miR-218模擬物、其應(yīng)用以及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法
【專(zhuān)利摘要】一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，步驟包括：利用定量PCR法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmi1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR法檢測(cè)Bmi1轉(zhuǎn)錄水平；利用劃痕法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)；利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，能夠有效的篩選出對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲活性具有抑制作用的藥物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種RNA分子miR-218模擬物及其在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】mi R-218模擬物、其應(yīng)用以及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,特別涉及一種miRNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)瘤是臨床上最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的45%左右。按膠質(zhì)瘤的惡性程度分為I 一 IV級(jí)，級(jí)別愈高，其惡性程度愈大。在所有膠質(zhì)瘤病人中，25%~50%的為II級(jí)；50%~75%的為III級(jí)；75%~100%為IV級(jí)。惡性度高者瘤內(nèi)常有壞死與出血，血管豐富，血管外層及內(nèi)皮細(xì)胞均有明顯增生，除手術(shù)切除外，膠質(zhì)瘤的藥物療效和放療效果都不甚理想，因此膠質(zhì)瘤是療效最差的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)瘤病人的一年總生存率低于30%，級(jí)別高的病人中位生存期只有大概15個(gè)月。膠質(zhì)瘤預(yù)后差的一個(gè)主要原因?yàn)槟z質(zhì)瘤的高度侵襲能力，惡性程度高的膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤成份與正常腦組織的分界模糊，手術(shù)往往不能將腫瘤組織完整切除，術(shù)后膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率較高。復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤中，超過(guò)90%起源于手術(shù)區(qū)的浸潤(rùn)瘤細(xì)胞或手術(shù)區(qū)邊緣的癌細(xì)胞。理解膠質(zhì)瘤的遷移機(jī)制，尋找和發(fā)現(xiàn)新的膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的基因和信號(hào)途徑對(duì)于膠質(zhì)瘤的分子干預(yù)具有重要的意義。
[0003]原癌基因Bmil (B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertionsitel)是在1991年首次被報(bào)道，屬于多梳基因家族(Polycomb Group genes, PcG)成員，是與細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和細(xì)胞增殖相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的調(diào)節(jié)，Bmil基因在多種惡性腫瘤如膠質(zhì)瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等中大量表達(dá)，并且與這些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。INK4a/ARF是Bmil基因調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和老化的靶點(diǎn)，在Bmil缺陷的小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)和淋巴細(xì)胞中，INK4a/ARF表達(dá)水平明顯升高，相反，Bmil過(guò)度表達(dá)的MEF細(xì)胞中INK4a/ARF蛋白下調(diào)，細(xì)胞可發(fā)生永生化，所以Bmil通過(guò)抑制INK4a/ARF基因的表達(dá)來(lái)維持細(xì)胞的自我更新。Bmil在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且敲除Bmil的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體成瘤能力減弱。
[0004]MicroRNA (miR,也稱(chēng)miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為20-25核苷酸的非編碼的單鏈RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)核苷酸大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，通過(guò)與mRNA互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控心臟疾病、血管疾病、神經(jīng)和腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。腫瘤的侵襲性是區(qū)別惡性腫瘤和良性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是目前惡性 腫瘤難以治愈最終導(dǎo)致死亡的重要原因，因此研究腫瘤侵襲的調(diào)控機(jī)制一直是腫瘤領(lǐng)域的主要方向。但是腫瘤的侵襲是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程，所以能夠同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)的mircoRNA自從發(fā)現(xiàn)之日起就成為了腫瘤發(fā)生和侵襲過(guò)程中研究熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的篩選方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，成本低，應(yīng)用該方法成功篩選并驗(yàn)證了 miR-218模擬物具有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的效果，從而達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤的目的。
[0006]本發(fā)明的第一方面，涉及一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含miR-218核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下:5’ -UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQID N0.3)。
[0007]本發(fā)明的第二方面，涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第三方面，涉及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:
[0009](1)利用定量PCR法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmi 1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；
[0010]將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,定量PCR法檢測(cè)Bmil轉(zhuǎn)錄水平。
[0011]擴(kuò)增Bmil的引物如下:
[0012]Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG (SEQ ID N0.1)，
[0013]Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC (SEQ ID N0.2)；[0014](2)利用劃痕法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)；
[0015](3)利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟(1)中定量PCR體系為:10μ 1的Premix Ex Taq (SYBR qPCR)(2X)，10ymol/L的Bmil上下游上下游引物各0.5μ 1，待檢cDNA模板或陰性對(duì)照1μ 1，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μ 1。
[0017]優(yōu)選地，步驟(1)中PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后95。。15s，60°C 20s，72°C 20s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
[0018]步驟(2)中采用“劃痕法”對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)的步驟為，用待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12h對(duì)其進(jìn)行饑餓干預(yù)。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個(gè)方向劃單層膠質(zhì)瘤細(xì)胞，每孔平行的劃1次，形成1條無(wú)細(xì)胞劃痕區(qū)。PBS清洗細(xì)胞2次，加入無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液。在0小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并計(jì)算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。
[0019]步驟(3)中，利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)的步驟為，待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)N5X 105個(gè)細(xì)胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)后，用棉簽擦去上層未侵襲的細(xì)胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。
[0020]進(jìn)一步地，上述篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之前還包括步驟:構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut重組質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒分別與待篩選藥物共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T細(xì)胞株。
[0021]重組質(zhì)粒pmirGL0-Bmil3’ -UTR的構(gòu)建方法為:根據(jù)NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結(jié)合位點(diǎn)的長(zhǎng)度為390bp的3’_UTR序列，兩端含有的酶切位點(diǎn)為Sac I, Xbal,利用這兩位點(diǎn)連接入pmirGLODual-Luciferase miRNA TargetExpression Vector 載體(promega)。插入序列如下:[0022]>Bmil-wt
[0023]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGAAGCACAATTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAAAAGCACAATGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.4)
[0024]重組質(zhì)粒pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut的構(gòu)建方法為:根據(jù)NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結(jié)合位點(diǎn)突變的長(zhǎng)度為390bp的3‘_UTR序列，具體突變是將pmirGL0-Bmil3’-UTR中的兩處長(zhǎng)度為8bp的序列:AAGCACAA替換為T(mén)TTGTGTT。兩端含有的酶切位點(diǎn)為Sac I, Xbal,利用這兩位點(diǎn)連接入pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression Vector 載體(promega)。插入序列如下:
[0025]>Bmil_mut
[0026]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGTTTGTGTTTTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAATTTGTGTTTGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.5)
[0027]重組質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0028] 進(jìn)一步地，上述篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之后，還包括步驟:利用Western blot法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmil蛋白表達(dá)的抑制作用。具體步驟為:
[0029]按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉(zhuǎn)膜lOOrnin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或?qū)φ?a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋?zhuān)筧-tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過(guò)夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤(rùn)NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。
[0030]有益效果
[0031]本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，能夠有效篩選出可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲活性的藥物，同時(shí)為膠質(zhì)瘤的防治提供有效干預(yù)靶點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為重組質(zhì)粒圖譜；
[0033]圖2為計(jì)算機(jī)軟件分析顯示Bmil的3’非翻譯區(qū)存在兩個(gè)miR-218的作用靶點(diǎn)；
[0034]圖3顯示了 miR-218模擬物能夠抑制攜帶Bmil靶序列熒光素酶的相對(duì)活性；
[0035]圖4顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；[0036]圖5顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；
[0037]圖6顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移；
[0038]圖7顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。
[0039]本發(fā)明中所述生化試劑及生物材料均可從市售渠道獲得，比如工具細(xì)胞293T細(xì)胞株可以通過(guò)上海拜力生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)獲得，膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，Bmil抗體購(gòu)自Cell SignalingTechnology)公司。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0041]實(shí)施例1
[0042]1.miR-218靶基因的篩選
[0043]運(yùn)用PicTar、TargetScan等軟件檢索miR-218可能的祀基因，發(fā)現(xiàn)Bmil基因的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)含有2個(gè)miR-218的靶位點(diǎn)(附圖2)。因此miR-218類(lèi)似序列可能具有抑制原癌基因Bmil表達(dá)的功能。
[0044]2.報(bào)告基因驗(yàn)證Bmil是miR-218的靶基因
[0045]構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR 和 pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut 重組質(zhì)粒
[0046]構(gòu)建方法:人工合成了含有miR-218結(jié)合位點(diǎn)的Bmi 13 ’ -UTR的長(zhǎng)度為390bp的序列，通過(guò)限制性內(nèi)切酶Sac I, Xbal連接入相同酶切的pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector 載體中即獲得 pmirGL0_Bmil3’ -UTR 載體。將pmirGL0-Bmil3’ -UTR兩處長(zhǎng)度為8bp的序列:AAGCACAA替換為T(mén)TTGTGTT就構(gòu)建成pmirGL0_Bmil3，-UTR - mut 載體。
[0047]pmirGL0-Bmil3’ -UTR載體中將含有可以與miR-218結(jié)合的位點(diǎn)Bmil3’ -UTR序列與螢火蟲(chóng)熒光素酶基因融合，使轉(zhuǎn)錄出來(lái)的螢火蟲(chóng)熒光素酶3’ -UTR含有miR-218的結(jié)合位點(diǎn)，這樣在和miR-218共轉(zhuǎn)染的時(shí)候，miR-218將會(huì)通過(guò)與結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。在pmirGL0-Bmil3’ -UTR - mut載體中miR-218結(jié)合位點(diǎn)被突變掉，所以與miR-218共轉(zhuǎn)染的時(shí)候不會(huì)影響螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。載體中海參熒光素酶作為內(nèi)參，測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶與海參熒光素酶的活性比值就可以確定系統(tǒng)中螢火蟲(chóng)熒光素酶的含量，進(jìn)而判斷出預(yù)測(cè)的miR-218結(jié)合位點(diǎn)是否真的和miR-218結(jié)合。具體方法:將 pmirG LO 空載體,pmirGL0-Bmil3’ -UTR 載體與 pmirGL0_Bmil3’ -UTR - mut 分別與miR-218模擬物共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染24h后用專(zhuān)用裂解液裂解細(xì)胞，每孔100 μ 1，打均勻，充分裂解后樣品備用。采用Promega公司的熒光素酶檢測(cè)試劑盒，在1.5ml離心管中加入LARII50 μ 1和裂解液5 μ 1混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶；加入50 μ 1 Stop&Glo溶液滅活螢火蟲(chóng)熒光素酶，酶標(biāo)儀檢測(cè)海參熒光素酶，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶與海參熒光素酶的比值。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-218的模擬物后熒光素的表達(dá)下降了約50%左右，而突變與miR-218的模擬物結(jié)合位點(diǎn)以后螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)恢復(fù)(見(jiàn)附圖3)，證明Bmil是miR-218的直接靶基因。
[0048]3.利用定量PCR法和Western blot法檢測(cè)miR-218模擬物對(duì)Bmil轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)的抑制作用
[0049]miR-218模擬物或miR-對(duì)照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞72小時(shí)后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;定量PCR體系為:10 μ 1的Premix Ex Taq(SYBR qPCR) (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對(duì)照1 μ 1，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μ KPCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后95°C 15s,60°C 20s,72°C 20s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。發(fā)現(xiàn)增加了 miR-218模擬物在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)量后，Bmil轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯下降。
[0050]miR-218模擬物或miR-對(duì)照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞72小時(shí)后，收集細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行電泳。電泳時(shí)，按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉(zhuǎn)膜lOOmin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或?qū)φ?a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋?zhuān)功?tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過(guò)夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤(rùn)NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果可見(jiàn)，增加了miR-218模擬物在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)量后，Bmil蛋白的表達(dá)量明顯下降。(見(jiàn)附圖5) [0051]4.膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)
[0052]采用“劃痕法”對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移活性進(jìn)行研究。miR-218模擬物或miR-對(duì)照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12h對(duì)其進(jìn)行饑餓干預(yù)。此時(shí)細(xì)胞應(yīng)布滿培養(yǎng)板底，形成單層細(xì)胞。用200 μ 1滅菌槍頭勻速勻力的向一個(gè)方向劃單層膠質(zhì)瘤細(xì)胞，每孔平行的劃1次，形成1條無(wú)細(xì)胞劃痕區(qū)。PBS清洗細(xì)胞2次，加入無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)。在顯微鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)板底部為細(xì)胞劃痕邊緣做記號(hào)并拍攝照片。在0小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并拍照。用Image-proplus6.0軟件計(jì)算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-對(duì)照的膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移活性大大增加，劃痕愈合為12小時(shí)是25.1%, 24小時(shí)為43.2%。而運(yùn)用miR-218模擬物增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-218的表達(dá)量能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移，劃痕愈合率為12小時(shí)是19.2%24小時(shí)為34.2%(見(jiàn)附圖6)。
[0053]5.膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)
[0054]利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤的侵襲活性進(jìn)行研究。miR-218模擬物或miR-對(duì)照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)N5X 105個(gè)細(xì)胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)后，用棉簽擦去上層未侵襲的細(xì)胞，用100%甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用miR-218模擬物增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-218的表達(dá)量能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲(見(jiàn)附圖7)。
[0055]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含如下序列:5，-U腳GCUUGAUCUAACCA腳-3'
2.如權(quán)利要求1所述的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
3.一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:(1)利用定量PCR法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmil轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR法檢測(cè)Bmil轉(zhuǎn)錄水平。擴(kuò)增Bmil的引物如下:Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG,Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC ；(2)利用劃痕法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)；(3)利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述步驟(1)中的定量PCR體系為:10μ1的PremixEx Taq (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對(duì)照1 μ 1，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μ 1。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后 95°C 15s，60°C 20s，7`2°C 20s，反應(yīng) 40 個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(2)中采用“劃痕法”對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)的步驟為，用待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12h對(duì)其進(jìn)行饑餓干預(yù)。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個(gè)方向劃單層膠質(zhì)瘤細(xì)胞,每孔平行的劃1次，形成1條無(wú)細(xì)胞劃痕區(qū)。PBS清洗細(xì)胞2次，加入無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液。在0小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并計(jì)算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(3)中，利用transwell法對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲進(jìn)行檢測(cè)的步驟為，待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48小時(shí)后換無(wú)血清的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋?zhuān)N5X105個(gè)細(xì)胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)后，用棉簽擦去上層未侵襲的細(xì)胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在步驟(1)之前還包括步驟:構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0-Bmil3’ -UTR-mut重組質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒分別與待篩選藥物共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T細(xì)胞株。
9.如權(quán)利要求3所述的方法,其中，在步驟(1)之后,還包括步驟:利用Westernblot法檢測(cè)待篩選藥物對(duì)Bmil蛋白表達(dá)的抑制作用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103740809SQ201310567075
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】金衛(wèi)林, 高興春, 涂艷陽(yáng), 崔大祥 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)