菌15 min,室溫下密封保存?zhèn)溆谩?br> [0020]2、酒精發(fā)酵:將釀酒干酵母以10%的濃度加入5%的蔗糖溶液中，攪拌均勻，放入恒溫培養(yǎng)箱中活化，溫度控制在28°C，時間為2 h;將活化的富硒酵母(含硒2 mg/g)接種到果漿中，接種量為10%，發(fā)酵溫度28 - 30°C，時間120-144 h，酒精度大約達到7.5%左右，可進入醋酸發(fā)酵階段。
[0021]3、醋酸發(fā)酵:用富硒酵母膏(含硒2 mg/g)，碳酸鈣，瓊脂，葡萄糖制成的培養(yǎng)基對醋酸菌進行接種，在28-30°C下培養(yǎng)48h，再移入三角瓶中振蕩擴培；將經過酒精發(fā)酵后果漿接入醋酸菌培養(yǎng)液，在發(fā)酵罐中進行醋酸發(fā)酵，醋酸菌接種量為7%-11%，溫度是26-34°C，酒精度控制在6.5~8.5%之間，發(fā)酵時間132~156 h。
[0022]4、加鹽后熟:經醋酸發(fā)酵后，加入適量(2~3%)食鹽。
[0023]5、過濾:200目篩網過濾雜質，即得富硒藍莓醋(含硒18.22 ng/g)。
[0024]三、乳 香富硒藍莓醋的調配
如圖3所示按重量將10%的增香乳液和90%的富硒藍莓醋一配兌調整一在醋液中加入0.1%的苯甲酸鈉一包裝滅菌一即得成品醋。
[0025]實施例2乳香富硒藍莓醋的調配
一、畢赤酵母展示稻米脂肪酶:同實施例1。
[0026]二、富硒藍莓醋的制作:同實施例1。
[0027]三、乳香富硒藍莓醋的調配
如圖3所示按重量將20%的增香乳液和80%的富硒藍莓醋一配兌調整一在醋液中加入0.1%的苯甲酸鈉一包裝滅菌一即得成品醋。
[0028]實施例3乳香富硒藍莓醋的調配
一、畢赤酵母展示稻米脂肪酶:同實施例1。
[0029]二、富硒藍莓醋的制作:同實施例1。
[0030]三、乳香富硒藍莓醋的調配
如圖3所示按重量將30%的增香乳液和70%的富硒藍莓醋一配兌調整一在醋液中加入
0.1%的苯甲酸鈉一包裝滅菌一即得成品醋。
【權利要求】
1.一種酵母展示脂肪酶生產乳香富硒藍莓醋的方法，其特征在于:以重量計將增香乳與富硒藍莓醋以1:9~3:7的比例混合制成；其中，增香乳由展示了稻米脂肪酶的畢赤酵母菌I~4份(濕重)加入100-300份乳脂液(含脂肪20~40% (w/w))中于35~55°C下對脂肪進行酯解反應2飛h后過濾制成，富硒藍莓醋由富硒藍莓和富硒酵母經半固態(tài)發(fā)酵法制得；而展示了稻米脂肪酶的畢赤酵母菌是這樣制作的:將含稻米脂肪酶的組合序列SEQ NOl人工合成，然后將合成得到的基因克隆在PUC57載體上，進一步亞克隆到PPIC9K載體中，再轉化到畢赤酵母(Pichia Pastoris) GS115，得到展示了稻米脂肪酶的畢赤酵母，然后在葡萄糖培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)48、6 h，使稻米脂肪酶產量隨酵母菌的增殖大幅增加。
2.一種如權利要求1所述的酵母展示脂肪酶生產乳香富硒藍莓醋的方法，其特征在于:加入乳脂液增香的表面展示有稻米脂肪酶的畢赤酵母菌在酯解反應后，其酵母展示脂肪酶經過濾和沖洗后可重復使用。
3.根據權利要求1所述的酵母展示稻米脂肪酶生產乳香富硒藍莓醋，其特征在于，將其制成口服液。
【文檔編號】C12J1/04GK103756866SQ201410020642
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2014年1月17日
【發(fā)明者】謝定, 朱婧, 盛敏, 焦玲, 劉瑞興, 李曉文, 謝易真 申請人:長沙理工大學