一種基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于漆酶氨基酸殘基末端的羧基(-COOH)與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽的氨基發(fā)生交聯(lián)反應使漆酶活性、穩(wěn)定性提高的改性方法，包括將漆酶、L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽在一定溫度下進行混合反應，得到改性后的漆酶。與未改性漆酶相比，改性漆酶的活性、穩(wěn)定性得到提高。該改性漆酶可用于再生植物纖維改性，在使再生植物纖維所抄造紙頁強度性能提高的同時可節(jié)省漆酶用量。
【專利說明】一種基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及制漿造紙及生物工程領域，具體涉及一種漆酶活性、穩(wěn)定性提高的改性方法及改性漆酶在再生植物纖維改性的應用。
【背景技術】
[0002]與原生植物纖維相比，再生植物纖維的潤脹性能、纖維強度和紙頁物理性能均有下降。再生植物纖維強度的降低大大影響了其回收利用，為了提高再生植物纖維的強度性能，提高其利用水平和價值，有必要對其進行改性處理。在再生植物纖維改性的眾多方法中，漆酶及漆酶介體體系是目前較為理想的一種再生植物纖維生物改性方法。其優(yōu)點有:
(I)反應條件溫和；(2)對纖維造成的損傷很少；(3)對環(huán)境不會造成二次污染。
[0003]漆酶是一類多銅氧化還原酶，可以催化氧化氨基苯酚、多酚、聚胺、芳基二胺和部分無機離子等，廣泛存在于植物、真菌、細菌中。由于漆酶的催化氧化反應只需空氣中的氧氣，副產(chǎn)物只有水，被稱為“綠色催化劑”。另外，由于漆酶具有化學試劑所沒有的一些獨特性質(zhì)，其在食品工業(yè)、化學分析、醫(yī)學、環(huán)保、造紙工業(yè)等方面都有很好的應用潛能。然而由于漆酶在高溫和其它極端環(huán)境下(如pH、溫度、鹽濃度或酶系統(tǒng)中外來物質(zhì)的存在)不穩(wěn)定、極易失活限制了它在工業(yè)上的應用。因此，有必要對漆酶進行一定的改性處理，使其活性、穩(wěn)定性得以提聞。
[0004]研究者已采用聚乙二醇、乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺、戊二醛、葡聚糖、右旋糖苷、鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐、馬來酸酐、檸康酸酐對漆酶進行了化學改性，研究了它們的改性效果。研究顯示這些物質(zhì)化學改性后的漆酶穩(wěn)定性在一定程度上得到了改善，但是改性酶的活性低于未改性酶；或者化學改性后漆酶活性在一定程度上得到了改善，但是改性酶的穩(wěn)定性下降了。另外，有 些改性后的漆酶活性和穩(wěn)定性均提高了，但其提高百分比不大，而且目前的改性方法步驟繁瑣，反應條件苛刻，處理成本較高，不適用于工廠實際應用。例如，右旋糖苷改性漆酶前，需用活化劑溴化氰進行活化，且需要嚴格控制右旋糖苷與溴化氰的用量和比例，溴化氰及其產(chǎn)物右旋糖苷亞胺碳酸鹽有毒，而且亞胺碳酸鹽在水溶液中不穩(wěn)定，活化的右旋糖苷須通過凝膠色譜進行脫鹽處理并須立即使用，此外，右旋糖苷活化時間較長，通常為18?24h，活化產(chǎn)物見光容易分解，所以活化和修飾過程都必須避光進行。本發(fā)明用L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽試劑來改性漆酶，不會引入和產(chǎn)生有毒物質(zhì)，在漆酶活性和穩(wěn)定性提高的同時，所需改性時間較短。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一解決了現(xiàn)有漆酶改性存在的問題和不足，提出了一種新的漆酶活性、穩(wěn)定性提高的改性方法。
[0006]本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn):
[0007]( I)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽水溶液和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，進行反應；[0008](2)反應完成后，用醋酸/醋酸鈉緩沖溶液或磷酸氫二鉀/檸檬酸緩沖溶液透析，得到改性后的漆酶。
[0009]上述方法中，步驟(I)所述原漆酶水溶液中溶質(zhì)原漆酶來源于可以產(chǎn)生漆酶的植物、真菌或細菌中任一種，包括如桃樹、靈芝、嗜熱菌、曲霉菌或毛栓菌。
[0010]上述方法中，步驟(I)所述L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽用量為相對于原漆酶固體量的質(zhì)量百分數(shù)0.001%-10%。
[0011 ] 上述方法中，步驟(I)所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽用量為相對于原漆酶固體量的質(zhì)量百分數(shù)0.001%-2%。
[0012]上述方法中，步驟(I)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽水溶液均用pH為2.0-6.5的磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀(ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04)緩沖溶液配制。
[0013]上述方法中，步驟(I)所述反應的溫度為2_25°C，所述反應的反應時間為
0.5-12h。
[0014]上述方法中，步驟(I)所述反應是在攪拌條件下進行。
[0015]上述方法中，步驟(2)所述醋酸/醋酸鈉緩沖溶液或磷酸氫二鉀/檸檬酸緩沖溶液的 pH 為 3.5-6.0。
[0016]上述方法中，步驟(2)所述透析的時間為12_72h。
[0017]本發(fā)明的又一目的 在于解決現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種改性漆酶在再生植物纖維改性中的應用。
[0018]本發(fā)明所采用的反應原理:
[0019]首先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽活化漆酶中氨基酸殘基末端的羧基(-C00H)，然后活化的漆酶與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽中的氨基發(fā)生交聯(lián)反應形成肽鍵，使得漆酶鏈上的活性基團羧基得以保護，漆酶天然構象產(chǎn)生一定的剛性，不易伸展失活，并減少了漆酶分子內(nèi)部基團的熱振動，使得漆酶活性、熱穩(wěn)定性得到提高。
[0020]與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0021](I)本發(fā)明的改性方法不但能使漆酶活性得到大幅度提高，而且漆酶穩(wěn)定性也有明顯提高，應用于再生植物纖維改性中可明顯減少漆酶使用量，這將帶來巨大的社會效益、經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。
[0022](2)本發(fā)明的漆酶改性方法操作步驟簡單，所需化學藥品加入量少，無有毒化學藥品攝入，所需反應條件溫和。
【具體實施方式】
[0023]為使本發(fā)明更加容易理解，以下結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0024]實施例1
[0025]改性步驟:將5mL、10mg/mL漆酶液(漆酶SUKALacc由曲霉菌產(chǎn)生)，與0.4mg/mL、5mL L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶液混合，向混合溶液中加入1.0mgl-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC),在25°C、磁力攪拌條件下反應4h,其中漆酶溶液和L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶液均用PH為5.8、濃度為0.06mol/L的磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀(ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04)緩沖溶液配制。反應完成后，將混合溶液轉入透析袋中，在PH為5.0、濃度0.2mol/L的磷酸氫二鉀/檸檬酸緩沖溶液中室溫下透析48h除掉多余的L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽和EDC，得到改性后漆酶溶液，定容到25mL，冷凍保存?zhèn)溆茫瑴y定原漆酶與改性漆酶的活性和熱穩(wěn)定。
[0026]漆酶活性和半衰期分析:漆酶活性由2，2’ -聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的氧化確定。漆酶活性定義:定義Imin催化I μ mo I ABTS的酶量為一個酶活單位(U)。具體操作步驟為:準確移取pH為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、0.5mmol/L ABTS各IOmL,混合，搖勻，30°C水浴。測試在紫外分光光度計中進行，取上述混合試劑ImL于比色皿中，420nm處調(diào)零。準確加入待測酶液0.5mL,立即記錄前3min吸光度的變化，取平均值，折算成每分鐘的吸光度變化(OD42tl變化)。
[0027]漆酶活性計算:每升酶液所含有的酶活量計算公式如下:
[0028]
【權利要求】
1.一種基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽水溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽水溶液，進行反應；(2)反應完成后，用醋酸/醋酸鈉緩沖溶液或磷酸氫二鉀/檸檬酸緩沖溶液透析，得到改性后的漆酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述原漆酶水溶液中溶質(zhì)原漆酶來源于可以產(chǎn)生漆酶的植物、真菌或細菌中任一種，包括如桃樹、靈芝、嗜熱菌、曲霉菌或毛栓菌。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽用量為相對于原漆酶固體量的質(zhì)量百分數(shù)0.001%-10%。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽用量為相對于原漆酶固體量的質(zhì)量百分數(shù)0.001%-2%。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽水溶液均用PH為2.0-6.5的磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀(KH2PO4/ K2HPO4)緩沖溶液配制。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述反應的溫度為2-25°C，所述反應的反應時間為0.5-12 h。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征`在于步驟(I)所述反應是在攪拌條件下進行。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述醋酸/醋酸鈉緩沖溶液或磷酸氫二鉀/檸檬酸緩沖溶液的PH為3.5-6.0。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述透析的時間為12-72h。
10.權利要求1所述的一種基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法所制得的改性后的漆酶應用于再生植物纖維改性。
【文檔編號】C12N9/02GK103436501SQ201310380060
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權日:2013年8月27日
【發(fā)明者】萬金泉, 陳楊梅, 張全升, 馬邕文, 王艷, 黃明智 申請人:華南理工大學