新型dna片段與含有該片段的重組載體、利用它們轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體以及它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及單獨含有特定基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段、或含有該基因調(diào)節(jié)區(qū)域與編碼信號肽的基因的DNA片段、含有該DNA片段的重組載體、含有該重組載體的轉(zhuǎn)化體以及使用該轉(zhuǎn)化體制備重組蛋白質(zhì)的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以與重組蛋白質(zhì)的種類無關(guān)地大量且有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
【專利說明】新型DNA片段與含有該片段的重組載體、利用它們轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體以及它們的應(yīng)用
[0001]本申請是國際申請日為2008年7月9日、國際申請?zhí)枮镻CT/JP2008/062392、進入國家階段的申請?zhí)枮?00880024512.4、發(fā)明名稱為“新型DNA片段與含有該片段的重組載體、利用它們轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體以及它們的應(yīng)用”的PCT申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的、具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的堿基序列與編碼信號肽的堿基序列的DNA片段和含有該片段的重組載體、利用它們轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體以及它們的應(yīng)用。需要說明的是，作為相關(guān)申請的相互參考，本申請要求2007年7月13日提出的日本專利申請2007-183934號的優(yōu)先權(quán)，其全部記載作為公開特別援引于此。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來遺傳工程學(xué)的進步，能利用各種生物體作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)。特別是熟知將含有外來基因的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的宿主-載體系統(tǒng)。如果使用宿主-載體系統(tǒng)，則可以在不將外來基因插入宿主細(xì)胞的染色體的情況下獲得重組蛋白質(zhì)。
[0004]作為宿主-載體系統(tǒng)中的宿主細(xì)胞而廣泛使用的是大腸桿菌(Escherichiacoli)(例如參見日本專利2988951號公報以及作為其同族專利的歐州0441361號公報與美國5304471號公報(以下，有時將它們稱為專利文獻I)，上述專利的全部記載作為公開特別援引于此)。大腸桿菌中,傳代時間短至約為20分鐘，可以將各種糖類同化并增殖。并且，正在開發(fā)適合大腸桿菌的大量質(zhì)粒載體，以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的宿主-載體系統(tǒng)實現(xiàn)重組蛋白質(zhì)的迅速且穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)。
[0005]但是，由于大腸桿菌的在菌體內(nèi)蓄積重組蛋白質(zhì)的性質(zhì)，存在下述對于大量且穩(wěn)定生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)不利的方面:抑制大腸桿菌本身的生育，并且在菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶(蛋白酶)的作用下，重組蛋白質(zhì)的功能容易喪失。并且，為了獲得重組蛋白質(zhì)而必須將菌體回收，破碎，并且非常小心翼翼地除去作為發(fā)熱性物質(zhì)之一的脂多糖。因此，也產(chǎn)生了導(dǎo)致用于收集.純化重組蛋白質(zhì)的工序變復(fù)雜的問題。
[0006]為此，為了解決上述問題，目前為止正研究利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的宿主-載體系統(tǒng)。枯草芽孢桿菌的傳代時間約為30分鐘，與大腸桿菌基本相同，能將蛋白質(zhì)分泌到菌體外，并且不含有脂多糖作為菌體構(gòu)成成分。因此，若與使用大腸桿菌的宿主-載體系統(tǒng)相比較，使用枯草芽孢桿菌的宿主-載體系統(tǒng)具有可以大量且穩(wěn)定地生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，并且可以容易地收集.純化重組蛋白質(zhì)的優(yōu)點。
[0007]例如，作為利用以上述枯草芽孢桿菌為宿主的宿主-載體系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的例子，報導(dǎo)了將來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)株的鏈絲菌素O基因?qū)氡磉_載體，利用所得的重組載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，由此可以由培養(yǎng)上清液得到鏈絲菌素O (參見日本特開平05-184372號公報(以下，有時也稱為專利文獻2)，其全部記載作為公開特別援引于此)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明所需解決的課題
[0009]但是，根據(jù)本發(fā)明人的研究，在使用枯草芽孢桿菌的宿主-載體系統(tǒng)中，根據(jù)重組蛋白質(zhì)的種類，有時重組載體上的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的堿基序列(以下稱為“基因調(diào)節(jié)區(qū)域”)基于某種原因而不能正常發(fā)揮功能。為此，明確了存在抑制重組蛋白質(zhì)表達的問題。另外，還明確了即使基因調(diào)節(jié)區(qū)域正常發(fā)揮功能，在編碼信號肽的堿基序列(以下稱為“信號肽基因”)不發(fā)揮功能，或者基因調(diào)節(jié)區(qū)域與信號肽基因的組合不適當(dāng)?shù)那闆r下，也存在重組蛋白質(zhì)以容易受到蛋白酶等的分解的狀態(tài)殘留在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜內(nèi)等問題。
[0010]為此，明白了解決上述問題的宿主-載體系統(tǒng)的確立對于以枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)是必須的，所述宿主-載體系統(tǒng)可以與重組蛋白質(zhì)種類無關(guān)地大量表達重組蛋白質(zhì)基因并有效分泌到細(xì)胞外。
[0011]因此，本發(fā)明的第一目的在于提供在以枯草芽孢桿菌為宿主的系統(tǒng)中，可以與重組蛋白質(zhì)的種類無關(guān)地大量且有效生產(chǎn)蛋白質(zhì)的新方法。更具體而言，在于提供可以與重組蛋白質(zhì)的種類無關(guān)地大量表達重組蛋白質(zhì)的含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段。此外，還在于提供可以有效地將重組蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域與信號肽基因的組合的DNA片段。并且，還在于提供使編碼重組蛋白質(zhì)的堿基序列(以下，稱為“重組蛋白質(zhì)基因”)連接于基因調(diào)節(jié)區(qū)域或基因調(diào)節(jié)區(qū)域與信號肽基因的下游而得到的DNA片段。
[0012]本發(fā)明的第二目的在于提供含有上述DNA片段的重組載體、利用它們轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體以及利用它們的重組蛋白質(zhì)的制備方法。
[0013]用于解決課題的手段
[0014]本申請發(fā)明人進行了潛心研究，結(jié)果克隆了保藏號為FERM AP-20227的芽孢桿菌TAMB750 (Bacillus sp.JAMB750)株所具有的基因調(diào)節(jié)區(qū)域。進而，為了提高信號肽的分泌性能，重新設(shè)計了信號肽。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)如果在含有它們的DNA片段的下游結(jié)合重組蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，將其插入于適當(dāng)?shù)妮d體后導(dǎo)入枯草芽孢桿菌，則可以與蛋白質(zhì)的種類無關(guān)地大量生產(chǎn)該重組蛋白質(zhì)并且有效地分泌到細(xì)胞外，從而完成本發(fā)明。
[0015]即，根據(jù)本發(fā)明，能提供含有下述(a)-(c)的任一堿基序列、能促進存在于其下游的基因的表達的DNA片段。
[0016](a)序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列；
[0017](b)如下得到的堿基序列:在序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列中，缺失、置換、倒位或添加I個或多個堿基；或
[0018](C)下述DNA的堿基序列，所述DNA能與由序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列和與其互補的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交。
[0019]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供含有下述(a)-(c)的任一堿基序列、能促進存在于其下游的基因的表達并且將該基因的基因產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的DNA片段。
[0020](a)下述堿基序列，其包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼信號肽的堿基序列；
[0021](b)如下得到的堿基序列:在包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼信號肽的堿基序列的堿基序列中，缺失、置換、倒位或添加I個或多個堿基；或
[0022](c)下述DNA的堿基序列，所述DNA能與由下述堿基序列和與其互補的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，所述堿基序列包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼信號肽的堿基序列。
[0023]進而，根據(jù)本發(fā)明，提供含有下述(a)-(c)的任一堿基序列、能促進存在于其下游的基因的表達并且將該基因的基因產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的DNA片段。
[0024](a)下述堿基序列，其包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼SEQ ID NO:3所記載的氨基酸序列；
[0025](b)如下得到的堿基序列:在包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼SEQ ID NO:3所記載的氨基酸序列的堿基序列的堿基序列中，缺失、置換、倒位或添加I個或多個堿基；或
[0026](c)下述DNA的堿基序列，所述DNA能與由下述堿基序列和與其互補的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，所述堿基包含序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼SEQ ID NO:3所記載的氨基酸序列的堿基序列。
[0027]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供含有上述含基因調(diào)節(jié)區(qū)域的本發(fā)明DNA片段的堿基序列與直接或間接地連接于其下游的編碼重組蛋白質(zhì)的堿基序列的DNA片段、以及含有上述含基因調(diào)節(jié)區(qū)域與肽基因的本發(fā)明DNA片段的堿基序列與直接連接于其下游的編碼重組蛋白質(zhì)的喊基序列的DNA 片段。
[0028]優(yōu)選上述重組蛋白質(zhì)是選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶與修飾酶的I種酶。
[0029]并且，根據(jù)本發(fā)明，能提供含有本發(fā)明DNA片段的重組載體。
[0030]優(yōu)選上述重組載體是質(zhì)粒、曬菌體或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。
[0031]進而根據(jù)本發(fā)明，能提供由下述宿主(a)或(b)構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體。
[0032](a)轉(zhuǎn)導(dǎo)了上述本發(fā)明的DNA片段的宿主；或
[0033](b)含有上述本發(fā)明的重組載體的宿主。
[0034]優(yōu)選上述宿主是微生物，較優(yōu)選為革蘭氏陽性細(xì)菌，更優(yōu)選為屬于芽孢桿菌屬的微生物。
[0035]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供包括下述工序(a)與(b)的重組蛋白質(zhì)的制備方法。
[0036](a)上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)工序；與
[0037](b)該重組蛋白質(zhì)的收集工序。
[0038]優(yōu)選重組蛋白質(zhì)是選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶與修飾酶的I種酶。
[0039]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供用于本發(fā)明重組蛋白質(zhì)的制備方法的上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。
[0040]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供用于制備重組蛋白質(zhì)的上述DNA片段的應(yīng)用。
[0041]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供用于制備重組蛋白質(zhì)的上述重組載體的應(yīng)用。
[0042]進而，根據(jù)本發(fā)明，能提供用于制備重組蛋白質(zhì)的上述轉(zhuǎn)化體的應(yīng)用。
【具體實施方式】[0043]以下，詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案。
[0044](A)本發(fā)明的DNA片段
[0045]本發(fā)明的DNA片段是下述片段:含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段，含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因的DNA片段，含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段，以及含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域、直接或間接地連接于其下游的信號肽基因與直接連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段。
[0046]本說明書所謂的“能促進存在于其下游的基因的表達”是指能提高位于基因調(diào)節(jié)區(qū)域的3’末端側(cè)的基因的轉(zhuǎn)錄效率、促進基因產(chǎn)物的表達的作用。
[0047]本發(fā)明的含有基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段是含有序列表的SEQ ID N0:1或2所記載的堿基序列的DNA片段。含有SEQ ID NO:1所記載的堿基序列的DNA片段可以用例如實施例2所示的方法由芽孢桿菌JAMB750株的染色體DNA獲得。另一方面，含有SEQ ID NO:2所記載的堿基序列的DNA片段可以用例如實施例5所示的方法在SEQ ID NO:1所記載的堿基序列中導(dǎo)入隨機變異來獲得。
[0048]作為獲得含有本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段的其他方法，例如可以基于序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列的信息，由化學(xué)合成、基因工程學(xué)的方法或突變誘發(fā)等公知的任意方法來制作。
[0049]例如，將含有本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段插入表達載體中來轉(zhuǎn)化作為宿主的枯草芽孢桿菌或?qū)⑺鯠NA片段直接插入枯草芽孢桿菌的染色體進行轉(zhuǎn)化，由此活化存在于其下游的蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，促進蛋白質(zhì)的表達。
[0050]本說明書中所謂的“具有I個至多個堿基的缺失、置換、倒位、添加和/或插入的堿基序列”中的“I個至多個”的范圍沒有特別限定，例如，是指I個至40個，優(yōu)選為I個至30個，較優(yōu)選為I個至20個，更優(yōu)選為I個至9個，特別優(yōu)選為I個至5個，最優(yōu)選為I個至3個左右。另外，所謂“堿基的缺失”是指序列中的堿基脫落或消失，“堿基的置換”是指序列中的堿基被置換為其他堿基，“堿基的倒位，，是指彼此相鄰的2個以上堿基的位置逆轉(zhuǎn)，“喊基的添加”是指喊基被添加，“喊基的插入”是指在序列中的喊基間插入其他喊基。
[0051]本說明書中所謂的“在嚴(yán)格條件下雜交”是指將DNA用作探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或DNA印跡雜交法等得到的DNA的堿基序列，例如，可以舉出可以通過如下方法鑒定的DNA等:使用來自菌落或噬菌斑的DNA或?qū)⒃揇NA的片段固定化的過濾器，在0.7-1.0M的NaCl存在下，在65 °C下進行雜交后，使用0.1-2 X SSC溶液(I X SSC溶液是150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)，在65°C條件下清洗過濾器。雜交可以基于MolecularCloning:Alaboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor，NY.，1989 或 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38，JohnWiley&Sons (1987-1997)等文獻記載的方法進行。需要說明的是，該文獻的全部記載作為公開特別援引于此。
[0052]作為在嚴(yán)格條件下進行雜交的DNA，可以舉出與用作探針的DNA的堿基序列具有一定以上同源性的DNA，例如可以舉出具有70%以上、優(yōu)選80%以上、較優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選93%以上、特別優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同源性的DNA。
[0053]本說明書中所謂的“信號肽”是指添加在存在于編碼信號肽的堿基序列下游的基因之基因產(chǎn)物的氨基末端，能將基因產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外的肽。另外，所謂“能將基因產(chǎn)物分泌至細(xì)胞外”是指，如上所述，信號肽添加在作為基因產(chǎn)物的重組蛋白質(zhì)的氨基末端側(cè)，弓丨導(dǎo)重組蛋白質(zhì)在小胞體膜上的附著和膜通過等，最終將重組蛋白質(zhì)分泌至細(xì)胞外的作用。
[0054]本說明書所謂的“序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與直接或間接連接于其下游”是指序列表的SEQ ID NO:1或2所記載的堿基序列與經(jīng)由0-1000左右的堿基連接于該堿基序列的3’末端側(cè)。
[0055]包含本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因的DNA片段是含有上述基因調(diào)節(jié)區(qū)域與經(jīng)由0-1000左右的堿基連接的信號肽基因的DNA片段，優(yōu)選含有上述基因調(diào)節(jié)區(qū)域與經(jīng)由0-100左右的堿基連接的序列表的SEQ ID NO:3所記載的信號肽的編碼基因的DNA片段。
[0056]包含本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因的DNA片段例如可以由實施例3或5所示的方法獲得。另外，限于含有信號肽基因的DNA片段，例如可以基于公知的信號肽基因或序列表的SEQ ID NO:3所記載的氨基酸序列的信息，利用化學(xué)合成、基因工程學(xué)的方法或突變誘發(fā)等公知的任意方法來制作。作為化學(xué)合成法，例如能應(yīng)用亞磷酰胺法自動合成。需要說明的是，序列表的SEQ ID NO:3所記載的信號肽是根據(jù)芽孢桿菌屬細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)組的氨基末端側(cè)的氨基酸序列信息進行統(tǒng)計處理、設(shè)計而得到的數(shù)十條候補的氨基酸序列，對所述氨基酸序列評價重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)性并選擇而得到的。本序列即使添加、缺失或置換I個或多個、優(yōu)選I個或2個氨基酸殘基也可以利用。
[0057]例如，將包含本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因的DNA片段插入表達載體來轉(zhuǎn)化作為宿主的枯草芽孢桿菌或?qū)⑺鯠NA片段直接插入枯草芽孢桿菌的染色體進行轉(zhuǎn)化，由此能活化存在于其下游的蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，促進蛋白質(zhì)表達，進而將表達的蛋白質(zhì)分泌到菌體外。
[0058]含有本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或連接地連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段是包含上述基因調(diào)節(jié)區(qū)域與經(jīng)由0-1000左右的堿基連接于其3’末端側(cè)的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段。`
[0059]另一方面，含有本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域、直接或間接地連接于其下游的信號肽基因以及直接連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段是包含上述基因調(diào)節(jié)區(qū)域、經(jīng)由0-1000左右的堿基連接于其3’末端側(cè)的信號肽基因以及連接于其3’末端側(cè)的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段，優(yōu)選上述信號肽基因是序列表的SEQ ID NO:3所記載的信號肽基因。
[0060]作為本發(fā)明的DNA片段的具體例，如實施例4所示，是含有序列表的SEQ ID NO:1所記載的堿基序列、經(jīng)由10個堿基連接于其下游的SEQ ID NO:3所記載的編碼信號肽的基因以及直接連接于其下游的β瓊脂糖酶基因的DNA片段。
[0061]作為本發(fā)明的DNA片段所含的重組蛋白質(zhì)基因的基因產(chǎn)物的重組蛋白質(zhì)沒有特別限定，例如包括洗劑、食品、纖維、飼料、化學(xué)品、醫(yī)療、診斷等各種產(chǎn)業(yè)用酶或生理活性肽等。另外，根據(jù)產(chǎn)業(yè)用酶的功能不同，包括氧化還原酶(Oxidoreductase)、轉(zhuǎn)移酶(Transferase)、水解酶(Hydrolase)、憐酸化酶(Phosphorylase)、裂合酶(Lyase)、異構(gòu)酶(Isomerase)、合成酶(Ligase/Synthetase)、修飾酶(Modifying enzyme)等。更具體而言，纖維素酶與瓊脂分解酶等糖分解酶、環(huán)糊精合成酶等糖轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖磷酸化酶或海藻糖磷酸化酶等二糖類磷酸化酶、以及硫酸基轉(zhuǎn)移酶等糖修飾酶等。實施例給出利用本發(fā)明的DNA片段，能大量分泌生產(chǎn)作為糖質(zhì)分解酶之一的α -或β -瓊脂糖酶與纖維素酶的實例。[0062]作為獲得本發(fā)明的包含基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段、或包含基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因以及直接連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段的方法，例如有如實施例3與5所示，采用作為大腸桿菌-枯草芽孢桿菌的穿梭載體的PHY300PLK質(zhì)粒，在作為多克隆部位的E^RI部位插入包含基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接地連接于其下游的信號肽基因的DNA片段，相同地在作為多克隆部位的MmHI部位插入重組蛋白質(zhì)基因作為質(zhì)粒DNA而獲得的方法。
[0063]具體而言,例如首先以具有目標(biāo)重組蛋白質(zhì)基因的生物染色體DNA為模板,使用PCR擴增，將含有編碼如下氨基酸序列的堿基序列的該重組蛋白質(zhì)基因擴增，所述氨基酸序列包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的分泌性、穩(wěn)定性或活性所必需部位。將所得的重組蛋白質(zhì)基因的PCR擴增物與PHY300PLK用限制酶MmHI消化，將由此得到的DNA片段進行連接。通過所得的連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選擇含有在PHY300PLK的_HI部位插入有該重組蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，由該轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。將所得的質(zhì)粒DNA用限制酶EmRI處理來切斷。以芽孢桿菌JAMB750株的染色體DNA為模板，將含有啟動子部位或SD序列等的基因調(diào)節(jié)區(qū)域進行PCR擴增，與上述被EmRI切斷的開環(huán)質(zhì)粒DNA連接，通過所得的連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌。選擇經(jīng)正常地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，可以得到本發(fā)明的DNA片段。
[0064]例如，將包含本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段插入表達載體以轉(zhuǎn)化作為宿主的枯草芽孢桿菌或?qū)⑺鯠NA片段直接插入枯草芽孢桿菌的染色體進行轉(zhuǎn)化，由此能促進重組蛋白質(zhì)基因的表達。
[0065]例如，將包含本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)區(qū)域與直接或間接連接于其下游的信號肽基因以及直接連接于其下游的重組蛋白質(zhì)基因的DNA片段插入表達載體以轉(zhuǎn)化作為宿主的枯草芽孢桿菌或?qū)⑺鯠NA片段直接插入枯草芽孢桿菌的染色體進行轉(zhuǎn)化，由此能促進重組蛋白質(zhì)的表達，并且將表達的重組蛋白質(zhì)分泌到菌體外。
[0066](B)本發(fā)明的重組載體
[0067]本發(fā)明的DNA片段可以插入到適當(dāng)?shù)妮d體中進行使用。本發(fā)明中使用的載體的種類沒有特別限定，例如，可以是能在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的載體(例如質(zhì)粒等)，或者也可以是在導(dǎo)入于宿主細(xì)胞時 插入宿主細(xì)胞的染色體組，與經(jīng)插入的染色體一起復(fù)制的載體。優(yōu)選本發(fā)明所用的載體是質(zhì)粒、噬菌體或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。插入上述載體的本發(fā)明DNA片段能在功能上和結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定地保持在載體內(nèi)。
[0068]作為能在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的載體的具體例，可以舉出pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112 或 pAUR123 等 YCp 型大腸桿菌-酵母穿梭載體；pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135等?ρ型大腸桿菌-酵母穿梭載體；來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如 pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、PHSG396 或 pTrc99A 等 ColE 系質(zhì)粒；pACYC177 或 pACYC184 等 plA 系質(zhì)粒；pMW118、pMW119、P麗218或P麗219等pSClOl系質(zhì)粒等)；來自枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110、pTP5等)；PHY300PLK等大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。另外，作為噬菌載體，有λ噬菌(例如Charon 4A、Charon21A、EMBL4、λ gtlOO、gtll、zap)、￥X174、M13mpl8、M13mpl9 等。作為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，可以舉出Ty因子等。另外，以融合蛋白質(zhì)的形式表達的表達載體，例如可以使用 pGEX 系列(Pharmacia ( 7 T v T fjjiJ)) ^ pMAL 系列(Biolabs 公司制)。
[0069]本發(fā)明的重組載體除含有本發(fā)明的DNA片段之外，還可以功能性地含有選擇標(biāo)記基因、終止子與增強子等。作為選擇標(biāo)記基因，例如可以舉出諸如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因或粟酒裂殖酵母TPI基因等的補體是宿主細(xì)胞所欠缺的基因、或是耐受例如氨芐西林、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、放線菌酮、梧寧霉素、新霉素或潮霉素之類藥劑的耐藥劑性基因。分別功能地連接本發(fā)明的DNA片段、選擇標(biāo)記基因、終止子與增強子，將它們插入適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如文獻Molecular Cloning(1989) (ColdSpring Harbor Lab.)記載的方法。需要說明的是，該文獻的全部記載作為公開特別援引于此。各個重組載體的插入位置只要是與重組載體復(fù)制無關(guān)的區(qū)域即可，可以為任意位置，通常利用載體內(nèi)的多克隆位點。
[0070](C)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體
[0071]通過將本發(fā)明的DNA片段或重組載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗?，可以制作轉(zhuǎn)化體。即，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是導(dǎo)入本發(fā)明的DNA片段而形成的轉(zhuǎn)化體或含有本發(fā)明的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
[0072]本說明書中所謂的“轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA片段得到的宿主”中的“轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA片段”是指利用噬菌體等將本發(fā)明的DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞或?qū)⒈景l(fā)明的DNA片段插入宿主細(xì)胞的染色體DNA。
[0073]導(dǎo)入本發(fā)明的DNA片段或重組載體的宿主細(xì)胞是微生物，優(yōu)選為革蘭氏陽性菌，更優(yōu)選為枯草芽孢桿菌，最優(yōu)選為枯草芽孢桿菌的ISW1214株、BD170株或168株等。但是，只要可以穩(wěn)定地保持、復(fù)制本發(fā)明的DNA片段或重組載體，就可以使用枯草芽孢桿菌以外的芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌等。
[0074]本說明書所謂的“芽孢桿菌屬”包括公知的芽孢桿菌屬所包括的所有種類，沒有特別限定，例如是指枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜喊菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、臘狀芽 抱桿菌(Bacillus cereus)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、耐鹽芽抱桿菌(Bacillus halodurans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、凝結(jié)芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)與蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)等。需要說明的是，將芽孢桿菌屬在分類上繼續(xù)再編組，該屬還包括經(jīng)再分類的種。例如有地芽孢桿菌(Geobacillus)屬、耐喊芽抱桿菌(Alkalibacillus)屬、雙芽抱桿菌(Amphibacillus)屬、了 ^ 口 K 予卟 7 (Amylobacillus)屬、厭氧芽抱桿菌(Anoxybacillus)屬、3'' V/s' )V % (Goribacillus)屬、七 7 八予卟 7 (Cerasibacillus)屬、夕'' 7 '> V 八-f- ^ (Gracilibacillus)屬、，、口八予卟 7 (Halolactibacillus)屬、，、口了
力 U K )V % (Halalkalibacillus)屬、7 彳口八予卟 7 (Filobacillus)屬、夕 3一力' V 八% (.TeotgalibaciIIus)屬、寸丨J 千)V Z (Salibacillus)屬、才一'> 弋 7 K )V % (Oceanobacillus)屬、？ V 二八予卟 7 (Marinibacillus)屬、V^ 二)V % (Lysinibacillus)屬、> 'y)V % (Lentibacillus)屬、々 > 一
K 千% (Ureibacillus)屬、寸1J 二千)V z (Salinibacillus)屬、*。；s' 千^ (Pontibacillus)屬、匕?！?V % (Piscibacillus)屬、7 V 才八-f- ^(ParaliobacilIus)屬、"了一 夕千)1 天(Virgibacillus)屬、寸卟 '> 工一二 /s' 予卟^ (SalSURinibaciIIus)屬、亍二二一 -1 ”'十 A X (Tenuibacillus)屬、夕 7 乂八予卟 7(Thalassobacillus)屬、寸一厶7 卟力 'J 八予卟叉(Thermalkal ibaci I Ius)屬、十工一 ^；s' ^ ^ ^ (Tumebacillus)屬等,上述菌屬還包含于本說明書所謂的芽孢桿菌屬中。
[0075]將本發(fā)明的DNA片段或重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法沒有特別限定，但例如可以使用感受態(tài)細(xì)胞法、原生質(zhì)體法、電穿孔法、鈣離子法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法法、原生質(zhì)球法、乙酸鋰法、轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)染法、同源或異源重組法(相同i tz ii異種組換λ法)等。宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌時，優(yōu)選感受態(tài)細(xì)胞法或原生質(zhì)體法。
[0076]獲得通過本發(fā)明的DNA片段或重組載體來轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體的方法可以使用例如以結(jié)合于本發(fā)明DNA片段下游的選擇標(biāo)記基因等適當(dāng)基因的表達為指標(biāo)的方法、用使用DNA探針進行雜交的方法、以及利用重組蛋白質(zhì)的基質(zhì)特異性的方法等。作為利用重組蛋白質(zhì)的基質(zhì)特異性的方法的具體例，如實施例4所示，在本發(fā)明的DNA片段下游整合β瓊脂糖酶基因，在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)束了轉(zhuǎn)化操作的宿主細(xì)胞，由此利用瓊脂糖酶活性選擇瓊脂溶解了的菌落，從而可以獲得通過本發(fā)明的DNA片段或重組載體來轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
[0077](D)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的制備方法
[0078]本發(fā)明包括根據(jù)公知的方法將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中接種培養(yǎng)，由培養(yǎng)物收集重組蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)的制備方法。
[0079]作為用于培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)培養(yǎng)基，只要適度含有碳源、氮源、無機物與根據(jù)需要使用的菌株所必須的微量營養(yǎng)素，就可以為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任一種。
[0080]作為用于培養(yǎng)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)培養(yǎng)基的碳源，只要是該轉(zhuǎn)化體能同化的物質(zhì)即可，例如可以使用葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、海藻糖、鹿糖、甘露醇、山梨糖醇、淀粉、葡聚糖、糖蜜等糖質(zhì)或檸檬酸、琥珀酸等有機酸或甘油等脂肪酸。
[0081]作為用于培養(yǎng)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)培養(yǎng)基的氮源，可含有各種有機與無機的氮化合物，而且培養(yǎng)基可含有各種無機鹽。例如能使用玉米漿、大豆渣或各種肽類等有機氮源、以及氯化銨、硫酸銨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、磷酸銨等無機氮源等化合物。另外，谷氨酸等氨基酸與尿素等有機氮源當(dāng)然也可以作為碳源。進而，蛋白胨、多蛋白胨、細(xì)菌蛋白胨、肉提取物、魚肉提取物、酵母提取物、玉米漿、大豆粉、大豆渣、干燥酵母、酪蛋白氨基酸、水溶性植物蛋白等含氮天然物也可以用作氮源。
[0082]作為用于培養(yǎng)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)培養(yǎng)基的無機物，例如可以適當(dāng)使用鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鑰鹽、鈷鹽等。具體而言，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。進而，根據(jù)需要，也可以適當(dāng)使用氨基酸以及生物素與硫胺素等微量營養(yǎng)素維生素等。
[0083]例如，利用重組枯草芽孢桿菌168株制備重組蛋白質(zhì)時，可以使用下述培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以葡萄糖或果糖等單糖類、蔗糖或麥芽糖等二糖類或淀粉等多糖類等為碳源，以肽、大豆粉、酵母提取物、魚肉提取物或玉米漿等為氮源，進一步摻混金屬鹽等。
[0084]作為培養(yǎng)法,液體培養(yǎng)法較好,也可以使用分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)或灌流培養(yǎng)的任一種，工業(yè)上優(yōu)選通氣攪拌培養(yǎng)法。培養(yǎng)溫度與PH可以選擇最適合使用的轉(zhuǎn)化體增殖的條件。培養(yǎng)時間是微生物開始增殖的時間以上的時間即可，優(yōu)選為8-120小時，更優(yōu)選至生成重組蛋白質(zhì)基因的基因產(chǎn)物最多的時間為止。例如轉(zhuǎn)化體是枯草芽孢桿菌時的培養(yǎng)通常在從溫度為15-42°C、優(yōu)選28-37°C，pH為5_9、優(yōu)選6_8，培養(yǎng)天數(shù)為2_7日之中選擇的條件下，進行振蕩或通氣攪拌來進行。 確認(rèn)枯草芽孢桿菌增殖的方法沒有特別限定，但例如可以收集培養(yǎng)物用顯微鏡進行觀察，也可以用吸光度進行觀察。另外，培養(yǎng)液的溶解氧濃度沒有特別限定，但通常優(yōu)選0.5-20ppm。因此，調(diào)節(jié)通氣量或攪拌，在通氣中追加氧即可。
[0085]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)中，在使重組載體含有選擇標(biāo)記的情況等下，將與選擇標(biāo)記對應(yīng)的抗生素一起加入營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如含有四環(huán)素耐性基因與氯霉素耐性基因作為選擇標(biāo)記時，分別加入配制成適當(dāng)濃度的四環(huán)素溶液與氯霉素溶液。另外，如果需要，在培養(yǎng)開始時或從培養(yǎng)開始至確認(rèn)了轉(zhuǎn)化體增殖后，添加誘導(dǎo)具有本發(fā)明多聚核苷酸的基因的表達的表達誘導(dǎo)劑。例如作為表達誘導(dǎo)劑，使用異丙基_β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。
[0086]由如上所述得到的培養(yǎng)物收集重組蛋白質(zhì)。該重組蛋白質(zhì)通常蓄積于轉(zhuǎn)化體外。為此，從培養(yǎng)上清液收集蓄積于轉(zhuǎn)化體外的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)制備方法中的重組蛋白質(zhì)收集工序可以根據(jù)通常的蛋白質(zhì)收集方法來進行。例如通過公知的方法除去轉(zhuǎn)化體后，可以將培養(yǎng)上清液作為重組蛋白質(zhì)含有物使用。
[0087]但是，根據(jù)宿主的種類，有在轉(zhuǎn)化體內(nèi)或轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜內(nèi)蓄積重組蛋白質(zhì)的情況。此時，沒有特別限定，但例如將由通過用有機溶劑或溶菌酶之類的酶溶解轉(zhuǎn)化體的方法與超聲波破碎法、弗式壓碎{y 3 )午方V % french press)法、玻璃珠破碎法、砂磨機(夕'^ ^ ^)破碎法等細(xì)胞破碎法得到的轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎物和/或培養(yǎng)物進行離心分離法、過濾法等操作，由此將轉(zhuǎn)化體與培養(yǎng)上清液分離?？梢詫⑷缟纤龅玫降呐囵B(yǎng)上清液作為重組蛋白質(zhì)含有物使用。另外，也可以將分離后的轉(zhuǎn)化體直接作為重組蛋白質(zhì)含有物。
[0088]上述重組蛋白質(zhì)含有物也可以直接使用，但根據(jù)需要可以通過例如單獨或組合使用鹽析法、沉淀法、透析法、超濾法等公知的方法來制備工業(yè)用途的濃縮重組蛋白質(zhì)含有物。
[0089]進而，可以將上述 濃縮重組蛋白質(zhì)含有物供于例如離子交換色譜、等電點色譜、疏水性色譜、凝膠過濾色譜、吸附色譜、親和色譜、反相色譜、樹脂柱法等公知的分離.純化的組合來得到純化重組蛋白質(zhì)。
[0090]實施例
[0091][實施例1]基因調(diào)節(jié)區(qū)域探索用質(zhì)粒的構(gòu)建
[0092]用以下的方法構(gòu)建基因調(diào)節(jié)區(qū)域DNA片段檢索用載體pPTCF。
[0093]以來自產(chǎn)微球莖菌屬JAMB-A7 (Microbulbifer sp.JAMB-A7)株(保藏號；FERMBP-8320)的染色體DNA為模板，使用序列表的SEQ ID NO:4所記載的啟動子A與SEQ IDNO:5記載的啟動子B進行PCR，得到DNA片段A。將所得的DNA片段A用限制酶EmRI處理，與預(yù)先用EmRI處理的作為枯草芽孢桿菌-大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒的pHY300PLK(養(yǎng)樂多公司制)連接，由此構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒B。使用環(huán)狀質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株，得到轉(zhuǎn)化體C。由轉(zhuǎn)化體C制備環(huán)狀質(zhì)粒B，其中，將在瓊脂分解酶基因上游具有來自PHY300PLK的多聚接頭部位的質(zhì)粒命名為pPTCF。
[0094][實施例2]基因調(diào)節(jié)區(qū)域的獲得(I)
[0095]利用限制酶Sau3AI處理芽孢桿菌JAMB750 (Bacillus sp.JAMB750)株(保藏號:FERM AP-20227)的染色體DNA后，將其與用限制酶MlHI切斷的在實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pPTCF混合，通過T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)，得到連接反應(yīng)液D。利用所得的連接反應(yīng)液D轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，得到轉(zhuǎn)化體E組。作為用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體E組的再生培養(yǎng)基，使用8%琥珀酸鈉、1 %瓊脂、0.5%酪蛋白氨基酸、0.5%酵母提取物、0.15%磷酸二氫鉀、0.35%磷酸氫二鉀、0.5%葡萄糖、0.4%硫酸鎂、0.01%牛血清白蛋白、0.001%甲硫氨酸、0.001%亮氨酸與7.5 μ g/ml四環(huán)素構(gòu)成的DM3培養(yǎng)基。在DM3培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體E組，選擇周圍形成瓊脂凹陷的約2000個克隆，分別進行液體培養(yǎng)。該液體培養(yǎng)中，使用以3%多聚蛋白胨S、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1 %磷酸二氫鉀、4%麥芽糖、0.02%硫酸鎂、0.05%氯化鈣與7.5μ g/ml四環(huán)素為組成成分的液體培養(yǎng)基，在30°C、48小時的振蕩條件下進行培養(yǎng)。將各培養(yǎng)液用超聲波破碎(使用Handy sonic model UR-20P、TOMY SEIKOC0.制)，測定所得的超聲波破碎物的瓊脂分解酶活性。選擇其中活性最高的轉(zhuǎn)化體，將該轉(zhuǎn)化體具有的質(zhì)粒命名為PCDAG1。需要說明的是，瓊脂分解酶活性用下述方法測定。
[0096]瓊脂分解酶活性的測定如下進行，在95°C下加熱溶解，以冷卻到50°C的0.2%精制瓊脂(于力9 4 f ^々公司制)為基質(zhì)，在50mM MOPS緩沖液(pH 7.0)中于50°C下進行。通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定通過酶反應(yīng)生成的還原糖。
[0097][實施例3]基因調(diào)節(jié)區(qū)域的獲得(2)
[0098]以來自寸7乂 ? 于 7.工 7 匕。一 ΤΑΜΒ-Α33 (Thalassomonas sp.JAMB—A33)株(保藏號；DSM17297)的染色體DNA為模板，使用序列表的SEQ ID NO:6記載的啟動子C與SEQ ID NO:7記載的啟動子D進行PCR擴增，獲得包含約300bp的PCR擴增DNA片段F。將該PCR擴增DNA片段F用限制酶HindIII處理，與預(yù)先用HindIII切斷的PHY300PLK通過連接酶反應(yīng)連接，得到環(huán)狀質(zhì)粒G。利用環(huán)狀質(zhì)粒G轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株。由轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，命名為pHYTER。
[0099]用以下的方法構(gòu)建表達載體pJEXOPTl。
[0100]以實施例2得到的質(zhì)粒pCDAGl為模板，使用序列表的SEQ ID NO:8記載的啟動子E與SEQ ID NO:9記載的磷酸化啟動子F，利用PCR進行包含約300bp的基因調(diào)節(jié)區(qū)域的擴增，得到PCR擴增物H。
[0101]另一方面，使包含SEQ ID NO: 18記載的堿基序列的合成單鏈DNA與包含SEQ IDNO: 19記載的堿基序列的合成單鏈DNA退火，得到雙鏈DNA片段I，在其末端實施磷酸化處理。將所得的PCR擴增物H與雙鏈DNA片段I通過連接酶反應(yīng)結(jié)合，以其為模板，使用SEQID NO:10記載的啟動子G與SEQ ID NO:11所記載的啟動子H進行PCR擴增。將所得的PCR擴增片段用作為限制酶的EcoRI與BamHI處理后，與用EcoRI與BamHI處理過的pHYTER連接，由此構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒。使用本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株。由轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，命名為pJEXOPTlο
[0102][實施例4]用表達載體分泌生產(chǎn)β瓊脂糖酶
[0103]以作為β瓊脂糖酶生產(chǎn)菌的產(chǎn)微球莖菌屬JAMB-A49 (Microbulbifersp.JAMB-A94)株(保藏號；FERM BP-8321)的染色體為模板，使用序列表的SEQ ID NO:12所記載的啟動子I與SEQ ID NO:13所記載的啟動子J，將β瓊脂糖酶基因DNA片段進行PCR擴增。將其用限制酶_ΗΙ處理。將表達載體pJEXOPTl用限制酶_HI切斷，用連接酶與β瓊脂糖酶基因連接。用含有該β瓊脂糖酶基因的PJEXOPTl轉(zhuǎn)化大腸桿菌ΗΒ101株。由顯示β瓊脂糖酶活性的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，命名為pJEXOPTlb。使用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌ISW1214 (Bacillus subtilis ISW1214)株，用加有四環(huán)素的再生培養(yǎng)基進行篩選。將所得的轉(zhuǎn)化體在以5%多肽S、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%磷酸氫鉀、5%麥芽糖、0.02%氯化鎂、0.05%氯化鈣與15 μ g/ml四環(huán)素為組成成分的PPS培養(yǎng)基中，在30°C下以130rpm攪拌培養(yǎng)72小時，測定除去菌體得到的培養(yǎng)上清液所含的β瓊脂糖酶活性。其結(jié)果是，可以確認(rèn)大量生產(chǎn)，即，每IL培養(yǎng)液中約0.15gi3瓊脂糖酶。
[0104][實施例5]基因調(diào)節(jié)區(qū)域的改變
[0105]另一方面，以質(zhì)粒pCDAGl為模板，使用序列表的SEQ ID NO:8記載的磷酸化啟動子E與SEQ ID NO:9記載的磷酸化啟動子F，通過PCR進行擴增。將所得的PCR片段導(dǎo)入PUC18的部位。以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，使用啟動子E與啟動子F，使用Diversify PCRRandom Mutagenesis Kit (Clontech ( ” u y m、公司)，根據(jù)試劑盒的操作手冊，在PCR擴增片段中隨機地導(dǎo)入變異。重復(fù)5次該隨機變異操作。以所得的PCR產(chǎn)物以模板，使用啟動子E與磷酸化啟動子F進行PCR擴增。然后，使用T4DNA聚合酶使PCR產(chǎn)物的末端平滑。
[0106]另一方面，使包含SEQ ID NO: 18記載的堿基序列的合成單鏈DNA與包含SEQ IDNO: 19所記載的堿基序列的合成單鏈DNA退火，得到雙鏈DNA片段，在其末端實施磷酸化處理。
[0107]將得到的PCR產(chǎn)物與雙鏈DNA片段通過連接酶反應(yīng)結(jié)合。將所得的DNA片段用限制酶處理后，與用EmRi與_hi處理的phyter連接，構(gòu)建環(huán)狀質(zhì)粒組。使用本質(zhì)粒組轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株。收集所得的多于數(shù)千的轉(zhuǎn)化體，制備質(zhì)粒組。將其作為質(zhì)粒組A。然后，以作為β掠脂糖酶牛產(chǎn)菌的產(chǎn)微球苯菌屬ΤΑΜΒ-Α94 (Microbulbifersp.JAMB-A94)株的染色體為模板，使用SEQ ID NO:12所記載的啟動子I與SEQ ID NO:13所記載的啟動子β瓊脂糖酶基因DNA片段進行PCR擴增。將其用限制酶SMlHI處理。用限制酶MmHI切斷質(zhì)粒組Α，用連接酶與β瓊脂糖酶基因連接。使用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株。由顯示β瓊脂糖酶活性的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，使用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌ISW1214株，用加有四環(huán)素的再生`培養(yǎng)基進行篩選。將所得的轉(zhuǎn)化體在PPS培養(yǎng)基(5%多聚蛋白胨S、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%磷酸氫鉀、5%麥芽糖、0.02%氯化鎂、0.05%氯化鈣、15 μ g/ml四環(huán)素)中在30°C下以130rpm攪拌培養(yǎng)72小時，測定所得的培養(yǎng)上清液所含的β瓊脂糖酶活性。其結(jié)果是，可以得到可以大量生產(chǎn)(即，每IL培養(yǎng)液中約0.2gi3瓊脂糖酶)的質(zhì)粒pJEX0PT2。
[0108][實施例6]用表達載體分泌生產(chǎn)纖維素酶
[0109]以作為纖維素酶生產(chǎn)菌的A'> 7 %.7 ^ ^ 1139 (Bacillus akibaill39)株(保藏號；JCM 9157T)(參見 J.Gen.Microbiol.1986，132，2329-2335.Fukumori 等、Int JSyst Evol Microbiol.(2005)55 =2309-15.Nogi, Y.等文獻，上述全部記載作為公開特別援引于此)的染色體為模板，使用序列表的SEQ ID NO:14記載的啟動子M與SEQ ID N0:15記載的啟動子N將纖維素酶基因DNA片段進行PCR擴增。將其用限制酶MmHI處理。用限制酶MI切斷pJEX0PTl、pJEX0PT2，利用連接酶與纖維素酶基因連接。使用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101株。由顯示纖維素酶活性的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，分別命名為pJEX0PTlC、pJEX0PT2C。使用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌ISW1214株，用加有四環(huán)素的再生培養(yǎng)基進行篩選。將所得的轉(zhuǎn)化體在PPS培養(yǎng)基(3%多聚蛋白胨S、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%磷酸氫鉀、4%麥芽糖、0.02%氯化鎂、0.05%氯化鈣、15μ g/ml四環(huán)素)中在30°C下以130rpm攪拌培養(yǎng)72小時，測定所得的培養(yǎng)上清液所含的纖維素酶活性。其結(jié)果是，可以確認(rèn)每IL培養(yǎng)液中，PJEX0PT1C大量生產(chǎn)約Ig纖維素酶，PJEX0PT2C大量生產(chǎn)約1.5g纖維素酶。
[0110][實施例7]用表達載體分泌生產(chǎn)Ct瓊脂糖酶
[0111]以作為α瓊脂糖酶生產(chǎn)菌的寸9 , ?于^ *工^匕。一ΤΑΜΒ-Α33 (Thalassomonas sp.JAMB-A33)株(保藏號；DSM 17297)的染色體為模板，使用序列表的SEQ ID NO: 16記載的啟動子O與SEQ ID NO:17記載的啟動子P，將α瓊脂糖酶基因DNA片段進行PCR擴增。將其用限制酶_ΗΙ處理。將pJEXOPTl、pJEX0PT2用限制酶_HI切斷，用連接酶與α瓊脂糖酶結(jié)構(gòu)基因連接。使用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl株。由顯示瓊脂糖酶活性的轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，分別命名為pJEXOPTla、pJEX0PT2a。使用上述質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌ISW1214株，用加有四環(huán)素的再生培養(yǎng)基進行篩選。將所得的轉(zhuǎn)化體在PPS培養(yǎng)基(5%多聚蛋白胨S、0.5%魚肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%磷酸氫鉀、5%麥芽糖、0.02%氯化鎂、0.05%氯化鈣、15 μ g/ml四環(huán)素)中在30°C下以130rpm攪拌培養(yǎng)72小時，測定所得的培養(yǎng)上清液所含的α瓊脂糖酶活性。其結(jié)果是，確認(rèn)每IL培養(yǎng)液中，pJEXOPTla大量生產(chǎn)0.2g α瓊脂糖酶，pJEX0PT2a大量生產(chǎn)0.3g α瓊脂糖酶。
【權(quán)利要求】
1.DNA片段，其由下述(a)的堿基序列組成，能促進存在于其下游的基因的表達: (a)序列表的SEQ ID NO:2的喊基序列。
2.DNA片段，其由下述(a)的堿基序列組成，促進存在于其下游的基因的表達，并且能將該基因的基因產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外: (a)由序列表的SEQ ID NO:2的堿基序列與連接于其下游的編碼SEQ ID NO:3的氨基酸序列的堿基序列組成的堿基序列。
3.DNA片段，其由權(quán)利要求1所述的DNA片段的堿基序列與連接于其下游的編碼重組蛋白質(zhì)的喊基序列組成。
4.DNA片段，其由權(quán)利要求2的DNA片段的堿基序列與直接連接于其下游的編碼重組蛋白質(zhì)的喊基序列組成。
5.權(quán)利要求3或4的DNA片段，其中，重組蛋白質(zhì)是選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、異構(gòu)酶和合成酶的I種酶。
6.重組載體，其含有權(quán)利要求1-5中任一項的DNA片段。
7.權(quán)利要求6的重組載體，其中，重組載體是質(zhì)粒、噬菌體或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。
8.轉(zhuǎn)化體，其由下述宿主(a)或(b)構(gòu)成: (a)轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求1-5的DNA片段的芽孢桿菌屬(MacilIus)的宿主；或 (b)含有權(quán)利要求6或7的重組載體的芽孢桿菌屬(MacilIus)的宿主。
9.重組蛋白質(zhì)的制備方法，其包括下述工序(a)與(b): (a)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)工序；與 (b)該重組蛋白質(zhì)的收集工序。
10.權(quán)利要求9的方法，其中，重組蛋白質(zhì)是選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、磷酸化酶、裂合酶、異構(gòu)酶和合成酶的I種酶。
11.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化體在制備權(quán)利要求9或10的重組蛋白質(zhì)的制備方法所得的重組蛋白質(zhì)中的用途。
【文檔編號】C12N9/42GK103710343SQ201310341582
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2008年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2007年7月13日
【發(fā)明者】秦田勇二, 大田優(yōu)佳莉, 日高祐子, 中村信之 申請人:獨立行政法人海洋研究開發(fā)機構(gòu)