植物中雄性育性的遺傳減少的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了遺傳雄性不育植物，在所述遺傳雄性不育植物中補(bǔ)充構(gòu)建體從而產(chǎn)生對所述子代中的親本表型的抑制。提供了產(chǎn)生和保持此類植物的方法以及使用所述植物的方法，包括使用親本植物以產(chǎn)生不育植物以用于雜交種子生產(chǎn)。
【專利說明】植物中雄性育性的遺傳減少
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求提交于2012年3月13日的美國臨時(shí)專利申請61/610,266、提交于 2013年3月12日的PCT申請PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12日的PCT申請 PCT/US2013/30455的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其公開內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明整體涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地講涉及植物育性的調(diào)節(jié)以改善植物脅迫 耐性。
[0004] 背景
[0005] 許多植物的馴化已與產(chǎn)量顯著增加相關(guān)。天然群體中發(fā)生的大多數(shù)表型變異是連 續(xù)的并且受多種基因影響的作用。對造成馴化植物中產(chǎn)量顯著不同的特定基因的鑒別已成 為農(nóng)業(yè)研究的重要焦點(diǎn)。
[0006] 植物在發(fā)育生命周期期間在各種植物組織間分配光合產(chǎn)物、礦質(zhì)營養(yǎng)和其他生長 組分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗絲為共享某些發(fā)育過程并且相互競爭所需營養(yǎng)物質(zhì)的特定 雌性和雄性花序結(jié)構(gòu)。穗絲頂端優(yōu)勢可限制玉蜀黍植物中的穗生長和谷粒產(chǎn)量潛力，本文 公開了改善谷粒產(chǎn)量的方法和組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] -種用于在植物中增加產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，該方法包括減少雄性育 性，從而在雄性和雌性組織同時(shí)發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。在一個實(shí) 施例中，通過改變遺傳雄性育性基因的表達(dá)或活性來減少植物中的雄性育性。在一個實(shí)施 例中，植物在非生物脅迫下生長。在一個實(shí)施例中，營養(yǎng)物質(zhì)限定為氮。在一個實(shí)施例中， 具有減少的雄性育性的植物具有選自如下的農(nóng)學(xué)參數(shù)：增大的SPAD值、增加的抽穗絲、增 加的穗長度、增加的穗寬度、增加的每個穗的種子數(shù)、增加的每個穗的種子重量和具有增加 的胚尺寸的種子。在一個實(shí)施例中，植物在干旱脅迫下生長。在一個實(shí)施例中，通過雄性不 育來改善植物的耐旱性。
[0008] -種用于增加玉蜀黍植物中的產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，該方法包括減少雄 性育性，從而在雄性和雌性組織同時(shí)發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。在一 個實(shí)施例中，植物包含導(dǎo)致顯性遺傳雄性不育的核基因中的突變。
[0009] 在一個實(shí)施例中，本文公開的植物的雄性育性通過表達(dá)編碼SEQ ID N0 :14或153 的多肽的多核苷酸而減少。在一個實(shí)施例中，多核苷酸選自SEQ ID N0 :13、15和152。
[0010] 在一個實(shí)施例中，雄性育性在選自 SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的調(diào)控元件下通過表達(dá)抑制穗絲的核酸而減少。
[0011] 在一個實(shí)施例中，雄性育性在選自 SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和150的調(diào)控元件下通過表達(dá)核酸而減少，所述核酸抑制編碼SEQ ID NO :107的氨基酸序 列的多核苷酸的表達(dá)。
[0012] 在一個實(shí)施例中，雄性育性通過表達(dá)編碼多肽的核酸而減少，所述多肽具有對應(yīng) 于SEQ ID N0:14的第37位氨基酸的突變，其中多肽選自SEQ ID N0:14、108-130。在一個 實(shí)施例中，突變導(dǎo)致信號肽的不當(dāng)加工。
[0013] 在一個實(shí)施例中，表現(xiàn)出減少的雄性育性的植物為玉蜀黍非轉(zhuǎn)基因植物。在一個 實(shí)施例中，雌性組織發(fā)育為玉蜀黍中的穗發(fā)育。
[0014] 在一個實(shí)施例中，導(dǎo)致減少的雄性育性的突變在植物的內(nèi)源育性基因中進(jìn)行改 造。
[0015] 一種在具有第一玉蜀黍植物群體的田地中增加玉蜀黍產(chǎn)量的方法，該方法包括在 田地中栽培玉蜀黍植物群體，其中玉蜀黍植株由于存在包含SEQ ID N0 :14或其同系物的氨 基酸序列的多肽而表現(xiàn)出顯性雄性不育，并且其中所述田地還包含第二玉蜀黍植物群體， 所述第二玉蜀黍植物群體產(chǎn)生有效量的花粉以使田地中的第一玉蜀黍植物群體受精，從而 相較于不包含第一植物群體的對照田地產(chǎn)量增加。在一個實(shí)施例中，第一植物群體包括田 地中玉蜀黍植株的約50%至約90%。在一個實(shí)施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植 株的約80%。在一個實(shí)施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的約75%。在一個實(shí) 施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的約85 %。在一個實(shí)施例中，第一植物群體包 括田地中玉蜀黍植株的約70%。在一個實(shí)施例中，第一植物群體包括田地中玉蜀黍植株的 約95 %。在一個實(shí)施例中，所得的子代是可育的。
[0016] 在田地中生長的玉蜀黍植物群體，其中玉蜀黍植物群體包括具有減少的雄性育性 的第一亞群體和表現(xiàn)出正常的雄性育性的第二亞群體，其中所述玉蜀黍植物群體產(chǎn)生與對 照植物群體相比增加的谷粒產(chǎn)量。在一個實(shí)施例中，種子由玉蜀黍植株產(chǎn)生，其中所述種子 產(chǎn)生可育的植株。
[0017] 一種具有多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發(fā)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄并且 包括選自如下的序列：
[0018] a. SEQ ID N0 :13 和 62、SEQ ID N0 :64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的 啟動子區(qū)；
[0019] b. SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149 和 150 的至少 100 個連 續(xù)核苷酸；以及
[0020] c.與 SEQ ID N0 :13、62、64-106、134、137、142、143、144、149和150的全長具有至 少70%序列同一性的核苷酸序列。
[0021] 表達(dá)盒具有引發(fā)如本文所公開的轉(zhuǎn)錄并且可操作地連接到目的多核苷酸的多核 苷酸。在一個實(shí)施例中，載體包括本文所述的表達(dá)盒。在一個實(shí)施例中，植物細(xì)胞已將本文 所述的表達(dá)盒穩(wěn)定摻入到其基因組中。在一個實(shí)施例中，植物細(xì)胞來自單子葉植物。在一 個實(shí)施例中，單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸麥、高粱或水稻。
[0022] 在一個實(shí)施例中，包括已將本文所述的表達(dá)盒穩(wěn)定摻入到其基因組中的植物。在 一個實(shí)施例中，植物為單子葉植物。在一個實(shí)施例中，植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸 麥、高粱或水稻。
[0023] 公開了本文所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子。在一個實(shí)施例中，公開了編碼基因產(chǎn)物的 多核苷酸，所述基因產(chǎn)物賦予病原體或昆蟲抗性。
[0024] 在一個實(shí)施例中，植物還包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽涉及營養(yǎng)物質(zhì)吸收、 氮利用效率、耐旱性、根強(qiáng)度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、碳水化合物代謝、 蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成。
[0025] -個單位玉蜀黍種子，其包括一部分為轉(zhuǎn)基因的雄性不育種子和一部分為轉(zhuǎn)基因 的雄性可育種子，其中雄性不育轉(zhuǎn)基因種子與該單位中總玉蜀黍種子的比例在約50%至約 95%的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施例中，一個單位為一袋玉蜀黍種子。
[0026] 玉蜀黍種子的種子混合物，其包括一部分為轉(zhuǎn)基因的雄性不育種子和一部分為轉(zhuǎn) 基因的雄性可育種子，其中雄性不育轉(zhuǎn)基因種子與該單位中總玉蜀黍種子的比例在約50% 至約95%的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施例中，種子混合物在一袋玉蜀黍種子中。在一個實(shí)施例中， 雄性不育種子在單獨(dú)的袋中。在一個實(shí)施例中，雄性不育種子與雄性可育種子在相同的袋 中混合。
[0027] 在一個實(shí)施例中，雄性育性基因編碼SEQ ID N0 :10的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施例中， 雄性育性基因包括SEQ ID N0:13的核苷酸序列。在一個實(shí)施例中，雄性育性基因編碼SEQ ID N0 :14的多肽。
[0028] 在一個實(shí)施例中，雄性育性的減少或使植物雄性不育通過在相對于SEQ ID N0 :13 的第一 Met密碼子的第118位從G變?yōu)锳的單個核苷酸置換來實(shí)現(xiàn)，得到在第37位氨基酸 處的氨基酸改變，在預(yù)測的蛋白質(zhì)中從丙氨酸變?yōu)樘K氨酸。在一個實(shí)施例中，雄性育性的減 少或使植物雄性不育通過在相對于SEQ ID NO :2629的第一 Met密碼子的第119位從C變 為T的單個核苷酸置換來實(shí)現(xiàn)，得到在第37位氨基酸處的氨基酸改變，在預(yù)測的蛋白質(zhì)中 從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸。在一個實(shí)施例中，顯性雄性育性基因可操作地連接到選自如下的啟 動子：誘導(dǎo)型啟動子、組織優(yōu)選的啟動子、時(shí)間調(diào)節(jié)型啟動子或它們的元件。例如，啟動子優(yōu) 先地驅(qū)動雄性生殖組織中的表達(dá)。
[0029] 在一個實(shí)施例中，雄性育性在育種對的雌性植物（例如，雌性自交系）中減少。
[0030] 在一個實(shí)施例中，一種植物或細(xì)胞或種子或它們的子代，其包括減少的編碼其基 因組中的SEQ ID N0 :10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中該雄性育性 基因的表達(dá)賦予顯性雄性不育性狀。
[0031] 分離的核酸分子包括能夠引發(fā)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸并且包括選自如下 的序列：SEQ ID NO :15、SEQ ID N0 :15的至少100個連續(xù)核苷酸，以及與SEQ ID N0 :15的 全長具有至少70%序列同一性的序列。在一個實(shí)施例中，表達(dá)盒或載體包括本文公開的可 操作地連接到目的多核苷酸的SEQ ID N0 :15。
[0032] 適用于本文公開的材料和方法的植物包括，例如，玉米、高粱、卡諾拉油菜、小麥、 大麥、裸麥、黑小麥、水稻、甘蔗、草坪草、珍珠粟、大豆、棉花。
[0033] 在一個實(shí)施例中，具有減少的育性或本文公開的任何其他性狀的植物任選地具有 賦予以下目的表型或性狀的一種或多種多核苷酸：營養(yǎng)物質(zhì)吸收、氮利用效率、耐旱性、根 強(qiáng)度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、除草劑耐性、抗病性、昆蟲抗性、碳水化合 物代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成。
[0034] 一種在植物中增加產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括通過如下方式減少雄性生 殖組織發(fā)育：在雄性生殖組織優(yōu)選的啟動子的控制下表達(dá)轉(zhuǎn)基因；以及在雄性和雌性組織 同時(shí)發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0035] 在一個實(shí)施例中，雄性生殖組織為穗絲。在一個實(shí)施例中，雄性生殖組織發(fā)育通過 表達(dá)可操作地連接到啟動子的基因而減少，所述啟動子包括選自列表SEQ ID NO :64-106的 序列的至少100個連續(xù)核苷酸。本文公開的啟動子序列的子集，例如，SEQ ID NO :64-70、 70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同樣適用于驅(qū)動本文公開的目的多核苷酸的組織優(yōu)選 的表達(dá)。
[0036] 在一個實(shí)施例中，在本文公開的穗絲優(yōu)選的啟動子的控制下轉(zhuǎn)基因地表達(dá)目的多 核苷酸（例如，具有顯性雄性不育突變的Ms44)的植物或植物細(xì)胞或種子表現(xiàn)出改善的農(nóng) 學(xué)參數(shù)，諸如在生殖發(fā)育期間增加分配至穗的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0037] -種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發(fā)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄并且 包括選自如下的序列：
[0038] 選自 SEQ ID NO :64-106 的序列；
[0039] 選自SEQ ID NO :64-106的序列的至少100個連續(xù)核苷酸，以及
[0040] 與選自SEQ ID NO :64-106的序列的全長或與其子啟動子區(qū)具有至少70%至約 95 %序列同一性的序列。
[0041] 在一個實(shí)施例中，在本文公開的穗絲優(yōu)選的啟動子的控制下轉(zhuǎn)基因地表達(dá)目的多 核苷酸（例如，靶向涉及穗絲發(fā)育的多核苷酸的RNAi抑制序列）的植物或植物細(xì)胞或種子 表現(xiàn)出改善的農(nóng)學(xué)參數(shù)，諸如在生殖發(fā)育期間改善的分配至穗的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0042] 一種在植物中增加產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括減少雄性育性，并且在雄 性和雌性組織同時(shí)發(fā)育期間增加分配至雌性生殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。在一個實(shí)施例中，通過 改變遺傳雄性育性基因的表達(dá)來減少植物中的雄性育性。在一個實(shí)施例中，植物在脅迫下 生長。在一個實(shí)施例中，植物在營養(yǎng)物質(zhì)限制條件，例如減少的可用氮下生長。
[0043] 在一個實(shí)施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養(yǎng)物質(zhì)在雄性和雌性組織同時(shí) 發(fā)育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物表現(xiàn)出以下農(nóng)學(xué)相關(guān)參數(shù)中的一者或多者：增 大的SPAD值、增加的抽穗絲、增加的穗長度、增加的穗寬度、增加的每個穗的種子數(shù)、增加 的每個穗的種子重量和增加的胚尺寸。
[0044] 在一個實(shí)施例中，具有減少的雄性育性并且其中營養(yǎng)物質(zhì)在雄性和雌性組織同時(shí) 發(fā)育期間更多地分配至雌性生殖組織的植物在干旱脅迫下生長。在一個實(shí)施例中，通過雄 性不育來改善植物的耐旱性。
[0045] 分離的核酸分子包含以組織優(yōu)選的方式引發(fā)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸，并且 包括來自以下序列的序列：
[0046] SEQ ID N0 :13、62 和 64-106 ;
[0047] SEQ ID N0 :13、62和64-106的至少100個連續(xù)核苷酸；以及
[0048] 與SEQ ID N0 :13、62和64-106的全長具有至少70%序列同一性的序列。
[0049] 在一個實(shí)施例中，一種在脅迫下在植物中增加產(chǎn)量穩(wěn)定性的方法，包括在本文公 開的穗絲優(yōu)選的啟動子下表達(dá)影響雄性育性的元件從而減小在植物生殖發(fā)育階段期間對 營養(yǎng)物質(zhì)的競爭，并且其中產(chǎn)量增加。
[0050] -種在氮限制條件和/或正常氮條件下在植物中增加產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的 方法，包括減少雄性生殖組織發(fā)育并且增加在雄性和雌性組織同時(shí)發(fā)育期間分配至雌性生 殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0051] 在一個實(shí)施例中，雄性生殖組織為穗絲并且雄性生殖組織發(fā)育通過減少NIP3-1 或NIP3-1類蛋白質(zhì)的表達(dá)來減少。在一個實(shí)施例中，NIP3-1蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0:107 的氨基酸序列。雄性生殖組織發(fā)育通過增加 SEQ ID NO :63的表達(dá)來減少。
[0052] 在一個實(shí)施例中，雄性生殖組織發(fā)育通過影響涉及穗絲形成的基因，例如無穗絲 基因的功能而減少。
[0053] 在一個實(shí)施例中，雄性生殖組織發(fā)育在用靶向基因的抑制的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的植物中 減少，所述基因編碼SEQ ID N0:107的氨基酸序列或與SEQ ID N0:107至少70 %或80 %或 85%或90%或95%相同的序列。本文還公開了在Tlsl等位基因中具有天然突變的植物。
[0054] 在一個實(shí)施例中，啟動子優(yōu)先地驅(qū)動雄性生殖組織中目的基因的表達(dá)。在一個實(shí) 施例中，啟動子為組織特異性啟動子、組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。在一個實(shí)施例中，組 織優(yōu)選的啟動子為穗絲特異性啟動子。
[0055] -種包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸包括選自如下的序列：SEQ ID NO :63 ;SEQ ID N0 :63的至少100個連續(xù)核苷酸，以及與SEQ ID N0 :63的全長具有至少 70%序列同一性的序列。分離的核酸分子包括編碼TLS1蛋白的多核苷酸，所述TLS1蛋白 包括SEQ ID N0:107的氨基酸序列或與SEQ ID N0:107至少70 %或80 %或85 %或90 %或 95 %相同的序列。
[0056] -種用于產(chǎn)生雄性不育雜交種子的方法，包括轉(zhuǎn)化對于具有基因構(gòu)建體的顯性雄 性不育為雜合的雌性自交系，所述基因構(gòu)建體包括抑制顯性雄性不育表型的元件、破壞花 粉功能的第二元件，以及任選地選擇性標(biāo)記，其中在自交系中表達(dá)構(gòu)建體使雄性系可育。在 一個實(shí)施例中，該方法還包括對這些雄性可育植物自花授粉并且產(chǎn)生為顯性雄性不育的純 合子代。該方法還包括鑒別具有作為雌性自交系的純合顯性雄性不育基因型的那些種子； 任選地通過與轉(zhuǎn)基因保持系雜交來增加雌性自交系，得到無構(gòu)建體的100%純合顯性雄性 不育種子；以及將顯性雄性不育種子的子代與雄性親本雜交以產(chǎn)生對于顯性雄性不育為雜 合的雜交體并且顯示顯性雄性不育表型。
[0057] 在一個實(shí)施例中，顯性雄性不育表型由多核苷酸序列賦予，所述多核苷酸序列包 括SEQ ID N0 :15的至少100個連續(xù)核苷酸并且還包括在第109至111位的密碼子，其編碼 蘇氨酸來替代SEQ ID N0 :14的第37位的丙氨酸（由SEQ ID N0 :15編碼的氨基酸序列）。
[0058] 在一個實(shí)施例中，抑制元件包括對于SEQ ID N0 :15是特異性的啟動子反向重復(fù)序 列。在一個實(shí)施例中，反向重復(fù)序列包括SEQ ID N0 :15的至少100個連續(xù)核苷酸的功能片 段。在一個實(shí)施例中，抑制元件為設(shè)計(jì)用于抑制顯性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的 表達(dá)的RNAi構(gòu)建體。在一個實(shí)施例中，抑制元件為以顯性方式起作用以抑制植物中Ms44 突變的顯性表型的遺傳抑制因子。任選地，如果內(nèi)源的正常ms44也受到抑制元件抑制，則 構(gòu)建體可包括恢復(fù)ms44基因、例如在其自身啟動子或異源啟動子控制下的ms44基因的正 常功能的元件。
[0059] 在一個實(shí)施例中，公開了從本文所公開的方法得到的植物或植物細(xì)胞或種子或植 物的子代。
[0060] 在一個實(shí)施例中，用于產(chǎn)生雜交種子的方法包括在雌性自交系中表達(dá)可操作地連 接到異源啟動子的適于反向重復(fù)失活的顯性雄性不育基因；用來自雄性可育植物的花粉對 雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含對于異源啟動子是特異性的反向重復(fù)。在一個 實(shí)施例中，花粉包含對具有反向重復(fù)失活特異性的異源啟動子是特異性的反向重復(fù)。在一 個實(shí)施例中，顯性雄性不育基因連接至水稻5126啟動子。
[0061] 在一個實(shí)施例中，在雜交種子生產(chǎn)的上下文中使用的顯性雄性不育基因?yàn)橐燥@性 方式起作用以實(shí)現(xiàn)雄性不育并且任選地適于抑制以維持雄性不育雌性自交系的任何基因。 在一個實(shí)施例中，顯性雄性不育基因選自：芽孢桿菌RNA酶、DAM甲基化酶、MS41和MS42。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1-產(chǎn)生雄性不育雜交植物的遺傳顯性雄性不育體系的圖。已發(fā)現(xiàn)可利用顯性 核雄性不育基因、穗絲特異性或穗絲優(yōu)選的啟動子和穗絲特異性或穗絲優(yōu)選的基因中的一 種或多種的植物中的雄性育性的遺傳減少可增加穗組織發(fā)育、改善正在生長的植物中的營 養(yǎng)物質(zhì)利用率、增加脅迫耐性和/或增加種子度量值，最終得到改善的產(chǎn)量。
[0063] 圖2-MS44相關(guān)序列的比對（圖2A-C)。相同的殘基以粗體示出并且所有相似的殘 基以下劃線和斜體示出。
[0064] 圖3-利用隱性雄性不育基因產(chǎn)生雄性不育雜交植物的方法的圖。雌性親本和雄 性親本均具有賦予不育性的純合隱性等位基因。然而，雄性親本使恢復(fù)等位基因在構(gòu)建體 內(nèi)，其防止恢復(fù)等位基因通過花粉傳遞。所得的雜交種子產(chǎn)生雄性不育的雜交植物。
[0065] 圖4-用于利用下述顯性雄性不育基因產(chǎn)生雄性不育雜交種子的方法的圖：
[0066] M-對于顯性雄性不育為雜合的雌性自交系用基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，所述基因構(gòu)建體 包括抑制顯性雄性不育的元件、破壞花粉功能的第二元件，以及任選地選擇性標(biāo)記。該構(gòu)建 體在自交系中的表達(dá)使植物雄性可育。
[0067] 迎-植物自花授粉以產(chǎn)生種子。
[0068] 4C和4D-對種子或子代棺物講行基因分型以鑒別對于顯件雄件不育為純合的那 些。
[0069] 4E-雌性自交系可通過將其與轉(zhuǎn)基因保持系雜交而增加，得到100%純合顯性雄 性不育種子。
[0070] 4E-顯性雄性不育植物由第二自交系授粉以產(chǎn)生對于顯性雄性不育為雜合并且表 現(xiàn)出顯性雄性不育表型的雜交體。
[0071] 圖5-圖5A示出了響應(yīng)于氮肥力的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗(yàn)1。圖5B示出了響應(yīng) 于氮肥力的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗(yàn)2。
[0072] 圖6示出了與野生型相比較的MS44雜交體穗干重（R1)。
[0073] 圖7-圖7A示出了響應(yīng)于植物群體的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗(yàn)1。圖7B示出了響 應(yīng)于植物群體的MS44雜交體產(chǎn)量-試驗(yàn)2。
[0074] 圖8示出了 tlsl突變表型。A)來自野生型植物的穗絲。B)具有小的穗絲表型的 純合tlsl植物。C)不具有穗絲的純合tlsl植物。D)具有最嚴(yán)重表型的植物往往具有帶 長殼并且不抽穗絲的多個穗（箭頭）。E)穗表型的范圍。F)葉表型的范圍。WT=純合野 生型植物；ST =具有小的穗絲的純合tlsl植物；NT =不具有穗絲的純合tlsl植物。
[0075] 圖9示出了 tlsl的基于圖譜的克隆。
[0076] 圖10示出了 tlsl候選基因驗(yàn)證。ZmNIP3-l的敲除得到tlsl表型。圖10A-具有 完整ZmNIP3-l的野生型植物。圖10B-在ZmNIP3. 1中具有Mu-插入的植物表現(xiàn)出tlsl表 型。
[0077] 圖11示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝數(shù)。
[0078] 圖12示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗絲分枝長度。
[0079] 圖13示出突變型、野生型和噴以硼的突變型中的穗長度。
[0080] 圖14示出tlsl植物較不易受50ppm硼的硼毒性條件影響。圖14A-并列放置純 合tlsl植物和野生型植物，其中突變型植物看起來更高和更大。圖14B-在野生型植物中， 第二嫩的完全張開的葉的節(jié)在最嫩的完全張開的葉的節(jié)的上方延伸，然而突變型植物看起 來是正常的。圖14C-突變型的最嫩的完全張開的葉比野生型更寬。
[0081] 圖15示出了 ZmNIP3-l類似于硼通道蛋白。圖15A-系譜樹示出ZmNIP3. 1與已被 表征為硼通道蛋白的0sNIP3. 1和AtNIP5. 1(突出顯示的）密切相關(guān)。圖15B-在圖15A中 突出顯示的蛋白質(zhì)序列的比對；ZmNIP3. 1與0sNIP3. 1和AtNIP5. 1的百分比同一性分別為 84. 4 和 67. 3。
[0082] 圖16-來自所選物種的Ms44序列。在該比對中，Ms44顯性多肽序列的氨基酸突變 在第42位以粗體和下劃線示出，如MS44dom等位基因中的T(SEQ ID N0:14)或Ms44-2629 等位基因中的V(SEQ ID NO :153)，其中所有其他序列在該位置具有A。

【具體實(shí)施方式】
[0083] 提交于2013年3月12日的PCT申請PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12 日的PCT申請PCT/US2013/30455的內(nèi)容和公開內(nèi)容以全文引用方式并入本文。與雄性育 性相關(guān)的方法及其實(shí)施例以引用方式并入本文。
[0084] 氮利用效率（NUE)基因影響產(chǎn)量并對改善氮在作物（特別是玉蜀黍）中的利用具 有實(shí)用性。氮使用效率增加可由增加的對氮肥的吸收和同化和/或?qū)Ψe聚的氮儲備的后續(xù) 再動員和再利用，以及植物對諸如低氮環(huán)境之類的脅迫情況的耐受性增加得到?；蚩捎?于改變植物的遺傳組成，從而使得它們在當(dāng)前的肥料施用標(biāo)準(zhǔn)下更高產(chǎn)或在肥料顯著減少 或氮可用量顯著減少的情況下保持它們的產(chǎn)出率。在氮肥獲得受限的發(fā)展中國家和在氮使 用水平保持較高的發(fā)達(dá)國家，改善玉米中的NUE都將會增加每單位投入氮肥的玉米可收獲 產(chǎn)量。氮利用改善還使得能降低在農(nóng)場上的投入成本，降低對氮肥生產(chǎn)所需的非可再生能 源的使用和依賴，以及減少氮肥生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)利用的環(huán)境影響。
[0085] 本發(fā)明提供了改善植物產(chǎn)量的方法和組合物。在一些實(shí)施例中，植物產(chǎn)量在脅迫， 特別是非生物脅迫，例如氮限制條件下得以改善。改善植物產(chǎn)量的方法包括抑制植物的育 性。植物的雄性育性可用本領(lǐng)域已知的任何方法來抑制，這些方法包括但不限于破壞穗絲 發(fā)育基因，或者通過利用共抑制、反義或RNA沉默或干擾來降低基因的表達(dá)。其他雄性不育 植物可通過利用遺傳雄性不育突變體來實(shí)現(xiàn)。
[0086] 抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮脅迫耐受性，并且這種植物可在顯著較低 的氮肥投入的情況下保持它們的產(chǎn)出率和/或可表現(xiàn)出增加的氮肥吸收和同化和/或?qū)Ψe 聚的氮儲備的再動員和再利用。除了產(chǎn)量的總體增加外，通過減少雄性育性改善氮脅迫耐 受性還可導(dǎo)致根質(zhì)量和/或長度增加，穗、葉、種子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改 善。因此，在一些實(shí)施例中，所述方法還包括在氮限制條件下栽培所述植物，并任選選擇表 現(xiàn)出對低氮水平有較大耐受性的那些植物。
[0087] 另外，提供了改善非生物脅迫下的產(chǎn)量的方法和組合物，該方法包括：評價(jià)耕作區(qū) 的環(huán)境條件的非生物應(yīng)激源（stressor)(例如，土壤中的低氮水平），并在脅迫環(huán)境下栽培 具有減少的雄性育性的種子或植物。
[0088] 本文還提供了構(gòu)建體和表達(dá)盒，所述構(gòu)建體和表達(dá)盒包含可有效減少雄性育性的 核苷酸序列。
[0089] 另外的方法包括但不限于：
[0090] 一種通過在植物中增加一種或多種產(chǎn)量組分來增加產(chǎn)量的方法，包括通過影響植 物中核編碼組分的表達(dá)或活性來減少雄性育性，以及在植物生長條件下種植植物，其中該 組分表現(xiàn)出顯性表型。在一個實(shí)施例中，核編碼組分為具有顯性表型的雄性育性基因或雄 性不育基因。任選地，雄性育性基因或雄性不育基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因。
[0091] 正在發(fā)育的雌性生殖結(jié)構(gòu)與雄性生殖結(jié)構(gòu)在這些生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育期間競爭氮、碳和 其他營養(yǎng)物質(zhì)。這在當(dāng)植物以增加的氮肥水平種植時(shí)定量正在發(fā)育的玉蜀黍穗和穗絲的氮 平衡中進(jìn)行說明。當(dāng)玉蜀黍在較低氮肥力水平下生長時(shí)，穗的氮平衡為負(fù)，或在發(fā)育期間 當(dāng)?shù)芟迺r(shí)，穗丟失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供給植物的氮肥的量增加時(shí)改 善，直到穗維持氮的正向增加直至抽穗絲。相比之下，無論種植植物的氮肥水平如何，穗絲 都維持正向氮平衡。穗絲和穗在生殖發(fā)育期間競爭氮，并且正在發(fā)育的穗絲對正在發(fā)育的 穗占優(yōu)勢。穗和穗絲可能在發(fā)育期間競爭多個營養(yǎng)物質(zhì)，并且競爭在脅迫條件下變得更激 烈。穗在開花之前在生殖發(fā)育期間與穗絲競爭減少了正在發(fā)育的穗在脅迫下積聚營養(yǎng)物質(zhì) 的能力，得到具有較少籽粒的較小、發(fā)育較差的穗。更嚴(yán)重的、延長的脅迫可導(dǎo)致穗無法抽 穗絲（exert silk)和產(chǎn)生谷粒。雄性育性的遺傳減少將減少穗絲發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo) 致開花時(shí)穗發(fā)育改善。遺傳雄性不育和可育近親在不同氮肥水平下生長并且在約50%花粉 散出時(shí)取樣。雄性不育植物在兩種氮肥水平下均產(chǎn)生更大的穗。抽穗絲的雄性不育植物的 比例也大于可育近親植物。雖然生物量（總地上植物干重減去穗干重）在較高氮肥下生長 的植物中較大，但是雄性不育對生物量無影響。這表明雄性不育具體地對植物產(chǎn)生更重、更 完全發(fā)育的（抽穗絲）穗的能力的正面影響，而不影響總體營養(yǎng)生長。
[0092] 尚未對遺傳雄性不育衍生的雜交體進(jìn)行產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橹钡阶罱€沒有利用該雄 性不育源產(chǎn)生雜交種子的適當(dāng)方法。由于大多數(shù)遺傳雄性不育為隱性的，因此產(chǎn)生雄性不 育雜交體將需要雄性不育源回交到雜交體的兩個親本中。對于雜交體雌性親本將必須為純 合隱性（雄性不育）的并且雄性親本必須為雜合（雄性可育）的以對雄性不育1:1分離。 相比之下，顯性遺傳雄性不育MS44僅需要回交到雌性親本中以產(chǎn)生對雄性不育1 : 1分離 的雜交種子。顯性雄性不育在多倍體植物諸如小麥中特別有用，其中純合隱性不育的維持 更為復(fù)雜。
[0093] 已發(fā)現(xiàn)表達(dá)植物中顯性遺傳雄性不育基因的過程，所述植物任選地結(jié)合穗絲組織 特異性/優(yōu)選的啟動子和穗絲特異性基因，以增加穗組織發(fā)育、改善正在生長的植物中的 營養(yǎng)物質(zhì)利用率并且增加種子度量值，最終得到改善的產(chǎn)量。（圖1)
[0094] 遺傳雄性不育極可能產(chǎn)生產(chǎn)量響應(yīng)，因?yàn)榛ǚ郯l(fā)育在遺傳雄性不育突變體中比 在CMS衍生的不育中停滯得更早。大多數(shù)雄性不育突變體在花粉四分體釋放后很快就 失效（Albertson and Phillips，（1981)Can.J. Genet. Cytol. 23 :195-208(Albertson 和 Phillips，1981年，《加拿大遺傳學(xué)與細(xì)胞學(xué)雜志》，第23卷，第195-208頁），其出現(xiàn)在 雌性（穗）發(fā)育的非常早的階段。直到開花前10天才能確定CMS衍生的雄性不育，如通 過與CMS穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的環(huán)境相互作用所判斷的（Weider，et al·，（2009)Crop Sci.49: 77-84 (Weider等人，2009年，《作物科學(xué)》，第49卷，第77-84頁））。穗的主體發(fā)育將已在開 花前10天之前發(fā)生，從而在穗發(fā)育期間提供極少減輕的穗絲競爭。然而，當(dāng)穗在早期發(fā)育 階段時(shí)，遺傳雄性不育的早期停滯將是減少正在發(fā)育的穗與穗絲發(fā)育對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭的 一種方法。與通過改善穗發(fā)育引導(dǎo)的與雄性不育雜交體相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)量改善與穗發(fā)育和穗絲 發(fā)育競爭的減少完全一致。
[0095] 在恢復(fù)的（雄性可育）和未恢復(fù)的（雄性不育）細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS)雜交體中 測試對氮肥的產(chǎn)量響應(yīng)。一個雜交體在開花期間由于環(huán)境條件變?yōu)樾坌钥捎?，而另一個雜 交體由于雄性不育未表現(xiàn)出顯著的產(chǎn)量效應(yīng)。通過細(xì)胞質(zhì)基因確定的雄性不育通常直到穗 絲和穗發(fā)育的極晚期才能確定，如通過與CMS穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的環(huán)境相互作用所判斷的。穗 的主體發(fā)育已在確定CMS雄性不育之前（開花前10天）發(fā)生，從而在穗發(fā)育期間提供極少 減輕的穗絲競爭。大多數(shù)雄性不育突變體在花粉四分體釋放后很快就失效，其出現(xiàn)在雌性 (穗）發(fā)育的非常早的階段。因此，遺傳雄性不育中的穗絲發(fā)育將在整個穗發(fā)育時(shí)間段期間 減少，從而與穗發(fā)育競爭較少。遺傳雄性不育突變體不受環(huán)境條件的顯著影響。
[0096] 減輕正在發(fā)育的穗絲和穗之間的競爭還可通過化學(xué)誘導(dǎo)雄性不育來實(shí)現(xiàn)。獨(dú) 特的化學(xué)物質(zhì)和遺傳操縱的組合也可誘導(dǎo)雄性不育。通過雄性生殖組織中具有較低功 效的啟動子或通過使用殺配子劑前體（pro-gametocide)修改的除草劑耐性（Dotson, et al·，（1996)The Plant Journall0:383-392(Dotson 等人，1996 年，《植物雜志》，第 10 卷，第 383-392 頁）和（Mayer and Jefferson，（2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Production. A report for the Rural Industries Research and Development Corporation (Mayer和Jefferson, 2004年，用于雜交水稻生產(chǎn)的分子方法，農(nóng)村產(chǎn)業(yè)研究 與開發(fā)公司的報(bào)告））以組織特異性方式釋放雄性抑制劑也將是實(shí)踐本發(fā)明的有效方法。 [0097] 在多種情況下，特定的植物性狀通過維持純合隱性條件來表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因恢復(fù) 基因必須用于維持時(shí)，維持純合條件出現(xiàn)困難。例如，玉蜀黍中的MS45基因（美國專利 No. 5, 478, 369)已表現(xiàn)出對于雄性育性至關(guān)重要。由于MS45育性性狀的孢子體性質(zhì)，因此 顯性MS45等位基因的雜合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定為ms45的天然突變 在該突變型等位基因處于純合狀態(tài)時(shí)賦予植物雄性不育表型。當(dāng)通過普通雜交或轉(zhuǎn)基因互 補(bǔ)方法將非突變形式的基因引入植物中時(shí)，此不育性可逆轉(zhuǎn)（即，育性被恢復(fù)）。然而，通過 雜交對育性的恢復(fù)移除了所需的純合隱性條件，并且兩種方法都恢復(fù)了全部雄性育性并且 阻止了對純的雄性不育母系的維持。
[0098] 維持所需的純合隱性條件的方法在美國專利No. 7, 696, 405和7, 517, 975中有所 描述，其中保持系用于雜交到純合隱性雄性不育姊妹體上。保持系在雄性不育所需的純合 隱性條件下，而且還包含由顯性雄性育性基因組成的半合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體以補(bǔ)充雄性不育條 件；花粉消融基因，其阻止通過轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的花粉轉(zhuǎn)移至雄性不育姊妹體，但允許隱性雄 性不育等位基因通過非轉(zhuǎn)基因花粉粒的轉(zhuǎn)移；以及種子標(biāo)記基因，其允許對轉(zhuǎn)基因保持系 種子或植物和轉(zhuǎn)基因無效雄性不育種子或植物進(jìn)行分選。
[0099] 制種技術(shù)（SPT)提供了維持植物中雄性不育基因的純合隱性條件的方法。參見 (例如）美國專利No. 7, 696, 405。SPT將為花粉源的保持系用于其純合隱性雄性不育姊妹體 的受精。保持系在雄性不育所需的純合隱性條件下，而且還包含半合轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體（"SPT 構(gòu)建體"）。在某些實(shí)施例中，SPT構(gòu)建體包含以下三種元件：（1)顯性雄性育性基因，以補(bǔ) 充雄性不育隱性條件；（2)編碼干擾雄性配子的形成、功能或傳播的產(chǎn)物的基因和（3)標(biāo)記 基因，其允許從那些不含該轉(zhuǎn)基因的種子/植物中分選該轉(zhuǎn)基因保持系種子/植物。對花 粉的形成、功能或傳播的干擾阻止了通過轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的花粉轉(zhuǎn)移；功能性花粉不含該轉(zhuǎn) 基因。所得的種子產(chǎn)生為雄性不育的植物。然后將這些雄性不育自交系植物用于通過用雄 性親本授粉的雜交體生產(chǎn)，所述雄性親本對于雄性育性基因的顯性等位基因可為不相關(guān)的 自交系純合體。所得的雜交種子產(chǎn)生為雄性可育的植物。
[0100] 要產(chǎn)生雜交雄性不育子代，雄性親本將用作保持系以雜交到雄性不育雌性自交系 上（利用單獨(dú)的雌性保持系增加）以得到完全雄性不育的雜交植物。參見（例如）圖3。 [0101] 使用顯性方法是實(shí)現(xiàn)雄性不育的另一種方法。在很多方面，顯性雄性不育方法優(yōu) 于隱性雄性不育的使用，因?yàn)橥耆挥齼H需要顯性基因的單拷貝。然而，如果方法不可用于 產(chǎn)生純合顯性雄性不育系，那么所得的子代將對雄性不育50%分離。該情況可通過轉(zhuǎn)基因 地將篩選性或選擇性標(biāo)記連接到顯性雄性不育基因并且篩選或選擇攜帶標(biāo)記的子代種子 或植物來減輕。對于顯性雄性不育等位基因，連接的遺傳標(biāo)記或連接的表型可用于分選子 代。描述可逆顯性雄性不育體系的方法在將化學(xué)物質(zhì)施加于顯性雄性不育植物的美國專 利No. 5, 962, 769中有所描述，所述可逆顯性雄性不育體系逆轉(zhuǎn)表型并且得到雄性育性，從 而允許自花授粉使得可獲得純合顯性雄性不育植物?？深A(yù)想用于產(chǎn)生純合顯性雄性不育植 物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干擾顯性雄性不育基因功能的基因的誘導(dǎo)型啟動 子。植物為組成型不育的，僅當(dāng)啟動子被誘導(dǎo)時(shí)變?yōu)榭捎?，從而允許破壞顯性雄性不育基 因功能的阻遏子的表達(dá)。阻遏子可為靶向顯性雄性不育基因自身或其啟動子或能夠結(jié)合顯 性雄性不育基因產(chǎn)物或使其失活的基因產(chǎn)物的反義基因、RNAi、反向重復(fù)序列。
[0102] 另一個在顯性雄性不育的子代中產(chǎn)生100%雄性不育的方法將使用自動剪接蛋白 質(zhì)序列。自動剪接蛋白質(zhì)序列為能夠自行切除并且以肽鍵重新結(jié)合剩余的一個或多個部 分的蛋白質(zhì)片段。自動剪接蛋白質(zhì)序列可自剪接并且將剩余部分歸為順式和反式兩種狀 態(tài)。顯性雄性不育基因可進(jìn)行修飾使得對N和C蛋白質(zhì)區(qū)域編碼的區(qū)域被分成不同的轉(zhuǎn)基 因構(gòu)建體，與對自動剪接蛋白質(zhì)序列編碼的序列結(jié)合。由于蛋白質(zhì)為截短和無功能的，所以 包含單個構(gòu)建體的植物將為雄性可育的，其允許自體受精以產(chǎn)生純合植物。然后可將對于 N-DMS-N-自動剪接蛋白質(zhì)序列為純合的植物與對于C-自動剪接蛋白質(zhì)序列-C-DMS蛋白質(zhì) 為純合的植物雜交。所有來自此雜交的子代通過切除每個自動剪接蛋白質(zhì)序列以及N和C 序列的歸類將為雄性不育的，以產(chǎn)生功能性的顯性雄性不育蛋白質(zhì)。
[0103] -系列田間實(shí)驗(yàn)用于定量在各種環(huán)境變量下遺傳雄性不育的產(chǎn)量響應(yīng)。使用兩個 變量：施氮量和植物密度，以使植物經(jīng)受各種程度的脅迫。脅迫處理的連續(xù)性由于對遺傳雄 性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允許對植物性能的清晰分離。這些方法用于定 量和說明田地中代表性的作物冠層環(huán)境中的正向產(chǎn)量效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了在溫室研究中 測量的早期單個植株響應(yīng)。
[0104] 雄性不育表現(xiàn)為在特定植物組織的發(fā)育中的變化。玉蜀黍穗和穗絲為共享共同的 發(fā)育過程并且受共同的一組基因控制的兩種花序結(jié)構(gòu)。組織彼此競爭所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然 而穗絲具有優(yōu)于穗的頂端優(yōu)勢的優(yōu)點(diǎn)，其不利于玉蜀黍植物中的穗生長和產(chǎn)量潛力。減小 穗絲頂端優(yōu)勢可用于將更多資源轉(zhuǎn)向穗生長、籽粒數(shù)量或尺寸，并且最終可得到增加的谷 粒產(chǎn)量。
[0105] 有多種方法減少穗絲的競爭，諸如雄性不育、穗絲尺寸減少或穗絲消除（無穗絲 玉蜀黍植物）。當(dāng)基因的遺傳突變（突變體）諸如雄性不育基因可用于減少穗絲與穗的競 爭時(shí)，轉(zhuǎn)基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗絲發(fā)育的基因通常 涉及穗發(fā)育，所以通過中斷這些基因減少穗絲發(fā)育也可影響穗發(fā)育。無穗絲基因（Tsll)突 變?yōu)槠渲袩o穗絲植物也是無穗的例子。要使穗絲生長減少而不干擾穗發(fā)育，則需要穗絲特 異性啟動子靶向僅在穗絲組織中的基因破壞。
[0106] 提到的所有參考文獻(xiàn)均以引用方式并入本文。
[0107] 除非另外明確定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù) 是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而不是限制性 的。以下內(nèi)容以舉例說明的方式給出，而非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0108] 借助前面的描述和隨附的附圖中給出的教導(dǎo)，這些公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 將會想到本文所述公開內(nèi)容的許多修改形式和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)當(dāng)了解，這些公開內(nèi)容 不限于所公開的特定實(shí)施例，并旨在將修改形式和其他實(shí)施例包括在本文末尾所附權(quán)利要 求的范圍內(nèi)。雖然本文中采用特定術(shù)語，但所述術(shù)語僅在一般性和描述性意義上使用而并 非用于限制目的。
[0109] 除非另外指明，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用植物學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、分子生物 學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)處于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。
[0110] 單位、前綴和符號可以它們SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5'到3'的 方向從左向右書寫；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左向右書寫。數(shù)值范圍包括限定 該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可通過它們通常知道的三字母符號表示或通過IUPAC-IUB 生化命名委員會（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號 表示。同樣，核苷酸可通過它們通常接受的單字母密碼表示。下面定義的術(shù)語通過參考本 說明書整體進(jìn)行更完整的定義。
[0111] 在描述本發(fā)明時(shí)，將采用下面的術(shù)語，并采用下文所示的定義。
[0112] 所謂"微生物"意指任何微生物（包括真核微生物和原核微生物），諸如真菌、酵 母、細(xì)菌、放線菌、藻類和原生動物以及其他單細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
[0113] 所謂"擴(kuò)增"意指構(gòu)建核酸序列的多個拷貝或與該核酸序列互補(bǔ)的多個拷貝，該構(gòu) 建是利用所述核酸序列中的至少一者作為模板進(jìn)行。擴(kuò)增系統(tǒng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 系統(tǒng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴(kuò)增（安大略省米西索加市加拿大基 因公司（Cangene，Mississauga, Ontario))、〇-β復(fù)制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)（TAS) 和鏈置換擴(kuò)增（SDA)。參見例如 Diagnostic Molecular Microbiology 〖Principles and Applications,Persing,et al. ,eds. ,American Society for Microbiology,Washington, DC(1993)(《診斷分子微生物學(xué)：原理和應(yīng)用》，Persing等人編輯，美國微生物學(xué)會，華盛頓 特區(qū)，1993年）。擴(kuò)增的產(chǎn)物稱為擴(kuò)增子。
[0114] 術(shù)語"保守修飾的變體"同時(shí)適用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列 而言，保守修飾的變體指編碼氨基酸序列的相同的或保守修飾的變體的那些核酸。由于遺 傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG 和GCU全部編碼丙氨酸這種氨基酸。因而，在每個由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，可將該密碼 子變更為所描述的相應(yīng)密碼子的任一種而不會改變所編碼的多肽。這種核酸變異為"沉默 變異"，代表保守修飾變異的一種。編碼多肽的本文每種核酸序列還描述了該核酸的每種可 能的沉默變異。普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，核酸中的每個密碼子（除了 AUG，它通常是甲硫氨 酸的唯一密碼子；一個例外是微球菌（Micrococcus rubens)，對于它來說GTG是甲硫氨酸 密碼子（Ishizuka，et al.，（1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人，1993 年， 《普通微生物學(xué)雜志》，第139卷，第425-432頁））可進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因 此，編碼本發(fā)明多肽的核酸的每種隱匿的變異均隱含在每種所描述的多肽序列中并以引用 的方式并入本文。
[0115] 對于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列作出的會改 變、添加或缺失所編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的各個置換、缺失或添加， 在該變更導(dǎo)致氨基酸為化學(xué)類似的氨基酸所置換時(shí)，為"保守修飾的變體"。因而，還可變 更選自1至15的整數(shù)的任何數(shù)目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10個 變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經(jīng)修飾的多肽序列類似的生物活性。例 如，對于其天然底物而言，底物特異性、酶活性或配體/受體結(jié)合通常為天然蛋白質(zhì)的至少 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，優(yōu)選60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守 置換表是本領(lǐng)域所熟知的。
[0116] 下面的六個組各含有對彼此而言是保守置換的氨基酸：
[0117] 1)丙氨酸㈧、絲氨酸（S)、蘇氨酸（T);
[0118] 2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E);
[0119] 3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);
[0120] 4)精氨酸（R)、賴氨酸（K);
[0121] 5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、繳氨酸（V);和
[0122] 6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0123] 還可參見 Creighton，Proteins，W. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton，《蛋白 質(zhì)》，W. H. Freeman 公司，1984 年）。
[0124] 如本文所用，"基本上由...組成"意指在如下情況下目標(biāo)多核苷酸或多肽可包 括額外的序列：額外的序列不會嚴(yán)重影響受權(quán)利要求保護(hù)的多核苷酸或多肽序列的基本功 能。
[0125] 術(shù)語"構(gòu)建體"用來主要指多核苷酸序列的人工組合，即在自然界中不會發(fā)生的、 通常包含一個或多個調(diào)節(jié)元件和一個或多個編碼序列的組合。該術(shù)語可包括指表達(dá)盒和/ 或載體序列，視上下文而定。
[0126] "對照"或"對照植物"或"對照植物細(xì)胞"提供度量其中已針對目的基因?qū)崿F(xiàn)了遺 傳變更（諸如轉(zhuǎn)化）的受試植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點(diǎn)。受試植物或植物細(xì)胞可 從作了如此變更的植物或細(xì)胞遺傳而來，且會包含該變更。
[0127] 對照植物或植物細(xì)胞可例如包括：(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于進(jìn)行遺 傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳變更會得到受試植物或細(xì)胞；(b) 具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體（即，用對目的性狀不具有已知效果的構(gòu) 建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體）轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；（c)為受試植物或植物細(xì)胞的 子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；（d)遺傳上與受試植物或植物細(xì)胞相同但未暴 露于會誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的條件或刺激的植物或植物細(xì)胞；或者（e)處于其中目的基因不 表達(dá)的條件下的受試植物或植物細(xì)胞本身。對照植物還可以是用另選的下調(diào)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的 植物。
[0128] 就指定的核酸而言，所謂"編碼"意指包含翻譯成指定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì) 的核酸可以包含在該核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列（例如內(nèi)含子）或可以缺少這種居間的 非翻譯序列（例如，如在cDNA中）。據(jù)以編碼蛋白質(zhì)的信息是通過使用密碼子來確定的。 通常，氨基酸序列由核酸利用"通用"遺傳密碼來編碼。然而，可使用諸如在某些植物、動物 和真菌線粒體、細(xì)菌山羊支原體（Mycoplasma capricolum)(Yamao，et al·，（1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :2306-9 (Yamao等人，1985年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第82卷，第 2306-2309頁）），或纖毛蟲大核（ciliate Macronucleus)中存在的通用密碼的變體，當(dāng)用 這些生物體表達(dá)該核酸時(shí)。
[0129] 當(dāng)通過合成法制備或改變核酸時(shí)，可利用將在其中表達(dá)核酸的預(yù)期宿主的已知密 碼子偏好性。例如，盡管本發(fā)明的核酸序列在單子葉植物物種和雙子葉植物物種中都可表 達(dá)，但可對序列進(jìn)行修飾以解決單子葉植物或雙子葉植物的特定密碼子偏好性和GC含量 偏好性，因?yàn)檫@些偏好性已被證實(shí)不同（Murray，et al.，（1989)Nucleic Acids Res. 17: 477-98 (Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498頁），將其以引用的方式并 入本文）。因而，具體氨基酸的玉蜀黍優(yōu)選密碼子可由來自玉蜀黍的已知基因序列得出。關(guān) 于來自玉蜀黍植物的28種基因的玉蜀黍密碼子使用在Murray等人（出處同上）的表4中 列出。
[0130] 如本文所用，針對核酸的"異源"為起源于外來物種的核酸，或者，如果起源于相同 物種的話，則為通過蓄意的人為干預(yù)對其天然形式在組成和/或基因組基因座方面進(jìn)行了 實(shí)質(zhì)性修飾的核酸。例如，可操作地連接至異源結(jié)構(gòu)基因的啟動子是來自不同于衍生該結(jié) 構(gòu)基因的物種的物種，或者如果是來自相同的物種，則對一者或二者由其初始形式進(jìn)行了 實(shí)質(zhì)性的修飾。異源蛋白質(zhì)可起源于外來物種，或者，如果起源于相同物種，則通過蓄意的 人為干預(yù)對其天然形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)修飾。
[0131] 所謂"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明的異源核酸序列、含有載體并能支持該表達(dá)載體 的復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞諸如大腸桿菌（E.coli)，或真核細(xì)胞 諸如酵母、昆蟲、植物、兩棲動物或哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是單子葉植物細(xì)胞或雙 子葉植物細(xì)胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麥、苜蓿、水稻、棉花、卡諾拉油 菜、大麥、小米和番茄。特別優(yōu)選的單子葉宿主細(xì)胞是玉蜀黍宿主細(xì)胞。
[0132] 術(shù)語"雜交復(fù)合體"包括指由兩條相互選擇性雜交的單鏈核酸序列形成的雙鏈核 酸結(jié)構(gòu)。
[0133] 在將核酸插入細(xì)胞的語境中，術(shù)語"引入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，包括 指將核酸并入真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可并入細(xì)胞的基因組（例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì) 體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)（例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0134] 術(shù)語"分離的"指諸如核酸或蛋白質(zhì)之類的物質(zhì)，該物質(zhì)實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其 天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴隨或與其相互作用的組分。術(shù)語"非天然存在的"、 "突變的"、"重組的"、"重組表達(dá)的"、"異源的"或"異源表達(dá)的"為不存在于其天然存在環(huán)境 中的代表性生物材料。
[0135] 術(shù)語"NUE核酸"意指包含編碼完全長度或部分長度多肽的多核苷酸（"NUE多核 苷酸"）的核酸。
[0136] 如本文所用，"核酸"包括指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合 物，并且除非另外限制，否則涵蓋在以下方面具有天然核苷酸的基本性質(zhì)的已知類似物：其 以與天然存在的核苷酸（例如肽核酸）相似的方式雜交至單鏈核酸。
[0137] 所謂"核酸文庫"意指分離的DNA或RNA分子的集合，其包含且實(shí)質(zhì)上代表指定 生物體的基因組的整個被轉(zhuǎn)錄的部分。示例性核酸文庫諸如基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu) 建，在諸如以下的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)中有教導(dǎo)：Berger and Kimmel，（1987) Guide To Molecular Cloning Techniques，from the series Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger 和 Kimmel，1987 年，《分子克隆技術(shù)指南》， 來自《酶學(xué)方法》系列第152卷，學(xué)術(shù)出版社，加州圣地亞哥）；Sambrook，et al.，（1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2nd ed.，vols.l_3(Sambrook等人，1989年，《分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第 2 版，第 1-3 卷）；以及 Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel,et al. ，eds，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc. and John Wiley&Sons，Inc. (1994Supplement)(《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方 法匯編》，Ausubel等人編輯，選自《實(shí)驗(yàn)室指南》，格林出版聯(lián)合公司與約翰威立父子出版公 司的合資公司（1994年增刊））。
[0138] 本文所用的"可操作地連接"包括指涉第一序列（諸如啟動子）和第二序列之間 的功能性連接，其中啟動子序列起始并介導(dǎo)對應(yīng)第二序列的DNA的轉(zhuǎn)錄。一般來講，可操作 地連接意指被連接的核酸序列是連續(xù)的，并且如果有必要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的話，是 連續(xù)的且在相同的閱讀框內(nèi)。
[0139] 如本文所用，術(shù)語"植物"包括指整個植株、植物器官（例如葉、莖、根等）、種子和 植物細(xì)胞和它們的子代。如本文所用，植物細(xì)胞包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組 織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物種類 通常與適用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物，包括以 下屬的種：南瓜屬（Cucurbita)、薔薇屬（Rosa)、葡萄屬（Vitis)、胡桃屬（Juglans)、草莓 屬（Fragaria)、百脈根屬（Lotus)、苜猜屬（Medicago)、驢食草屬（Onobrychis)、三葉草屬 (Trifolium)、胡蘆巴屬（Trigonella)、紅豆屬（Vigna)、柑桔屬（Citrus)、亞麻屬（Linum)、 老鶴草屬（Geranium)、木薯屬（Manihot)、胡蘿卜屬（Daucus)、擬南芥屬（Arabidopsis)、 蕓苔屬（Brassica)、蘿卜屬（Raphanus)、白芥屬（Sinapis)、顛煎屬（Atropa)、辣椒屬 (Capsicum)、曼陀羅屬（Datura)、天仙子屬（Hyoscyamus)、番煎屬（Lycopersicon)、煙 草屬（Nicotiana)、煎屬（煎屬）、碧冬煎屬（Petunia)、毛地黃屬（Digitalis)、馬珠草 屬（Majorana)、菊苣屬（Ciahorium)、向日葵屬（Helianthus)、萵苣屬（Lactuca)、雀麥 屬（Bromus)、天門冬屬（Asparagus)、金魚草屬（Antirrhinum)、萱草屬（Heterocallis)、 Nemesis、天竺葵屬（Pelargonium)、黍?qū)伲≒anieum)、狼尾草屬（Pennisetum)、毛茛屬 (Ranunculus)、千里光屬（Senecio)、蛾蝶花屬（Salpiglossis)、黃瓜屬（Cucumis)、布洛 華麗屬（Browaalia)、大豆屬（Glycine)、豌豆屬（Pisum)、菜豆屬（Phaseolus)、黑麥草 屬（Lolium)、稻屬（Oryza)、燕麥屬（Avena)、大麥屬（Hordeum)、黑麥屬（Secale)、蔥屬 (Allium)和小麥屬（Triticum)。特別優(yōu)選的植物是玉米（Zea mays)。
[0140] 本文所用的"產(chǎn)量"可包括指收獲時(shí)每英畝谷類作物的蒲式耳數(shù)目（針對谷粒水 分進(jìn)行了調(diào)整，例如玉蜀黍的水分通常為15% )，和指所產(chǎn)生的生物量的體積（對于草料作 物諸如苜蓿而言，以及復(fù)種作物的植株根尺寸）。谷粒水分是在收獲時(shí)的谷粒中測量。谷粒 的經(jīng)調(diào)整的測試重量確定為針對收獲時(shí)的谷粒水分水平進(jìn)行了調(diào)整的重量，單位磅/蒲式 耳。生物量測量為所產(chǎn)生的可收獲植物材料的重量。
[0141] 如本文所用，"多核苷酸"包括指脫氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它們的類似 物，所述類似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性質(zhì)：在嚴(yán)格雜交條件下其所雜交 的核苷酸序列與天然存在的核苷酸所雜交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻譯成與天 然存在的核苷酸所翻譯的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或異源結(jié)構(gòu)基因或調(diào) 控基因的全長序列或其亞序列。除非另外指明，否則該術(shù)語包括指指定的序列及其互補(bǔ)序 列?！?br> [0142] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。這 些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物 的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0143] 本文所用的"啟動子"包括指DNA的在轉(zhuǎn)錄起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋 白質(zhì)的識別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。"植物啟動子"是能夠引發(fā)在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟 動子。示例性的植物啟動子包括但不限于從植物、植物病毒和包含在植物細(xì)胞中表達(dá)的基 因的細(xì)菌獲得的那些啟動子，所述細(xì)菌如農(nóng)桿菌（Agrobacterium)或根瘤菌（Rhizobium)。 例子為優(yōu)先起始在某些組織，例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞或厚壁組織中的轉(zhuǎn) 錄的啟動子。這種啟動子被稱為"組織優(yōu)選的"。"細(xì)胞類型"特異性啟動子主要驅(qū)動在一 個或多個器官中某些細(xì)胞類型中的表達(dá)，例如根或葉中的維管細(xì)胞。"誘導(dǎo)型"或"調(diào)控型" 啟動子是處于環(huán)境控制下的啟動子?？赏ㄟ^誘導(dǎo)型啟動子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括 無氧條件或光的存在。另一類型的啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子，例如在花粉發(fā)育過程中驅(qū)動 表達(dá)的啟動子。組織優(yōu)選的、細(xì)胞類型特異性的、發(fā)育調(diào)節(jié)的和誘導(dǎo)型的啟動子構(gòu)成了"非 組成型"啟動子類別。"組成型"啟動子為在發(fā)育或細(xì)胞分化的大多數(shù)環(huán)境條件和狀態(tài)下， 在植物的基本上所有組織中都有活性的啟動子。
[0144] 術(shù)語"多肽"指一條或多條氨基酸序列。該術(shù)語還包括其片段、變體、同源物、等位 基因或前體（例如原前蛋白或前蛋白）。"NUE蛋白質(zhì)"包含多肽。除非另有規(guī)定，否則術(shù)語 "NUE核酸"意指包含編碼多肽的多核苷酸（"NUE多核苷酸"）的核酸。
[0145] 如本文所用，"重組的"包括指已通過引入異源核酸進(jìn)行修飾的細(xì)胞或載體，或者 源于經(jīng)這樣修飾過的細(xì)胞的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)不以天然（非重組）形式的細(xì) 胞內(nèi)的相同形式存在的基因，或因?yàn)橛幸馊藶楦深A(yù)而表達(dá)原本異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本 不表達(dá)的天然基因，或可具有減低的或消除的天然基因表達(dá)。本文所用的術(shù)語"重組的"不 涵蓋通過天然發(fā)生的事件（例如自發(fā)突變、天然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座）進(jìn)行的細(xì)胞或載體的 變更，所述事件為例如在沒有蓄意人為干預(yù)的情況下發(fā)生的那些。
[0146] 本文所用的"重組表達(dá)盒"是具有一系列規(guī)定核酸元件的通過重組法或合成法產(chǎn) 生的核酸構(gòu)建體，其允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄?？蓪⒅亟M表達(dá)盒摻入到質(zhì)粒、染色體、 線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了別的序列以外，表達(dá)載體的重組表達(dá) 盒部分還包含待轉(zhuǎn)錄的核酸和啟動子。
[0147] 術(shù)語"選擇性雜交"包括指在嚴(yán)格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交 的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測地更高（例如，至少2倍于背景），并且基本上排 除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少40 %的序列同一性，優(yōu)選60-90 %的 序列同一'丨生，最優(yōu)選1〇〇%的序列同一'I"生（即互補(bǔ)性）。
[0148] 術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括指探針與其靶序列雜交的程度將比它與 其他序列雜交的程度可檢測地更高（例如，至少2倍于背景）的條件。嚴(yán)格條件是序列依 賴性的，并且將在不同環(huán)境下不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒別與探針 可最高達(dá)100%互補(bǔ)的靶序列（同源探測）。或者，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一 些錯配，從而檢測到較低程度的相似性（異源探測）。優(yōu)選地，探針長為大約500個核苷酸， 但長度可變化很大，從小于500個核苷酸到等于靶序列的整個長度。
[0149] 通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約1. 5M鈉離子，通常為約0. 01至1. 0M鈉離 子濃度（或其他鹽），pH為7. 0至8. 3,對短探針（例如，10至50個核苷酸）而言溫度為 至少30°C，對長探針（例如超過50個核苷酸）而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴(yán)格 條件還可通過添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺或Denhardt' s來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格性條件包 括在37°C下用30至35%甲酰胺、1M NaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉）的緩沖溶液雜交， 并在50至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3. 0M NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉）中洗滌。示 例性的中等嚴(yán)格性條件包括37°C下在40至45%甲酰胺、1M NaCl、l% SDS中雜交，并在55 至60°C下在0. 5X至IX SSC中洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50%甲酰胺、1M NaCl、 1%SDS中于37°C下雜交，并在0. IX SSC中于60-65°C下洗滌。特異性通常決定于雜交 后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，T m可根 據(jù) Meinkoth and Wahl，（1984)，六仙1.13;[0。116111.，138:267-84(]^;[111?)1:11和此111，1984年， 《分析生物化學(xué)》，第138卷，第267-284頁）：的方程T m = 81. 5°C +16. 6 (log Μ)+0· 41(% GC)-0. 61(% form)-500/L估計(jì)；其中Μ為單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥嘌呤 核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form為雜交溶液中甲酰胺的百分比，L為雜交體的長 度（單位為堿基對）。TmS50%的互補(bǔ)靶標(biāo)序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度（在確定 的離子強(qiáng)度和pH下）。每1%的錯配，T m降低約1°C ;因此，可調(diào)節(jié)^、雜交和/或洗滌條 件以雜交至所需同一性的序列。例如，如果尋求具有> 90%同一性的序列，則可將Tm降低 l0°C。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的熱 解鏈溫度（Tm)低約5°C。然而，極端嚴(yán)格條件可以采用比熱解鏈溫度（T m)低1、2、3或4°C 的雜交和/或洗滌；適度嚴(yán)格條件可以采用比熱解鏈溫度（Tm)低6、7、8、9或10°C的雜交 和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以采用比熱解鏈溫度（T m)低11、12、13、14、15或20°C的雜交和 /或洗滌；利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，雜交和/或 洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯配程度導(dǎo)致^低于45°C (水 溶液）或32°C (甲酰胺溶液），則優(yōu)選增加 SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核 酸的雜交的詳盡指南見于以下文獻(xiàn)：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, "Elsevier,New York(1993) (Tijssen,《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸 探針雜交》，第I部分，第2章，"核酸探針測定法的雜交原理和策略概覽"，Elsevier出版社， 紐約，1993 年）；以及 Current Protocols in Molecular Biology，chapter2，Ausubel，et al. , eds, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995)(《最新分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》，第2章，Ausubel等人編輯，格林出版公司與約翰威立出版公司，紐約， 1995年）。除非另外指明，否則在本專利申請中，高嚴(yán)格性定義為在65°C下在4X SSC、5X Denhardt' s (500ml水中的5gFicoll，5g聚乙烯批咯燒酮、5g牛血清白蛋白）、0· lmg/ml煮 沸鮭精DNA和25mM磷酸鈉中雜交，并在65°C下在0. IX SSC、0. 1% SDS中洗滌。
[0150] 如本文所用，"轉(zhuǎn)基因植物"包括指在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般 來講，異源多核苷酸穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多 核苷酸可單獨(dú)整合進(jìn)基因組中，或者作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組中。"轉(zhuǎn)基因" 在本文中用來包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、 組織、植物部分或植物，包括那些最初如此變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn) 行有性雜交或無性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不涵蓋通過常規(guī) 植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或 自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組（染色體基因組或染色體外基因組）的改變。
[0151] 如本文所用，"載體"包括指用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。 載體常常是復(fù)制子。表達(dá)載體允許插入其中的核酸轉(zhuǎn)錄。
[0152] 以下術(shù)語用于說明兩個或更多個核酸或多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系：(a) "參 考序列"、（b) "比較窗口"、（c) "序列同一性"、（d) "序列同一性百分?jǐn)?shù)"和（e) "基本上全 同"。
[0153] 如本文所用，"參考序列"是用作序列比較基準(zhǔn)的確定的序列。參考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如全長cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
[0154] 如本文所用，"比較窗口 "意指包括指多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該 多核苷酸序列可與參考序列進(jìn)行比較，并且其中該比較窗口中的該多核苷酸序列部分相比 于參考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便兩個多核苷酸的最佳 比對。通常，比較窗口長度為至少20個連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個或更長。 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，為避免由于在多核苷酸序列中納入空位所致的與參考序列的高度 相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。
[0155] 將核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。局部同源性算 法（BESTFIT)(Smith and Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2 :482(Smith 和 Waterman,1981 年，《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》，第2卷，第482頁））可以對用于比較的序列進(jìn)行最佳比對；Needleman and Wunsch，（1970) J. Mol. Biol. 48 :443-53 (Needleman 和 Wunsch，1970 年，《分子生物學(xué)雜 志》，第48卷，第443-453頁）的同源性比對算法（GAP);相似性搜索方法（Tfasta和Fasta) (Pearson and Lipman, (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444 (Pearson 和 Lipman,1988 年，《美國國家科學(xué)院院刊》，第85卷，第2444頁））；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施包括，但不限 于：Intelligenetics (加州山景城（Mountain View，California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package』第 8版（可得自 Genetics Computer 61"〇即（〇0(〕1(程序（Accelrys 公司（加州圣地亞哥（San Diego，CA)))中的 GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文獻(xiàn)詳細(xì)說明：Higginsh and Sharp，（1988) Gene73 :237-44 (Higgins 和 Sharp，1988 年，《基因》，第 73 卷，第 237-244 頁）；Higgins and Sharp，（1989) CABI0S5 :151-3 (Higgins和Sharp，1989年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的應(yīng)用》， 第 5 卷，第 151-153 頁）；Corpet，et al.，（1988)Nucleic Acids Res.l6:10881_90(Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第 10881-10890 頁）；Huang，et al.，（1992) Computer Applications in the Biosciences8 :155-65 (Huang 等人，1992 年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué) 中的應(yīng)用》，第 8 卷，第 155_165 頁）以及 Pearson et al·，（l994)Meth.Mol.Biol.，24: 307-31 (Pearson等人，1994年，《分子生物學(xué)方法》，第24第307-310頁）。用于多個序 列的最佳全局比對的優(yōu)選程序是 PileUp(Feng and Doolittle, (1987) J.Mol.Evol.，25: 351-60 (Feng和Doolittle，1987年，《分子進(jìn)化學(xué)雜志》，第25卷，第351-360頁），其類似于 Higgins and Sharp，（1989) C4BI0S5 :151-53 (Higgins 和 Sharp，1989 年，《計(jì)算機(jī)在生物科 學(xué)中的應(yīng)用》，第5卷，第151-153頁）中描述的方法，將文獻(xiàn)以引用的方式并入本文?？捎糜?數(shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù) 庫序列進(jìn)行查詢；BLASTX，用于核苷酸查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；BLASTP， 用于蛋白質(zhì)查詢序列針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；TBLASTN，用于蛋白質(zhì)查詢序列針對 核苷酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行查詢；以及TBLASTX，用于核苷酸查詢序列針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列 進(jìn)行查詢° 參見 Current Protocols in Molecular Biology, Chapterl9,Ausubel et al., eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《現(xiàn)代分子生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，第19章，Ausubel等人（編輯），威利-英特科學(xué)出版公司，紐約，1995年）。
[0156] GAP利用Needleman和Wunsch(出處同上）的算法來尋找兩個完整序列的比對，該 比對使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大 數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。它允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和 空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大 于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。 Wisconsin Genetics軟件包第10版中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8 和2。空位產(chǎn)生和空位延伸罰分可以以選自0-100的整數(shù)來表示。因而，例如，空位產(chǎn)生和 空位延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
[0157] GAP給出具有最佳比對的家族中的一個成員。可能存在這個家族的許多成員，但其 他成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)值因子：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。 品質(zhì)是為了比對序列而最大化的指標(biāo)（metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同 一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號的百分?jǐn)?shù)。將對應(yīng)于 空位的符號忽略。當(dāng)一對符號的評分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值）時(shí)，評定為相 似性。威斯康星遺傳學(xué)軟件包版本10中所用的打分矩陣為BL0SUM62(參見Henikoff and Henikoff，（l989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:l〇9l5(Henikoff 和 Henikoff，I989 年，《美 國國家科學(xué)院院刊》，第89卷，第10915頁））。
[0158] 除非另外指明，否則本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2. 0程 序包，采用默認(rèn)參數(shù)獲得的值（Altschul，et al·，（1997)Nucleic Acids Res. 25 : 3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402頁））。
[0159] 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解的，BLAST搜索假定蛋白質(zhì)可以隨機(jī)序列建模。然 而，許多真實(shí)蛋白質(zhì)包含非隨機(jī)序列區(qū)，該非隨機(jī)序列可為同聚段、短周期重復(fù)或富含一種 或多種氨基酸的區(qū)域。這種低復(fù)雜性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白質(zhì)之間比對，盡管該蛋白質(zhì)的 其他區(qū)域完全不相似?？刹捎枚喾N低復(fù)雜性過濾程序來減少這種低復(fù)雜性比對。例如，可單 獨(dú)使用或聯(lián)合使用 SEG(Wooten and Federhen，（1993)Comput.Chem. 17 :149-63 (Wooten 和 Federhen，1993 年，《計(jì)算化學(xué)》，第 17 卷，第 149-163 頁））和 XNU(Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States，1993 年，《計(jì)算化學(xué)》，第 17 卷，第 191-201頁））低復(fù)雜性過濾程序。
[0160] 在兩條多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的"序列同一性"或"同一性"是指 當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對以獲得最大對應(yīng)時(shí)兩個序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性 百分?jǐn)?shù)針對蛋白質(zhì)使用時(shí)，認(rèn)識到不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中 氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)（例如電荷或疏水性）的其他氨基酸殘基置換，因此不會 改變分子的功能性質(zhì)。如果序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置 換的保守性質(zhì)。差別在于這種保守置換的序列被說成具有"序列相似性"或"相似性"。作出 這個調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換評定為部分錯配而 不是完全錯配，從而增加序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保 守置換給予〇分，則保守置換給予〇至1之間的分?jǐn)?shù)。例如，根據(jù)Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :ll_17(Meyers 和 Miller，1988 年，《計(jì)算機(jī)在生物科學(xué)中的 應(yīng)用》，第4卷，第11-17頁）的算法計(jì)算保守置換的分?jǐn)?shù)，例如如在程序PC/GENE (美國加利 福尼亞州山景城 Intelligenetics 公司(Intelligenetics, Mountain View, California, USA))中所實(shí)現(xiàn)的。
[0161] 本文所用的"序列同一性百分?jǐn)?shù)"意指通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序 列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參考序列（不包含添加或缺 失）相比包含添加或缺失（即空位），以便兩個序列的最佳比對。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的： 確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù) 目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序 列同一性百分?jǐn)?shù)。
[0162] 術(shù)語多核苷酸序列的"基本上相同"意指利用所描述的比對程序之一采用標(biāo)準(zhǔn)參 數(shù)與參考序列比較時(shí)，多核苷酸包含具有50-100%之間的序列同一性，優(yōu)選至少50%的序 列同一'I"生，優(yōu)選至少60 %的序列同一'丨生，優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 % 且最優(yōu)選至少95%序列同一性的序列。技術(shù)人員將會認(rèn)識到，可通過考慮密碼子簡并性、氨 基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這些值以確定兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相 應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列的實(shí)質(zhì)同一性通常意指55-100%之間的序列同一 性，優(yōu)選至少55 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %、80 %、90 %，最優(yōu)選至少95 %。
[0163] 在肽的情形中，術(shù)語"基本上相同"指肽包含在指定比較窗口上與參考序列具有 55-100 %之間的序列同一性；優(yōu)選與參考序列具有至少55%的序列同一性，優(yōu)選60%，優(yōu) 選70%，更優(yōu)選80%，最優(yōu)選至少90 %或95%的序列同一性。優(yōu)選地，利用Needleman和 Wunsch(出處同上）的同源比對算法進(jìn)行最佳比對。兩條肽序列是基本上相同的指示是，一 種肽可與針對第二種肽產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。因而，例如，如果某種肽與第二種肽差別 僅在于保守置換的話，則這兩種肽基本上相同。此外，當(dāng)某種肽與第二種肽差別在于非保守 變化時(shí)，如果抗體識別的表位基本上相同，則它們基本上相同。"基本上相似的"肽共有如上 所述的序列，例外的是不相同的殘基位置差別可在于保守氨基酸變化。
[0164] 表 1
[0165]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于在氮限制條件下通過下列方式在植物中增加產(chǎn)量或維持產(chǎn)量穩(wěn)定性的方 法：a)減少雄性生殖組織發(fā)育；以及b)在雄性和雌性組織同時(shí)發(fā)育期間增加分配至雌性生 殖組織的營養(yǎng)物質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雄性生殖組織為穗絲。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖組織發(fā)育通過減少NIP3-1的表達(dá)而 減少。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖組織發(fā)育通過增加 SEQ ID NO :63的 表達(dá)而減少。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖組織發(fā)育通過表達(dá)無穗絲突變基因 而減少。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖組織發(fā)育在用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的植物中 減少，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至啟動子序列的SEQ ID NO :63。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述啟動子優(yōu)先地驅(qū)動雄性生殖組織中的表達(dá)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述啟動子序列為組織特異性啟動子、組成型啟 動子或誘導(dǎo)型啟動子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述組織優(yōu)選的啟動子為穗絲特異性啟動子。
10. 衍生自根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法的植物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物的細(xì)胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物的種子或子代。
13. 包含多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸引發(fā)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄并且包括 選自如下的序列： a. SEQ ID NO ：63 ； b. SEQ ID NO :63的至少100個連續(xù)核苷酸； c. 與SEQ ID NO :63的全長具有至少70%序列同一性的序列；以及 d. 編碼TLS1蛋白的多核苷酸，所述TLS1蛋白包括SEQ ID N0:107的氨基酸序列或與 SEQ ID NO :107至少70%或80%或85%或90%或95%相同的序列。
14. 表達(dá)盒，其包含可操作地連接到目的多核苷酸的根據(jù)權(quán)利要求13所述的多核苷 酸。
15. 載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)盒。
16. 植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞在其基因組中穩(wěn)定摻入根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)盒。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕 麥、裸麥、高粱或水稻。
19. 植物，所述植物在其基因組中穩(wěn)定摻入根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)盒。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，其中所述單子葉植物為玉蜀黍、大麥、小麥、燕麥、裸 麥、高粱或水稻。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物的轉(zhuǎn)基因種子。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其中所述目的多核苷酸編碼賦予病原體或昆蟲抗性 的基因廣物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其中所述表達(dá)盒編碼涉及營養(yǎng)物質(zhì)吸收、氮利用效 率、耐旱性、根強(qiáng)度、根耐倒伏性、土壤害蟲管理、玉米根蟲抗性、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代 謝、脂肪酸代謝或植物激素生物合成的多肽。
25. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)盒，其靶向編碼選自如下序列的氨基酸序列的基因的 抑制： a. SEQ ID NO :107,以及 b. 與SEQ ID NO :107至少70%或80%或85%或90%或95%相同的序列。
26. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中穗絲發(fā)育通過使用影響硼吸收和/或硼轉(zhuǎn)運(yùn)的基 因來改善。
27. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中將硼施加到植物用于維持所述純合突變種子。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述植物穗絲尺寸增加。
29. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述硼毒性耐性增加。
30. -種鑒別tlsl的較弱等位基因的方法，所述方法包括如下步驟： a. 對突變型玉蜀黍植物群體進(jìn)行遺傳篩選 b. 鑒別與tlsl無效植物相比表現(xiàn)出弱tlsl表型的一個或多個突變型玉蜀黍植物 c. 從具有較弱tlsl表型的所述突變型玉蜀黍植物中鑒別所述弱tlsl等位基因。
31. -種鑒別tlsl的較弱等位基因的方法，所述方法包括如下步驟： a. 使用編碼SEQ ID NO : 107或其片段的一個或多個多核苷酸進(jìn)行基因改組； b. 將來自步驟（a)的所述改組序列轉(zhuǎn)化進(jìn)可再生植物細(xì)胞的群體； c. 從步驟（b)的轉(zhuǎn)化的可再生植物細(xì)胞的群體中再生轉(zhuǎn)化植物的群體； d. 從來自步驟（c)的轉(zhuǎn)化植物的群體篩選弱fea3表型；以及 e. 從表現(xiàn)出弱tlsl表型的轉(zhuǎn)化植物中鑒別弱tlsl等位基因。
32. 其中外源tlsl基因的表達(dá)相對于對照植物減少的植物，其中穗發(fā)育是正常的。
33. 相對于野生型植物表現(xiàn)出較弱tlsl表型的植物。
34. 生成較弱tlsl突變體的方法，所述方法包括： a. 將突變引入內(nèi)源Tlsl基因； b. 通過對所述Tlsl基因測序檢測所述突變； c. 鑒別較弱的tlsl表型。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中執(zhí)行靶向誘導(dǎo)基因組局部突變（TILLING)方法 以誘導(dǎo)突變。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述突變?yōu)槲稽c(diǎn)特異性的。
【文檔編號】C12N15/82GK104204209SQ201380014342
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月13日
【發(fā)明者】M.C.阿爾伯森, A.L.倫納德, B.李, 沈波 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司