一種用于擴(kuò)增紅球菌的pcr引物及檢測(cè)紅球菌的方法及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，公開(kāi)了一對(duì)用于擴(kuò)增紅球菌DNA的PCR引物，其上游引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明還提供用所述引物檢測(cè)紅球菌的方法及試劑盒。本發(fā)明所述引物適合于純化紅球菌擴(kuò)增DNA，也適合于從混合菌群擴(kuò)增紅球菌DNA，擴(kuò)增紅球菌安全、準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，靈敏度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于擴(kuò)增紅球菌的PCR引物及檢測(cè)紅球菌的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于擴(kuò)增紅球菌的PCR引物及檢測(cè)紅球菌的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]紅球菌屬細(xì)菌屬于放線(xiàn)菌目棒桿菌亞目諾卡氏菌科，是一類(lèi)好氧，不產(chǎn)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌，少數(shù)可能致病。紅球菌屬中的主要成員包括:嗜糞紅球菌、馬紅球菌、滕黃紅球菌、紅平紅球菌等。紅球菌具有一個(gè)相對(duì)快速和簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)周期，可作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行科學(xué)研究。大多數(shù)紅球菌能在廣泛的環(huán)境中生長(zhǎng)，比如沙漠，水體等。
[0003]紅球菌具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其重要作用是進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。紅球菌能利用自身的生物系統(tǒng)將原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，如利用很多有機(jī)物生成類(lèi)固醇、丙烯酰胺和丙烯酸等。另外紅球菌能降解及利用一些環(huán)境污染物及有機(jī)物如烷烴，代謝有害的環(huán)境污染物，例如甲苯、萘等，并且與化石燃料的生物脫硫作用有關(guān)。同時(shí)它的一些種對(duì)人、動(dòng)物或植物都有影響。因此，紅球菌越來(lái)越為人們所關(guān)注。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，有如下兩種常用的對(duì)紅球菌進(jìn)行鑒定的方法:
[0005]1、生理生化指標(biāo)鑒定。此方法是目前許多生化實(shí)驗(yàn)室常用的方法，此方法需要得到菌株的純培養(yǎng)物，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受人為觀察影響因素較大，準(zhǔn)確性不高。
[0006]2、提取菌株DNA進(jìn)行測(cè)序。目前是用16SrRNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。此方法結(jié)果比較準(zhǔn)確。但仍需要得到菌株的純培養(yǎng)物，無(wú)法從混合樣品中快速鑒定是否含有紅球菌·。
[0007]因此本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)出一種能夠快速、準(zhǔn)確判定紅球菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)鑒定紅球菌試驗(yàn)周期長(zhǎng)、適用范圍窄的不足，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確、方便，可對(duì)混合樣品如土壤、海底沉積物、水中是否含有紅球菌進(jìn)行快速判定的方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)的發(fā)明人設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)紅球菌16SrDNA基因部分片段的 PCR 引物，Rho-F:5’ -GGGTCTAATACCGGATAKGACC-3’(序列如 SEQ ID N0.1 所示)，Rho-R:5’-CCCGTATCGCCTGCAAGC-3’(序列如 SEQ ID N0.2 所示)。16S rDNA 基因是指基因組中編碼16S核糖體RNA (rRNA)分子的對(duì)應(yīng)DNA序列，也就是編碼16S rRNA的基因。
[0010]本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“引物”指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長(zhǎng)度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3'端開(kāi)始合成新的核酸鏈。體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序和探針合成等。[0011]本發(fā)明提供一種檢測(cè)紅球菌的試劑盒，包含用于擴(kuò)增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ IDN0.2所示。作為優(yōu)選，所述PCR引物為熒光定量PCR引物。
[0012] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)紅球菌的方法，包含以下步驟:
[0013]步驟1:配制PCR反應(yīng)體系，94°C預(yù)變性10分鐘進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)完畢后72°C延伸10分鐘；所述PCR反應(yīng)體系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如 SEQ ID N0.2 所示；
[0014]步驟2:檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。
[0015]作為優(yōu)選，步驟I所述PCR循環(huán)參數(shù)為:94°C變性lmin、58°C復(fù)性lmin、72°C延伸lmin。
[0016]作為優(yōu)選，步驟I中所述PCR反應(yīng)體系為:
[0017]
PCR緩沖液:5|iL
dNTP: 4pL
Primer F上游引物:IjiL
Primer R T游引物:IpL
樣品 DNA: ΙμΙ
Taq:0,5μ?

ddH20: 37.SpL
[0018]其中，樣品DNA濃度為10-200ng/yL，上游引物及下游引物濃度為10-20pmol/μ L0
[0019]更優(yōu)選地，步驟2所述檢測(cè)為瓊脂糖電泳檢測(cè)450bp的條帶出現(xiàn)。
[0020]更優(yōu)選地，所述PCR為熒光定量PCR。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下有益效果:
[0022]1.本發(fā)明所述紅球菌檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，結(jié)果更精確。
[0023]2.本發(fā)明所述引物目標(biāo)位于16S rDNA基因，該基因在進(jìn)化中較為保守，是分類(lèi)學(xué)研究中常用的研究對(duì)象，具有較好的特異性。
[0024]3.本發(fā)明所述方法檢測(cè)周期短，在3小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果、適用范圍廣，無(wú)需分離純菌株即可對(duì)各種環(huán)境樣品中是否含有紅球菌屬細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；
[0026]圖2本發(fā)明所述引物以土壤DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道1_3分別為不同土壤的DNA樣品；
[0027]圖3本發(fā)明所述引物以混合菌株DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道I和泳道2為同一 DNA樣品。[0028]圖4本發(fā)明所述引物以紅球菌DNA配制的梯度濃度的DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中泳道1-6中所含DNA含量分別為200ng，200X10 —SgdOOXlO —2ng、200X10一3ng、200X 10 4ng、200X 10 5ng。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明公開(kāi)了一種用于擴(kuò)增紅球菌的PCR引物及檢測(cè)紅球菌的方法及試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0030]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0031]實(shí)施例1:以純培養(yǎng)物基因組DNA為模板用本發(fā)明所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0032]步驟1:選取含有紅球菌的混合菌培養(yǎng)物，提取其基因組DNA。提取方法參照TAKARA公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，得到混合菌的基因組DNA.[0033]步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配制為100_200ng/ μ L的DNA樣品，與10-20pmol/μ L的PCR引物配成如下50 μ L反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng):
[0034]

PCR buffer: 5μ1
dNTP; 4pL
Primer F上游引物:IpJL
Primer R下游引抽:I pL
DNA:1pL
Taq: 0.5μ[
ddH.?0: 3^.5μL
[0035]步驟3:按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序如下:
[0036]I預(yù)變性94°C 10分鐘
2變性 94 O I分鐘
3復(fù)性 58? I分鐘
4延伸 72°C I分鐘
2至4循環(huán)30次
5延伸 726C 10分舞
[0037]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0038]步驟4:電泳觀察。取出PCR終產(chǎn)物5 μ L與I μ L上樣緩沖液混合，80V, 1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，在凝膠電泳成像儀下紫外觀察。結(jié)果見(jiàn)圖1所示，其中，泳道M為marker，泳道I為含有紅球菌的混合菌DNA樣品，可見(jiàn)泳道I特異擴(kuò)增出450bp的條帶。將擴(kuò)增出的條帶回收后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，所擴(kuò)增的450bp條帶即為引物設(shè)計(jì)時(shí)紅球菌屬的目標(biāo)基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0039]實(shí)施例2:以土壤細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增
[0040]步驟1:取I至2克土壤樣品，提取其微生物總DNA。提取方法參照DNA Recoveryfrom Soils of Diverse Composition (JIZH0NG ZHOU, 1996),得到土壤總 DNA 溶液。
[0041 ] 步驟2:以步驟I得到的DNA為模板，配制為100_200ng/ μ L的DNA樣品，與10-20pmol/μ L的PCR引物配成如下50 μ L反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng):
[0042]

PCR buffer: SpL
dNTP: 4μ?
Primer F上游引物: IpL
Primer R T 游引物:ΙμΙ*

DNA: ΙμΕ
Taq ; 0-5μ[

(JdTH2O ; 37.5μ[
[0043]步驟3:按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序如下:
[0044]
I預(yù)變性940C 10分鐘
2變性 94"C I分鐘
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)擴(kuò)增紅球菌DNA的PCR引物，其特征在于，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR引物，其特征在于，所述PCR為熒光定量PCR。
3.—種檢測(cè)紅球菌的試劑盒，其特征在于，包含用于擴(kuò)增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ IDN0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR為熒光定量PCR。
5.一種檢測(cè)紅球菌的方法，包含以下步驟: 步驟1:配制PCR反應(yīng)體系，94°C預(yù)變性10分鐘進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)完畢后72°C延伸10分鐘；所述PCR反應(yīng)體系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQID N0.2 所示； 步驟2:檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟I所述PCR循環(huán)參數(shù)為:94°C變性lmin、58°C復(fù)性 lmin、72°C延伸 lmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟I中所述PCR反應(yīng)體系為:
PCR緩沖液:5 |iL
dNTP: 4μΕ
Primer F上游引德:I μ?
Primer R下游引楊:Ιμ?
樣品 DNA:
Taq:OJpL
ddH20 ; 37.5μ￡ 其中，樣品DNA濃度為lOIOOng/yL，上游引物及下游引物濃度為10-20pmol/μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟2所述檢測(cè)為瓊脂糖電泳檢測(cè)450bp的條帶出現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述PCR為熒光定量PCR。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571968SQ201310606953
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】梅海, 郝純, 鄧詩(shī)財(cái), 李雪 申請(qǐng)人:盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)（北京）有限公司