人心腦血管病理演變前期KLF4基因mRNA水平原位雜交檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與早期心腦血管內(nèi)皮損傷病理演變有密切相關(guān)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳因子(KLF4)基因的mRNA的方法，包括以下步驟：(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可在RNA水平上檢測(cè)基因表達(dá)量，比現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)(蛋白檢測(cè)指標(biāo))更早期，能實(shí)現(xiàn)真正的心腦血管病變前期RNA水平篩查，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，成本低，便于縣區(qū)級(jí)醫(yī)院推廣應(yīng)用。
【專利說明】人心腦血管病理演變前期KLF4基因 mRNA水平原位雜交檢 測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與人心腦血管病理演變中mRNA表 達(dá)改變（病理演變過程）的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)國內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的資料，我國每年心血管病的新增人數(shù)300多萬，死亡 人數(shù)近250萬，患者900多萬，全球每年新增心血管病患者1200多萬，死亡人數(shù)接近1000 多萬，患者約有1億多萬，根據(jù)世界權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，到2030年以上人數(shù)將翻一番，這是一組 可怕的數(shù)字。心血管病診治成本越來越高，按患者的年治療費(fèi)用10萬（貧窮地區(qū)可能偏 高，發(fā)達(dá)地區(qū)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出20萬），900多萬患者，每年的花費(fèi)是1. 8萬億人民幣，扣除成本 35%約6多千億，每年約有1. 2萬億人民幣白白消耗了。而且，患者死亡率非常高，在所有 疾病中，心腦血管病的死亡率仍然是第一位。因此，現(xiàn)有的臨床心腦血管病診治模式一定要 改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是提前做到預(yù)防性篩查，然后及時(shí)介入預(yù)防性調(diào)控和預(yù)防性治療，做 到基因水平心腦血管病的治未病。
[0003] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致心腦血管病死亡率不降的重要原因是不能做到 真正的早期診治。依照現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室生化（心腦血管損傷相關(guān)的酶類得檢測(cè)）指標(biāo)來診斷， 大部分都停留在心腦血管病形成后檢測(cè)及病發(fā)后的療效觀察。
[0004] 隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查心腦血管病、治療心腦血管病、以及預(yù)防心腦血管病，已取得長足進(jìn) 步。至今，我們已有可能在基因的一級(jí)轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平或microRNA)上做更精確的 早期篩查和診斷，在心腦血管病變前期或心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷前，就可以做到早期預(yù)測(cè) 和篩查。本發(fā)明采用核酸原位雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本，心腦血管病人、高危人群（三 高人群）、正常對(duì)照，對(duì)KLF4基因 mRNA與各種心腦血管病變的早期預(yù)警進(jìn)行檢測(cè)分析。 [0005] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，心腦血管病和其它臨床的重大疾病 的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治），要做到預(yù)防性診治， 做到治未病，只有這樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會(huì)成本和醫(yī)療成本。因 此，發(fā)明人在開發(fā)和生產(chǎn)重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上 都做了創(chuàng)新。特別是篩選臨床標(biāo)本（正常人群、高危人群、心腦血管病患者），突破了正常 組織與病變組織比較的一貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)心腦血管病變前期的RNA水平，與 心腦血管病早期基因病理生理學(xué)演變密切相關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上心 腦血管病發(fā)后診治模式變成的早期預(yù)防性診治，爭(zhēng)取了心腦血管病診治的時(shí)間和空間，達(dá) 到預(yù)防心腦血管病發(fā)生。本發(fā)明人在研究中KLF4基因是一個(gè)防止血管形成阻塞的重要遺 傳因子。如果負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳因子KLF4的短缺，將更易形成有害牙菌斑和脂 肪沉積，KLF4不足使血管更易形成斑塊。斑塊積累（即動(dòng)脈粥樣硬化）使血管變窄，為血 栓形成導(dǎo)致心臟病和中風(fēng)發(fā)作打下基礎(chǔ)。相反，足夠水平的KLF4將保護(hù)血管內(nèi)襯免遭可觸 發(fā)形成斑塊和凝塊的毒素和其他有害物質(zhì)的侵害。研究回答了關(guān)于血管健康的一個(gè)基本問 題，即發(fā)現(xiàn)了 KLF4是內(nèi)皮細(xì)胞最主要功能的主調(diào)控器。這些遺傳因子的水平因人體疾病而 改變，因此以此為祀標(biāo)或是可行的治療策略。
[0006] 目前對(duì)KLF4基因的研究都采用高通量基因芯片分析技術(shù)，而這些方法多用于科 研方面，不適應(yīng)臨床應(yīng)用，而檢測(cè)RNA比基因分析更科學(xué)（DNA分析大部分在易感性的表象 上，mRNA是功能性體現(xiàn)），比蛋白分析更可靠（本發(fā)明人在研究才雙標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)mRNA與 蛋白轉(zhuǎn)錄有時(shí)候不同步，有mRNA轉(zhuǎn)錄，但有時(shí)沒有蛋白表達(dá)）。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料KLF4 基因 mRNA水平的檢測(cè)技術(shù)及試劑盒未見報(bào)道。
[0007] 原位雜交技術(shù)（in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈（即探針），在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0008] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明 確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子），探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探 針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加 以標(biāo)記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常 用的同位素標(biāo)記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu) 點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同 位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是 極其靈敏的。
[0009] 根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（RNA)和檢測(cè)的靶RNA是采用堿基互 補(bǔ)（雜交互補(bǔ)）的原理，同時(shí)經(jīng)過長時(shí)間研究和觀察原位雜交過程中，啟動(dòng)和中止處得殘基 對(duì)檢測(cè)的結(jié)果沒有影響。
[0010] 鑒于目前臨床上心腦血管病的診斷（生化指標(biāo)物都是大部分心腦血管病發(fā)生后 的診斷）是晚期診斷，治療也是晚期治療，導(dǎo)致死亡率不降的醫(yī)治模式。本發(fā)明的初衷是想 改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預(yù)防性治未病，達(dá)到預(yù)防性診治。采用 核酸原位雜交技術(shù)和免疫組化方法相結(jié)合檢測(cè)心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷病前期變mRNA表達(dá) 變化，做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破，提供心腦血管損傷病變?cè)缙趍RNA水平篩查技術(shù)。使臨床上 有了一項(xiàng)新的心腦血管損傷病變前期mRNA水平真正早期篩查的技術(shù)，為臨床心腦血管內(nèi) 皮細(xì)胞損傷的診治爭(zhēng)取時(shí)間和空間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，其包含原位雜交檢測(cè)探針和 標(biāo)記物。
[0012] 其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與各種心腦血管內(nèi)皮損傷病變前期篩查及 患者治療后早期預(yù)警相關(guān)的原位雜交檢測(cè)方法。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢 測(cè)試劑盒，其包括雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示序 列的互補(bǔ)序列，序列號(hào)：NM_〇〇4235. 4,序列長度是2949bp，CDS :595…2034bp，位于染色體 9q31"上。（本發(fā)明的探針序列是KLF4基因⑶S中的一段從901...1261bp).在探針標(biāo)記 技術(shù)上問題，重復(fù)說明一下，探針的序列是KLF4基因 mRNA的雜交互補(bǔ)堿基序列，探針標(biāo)記 的過程就是一個(gè)雜交的互補(bǔ)過程）
[0014] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0015] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0016] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。
[0017] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0018] 本發(fā)明的癌變前期KLF4篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于，對(duì)各種心腦血管內(nèi)皮損傷病 變前期篩查，尤其是心梗的前期篩查，及心腦血管損傷病發(fā)后或治療后病程評(píng)判和預(yù)警，進(jìn) 一步配合臨床治療。
[0019] 本發(fā)明還提供一種KLF4原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè) RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
[0020] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為： 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)。
[0021] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液標(biāo)本。更優(yōu)選地 是，所述的血液標(biāo)本來自各種心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷前期患者、各種心血管病高危人群、健 康正常人群。
[0022] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷高危人群、 心血管病好發(fā)家族、各種心腦血管病患者（特別是心梗早期病人）。
[0023] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合，以KLF4為檢 測(cè)對(duì)象，合成探針是KLF4序列的互補(bǔ)序列，檢測(cè)的底物是人體血液中KLF4基因 mRNA的表 達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供KLF4的半定量或定量表達(dá)程度判定。根據(jù)雜交后 免疫組化顯色判定以上mRNA的表達(dá)量，正常人KLF4高表達(dá)，即細(xì)胞大量顯色；KLF4在心腦 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷病人中低表達(dá)6-16%;高危人群有一定量表達(dá)18-28%，和正常對(duì)照人群 比較有顯著差異，該基因的表達(dá)量比正常人表達(dá)量都低。
[0024] 本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括： 1) .將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中； 2) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液； 3) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定； 4) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交（42°C ); 5) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗； 6) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交（42°C ); 7) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗； 8) ·儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)（室溫）； 9) .儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色； 10) .取出封片鏡檢。
[0025] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是：以KLF4合成的核酸探針用地高辛標(biāo)記（地 高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素 標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn)），將該雜交探針與人體血 液中的待測(cè)mRNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定 位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的mRNA的表達(dá)量。
[0026] 本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測(cè)底物細(xì)胞中的KLF4 表達(dá)量，用來確定各種心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞病理演變前期（特別是心梗早期）的mRNA變化 量，預(yù)警各種心腦血管病變（心肌梗塞）是否發(fā)生及各種心腦血管病患者治療后的預(yù)后預(yù) 測(cè)。因?yàn)镵LF4在正常人中高表達(dá)，如果KLF4表達(dá)量降低，說明心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷病理 過程已開始，說明心腦血管損傷已發(fā)生，或心腦血管損傷病人經(jīng)治療后心腦血管病理機(jī)制 的變化及療效評(píng)判，從而獲得心腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的早期診斷信息。
[0027] -個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。
[0028] 本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)各種心腦血管病 變（特別心梗、中風(fēng)）發(fā)生和病理演變過程中KLF4表達(dá)量的變化，預(yù)警各種心腦血管病發(fā) 生、發(fā)展趨勢(shì)。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測(cè)與心血管病標(biāo)志物檢查有顯著不同。 本發(fā)明可以在mRNA水平檢測(cè)KLF4異常表達(dá)，心血管病生化指標(biāo)（現(xiàn)有臨床指標(biāo)）未產(chǎn)生 異常之前，亦未發(fā)生心梗之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床心腦血管 內(nèi)皮細(xì)胞損傷患者一個(gè)真正的早期預(yù)警。這樣才有可能實(shí)施心腦血管病損傷的早期篩查、 早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治各種心血管病的致死性。
[0029] 此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè) 方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明KLF4原位雜交技術(shù)流程圖（核酸原位雜交技術(shù)流程圖）
[0031] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中心肌損傷病人KLF4低表達(dá)圖片。
[0032] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中高危人群KLF4表達(dá)圖片。
[0033] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中正常人KLF4高表達(dá)圖片。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說明 而非限定本
【發(fā)明內(nèi)容】
，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 實(shí)施例1 按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以KLF4設(shè)計(jì)的雜交探 針、標(biāo)記物、說明書，其中：本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。
[0036] 試劑盒雜交液組成： 消化液 100 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 保護(hù)液 100 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 預(yù)雜交液 1300 μ L/管 2管/盒 無色透明液體 正義雜交液10 U L/管 1管/盒 無色透明液體 反義雜交液?ο μ L/管 1管/盒 無色透明液體 封閉液 1000 μ L/管 1管/盒 無色透明液體 堿性磷酸酶 抗體 luL/管 1管/盒 無色透明液體 顯色劑A 175PL/管 1管/盒 黃色液體 顯色劑B 320 μι/管 1管/盒 無色透明液體 淺黃色或無色透 緩沖液I 90mL/瓶 1瓶/盒 明液體 淺黃色或無色透 緩沖液II 80mL/瓶 1瓶/盒 明液體 淺黃色或無色透 緩沖液III 20mL/瓶 3瓶/盒 明液體 淺黃色或無色透 緩沖液IV 90mL/瓶 1瓶/盒 明液體 固定液 90mL/瓶 1瓶/盒 無色透明液體 陽性對(duì)照標(biāo) 本 6片/盒 配制試劑使用濃度 1) .將10X緩沖液I用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液I ; 2) .將20X緩沖液II用三蒸水按1 : 10稀釋成2X緩沖液II ; 按1 : 100稀釋成0.2X緩沖液II;按1 : 200稀釋成0.1 X緩沖液II; 3) .將10X緩沖液III用三蒸水按1 : 10稀釋成IX緩沖液III ; 4) . 10 X緩沖液IV用三蒸水按1 : 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10mL，力口 水至100mL既可）。
[0037] 實(shí)施例2 應(yīng)用核酸原位雜交檢測(cè)方法對(duì)各組血液標(biāo)本KLF4表達(dá)量的實(shí)施過程： 1) .取待測(cè)標(biāo)本兩張； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加 IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度）50ml，37°C水浴預(yù)熱10min，放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗5min ; 3) .用0.2%的保護(hù)液（保護(hù)液lml加 IX緩沖液I，99ml即為使用濃度）洗lOmin，三 蒸水洗5min (以上過程都在玻璃缸進(jìn)行），取出玻片，讓其自然干燥； 4) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液25 μ L/片（加在有細(xì)胞的地方），蓋上蓋玻片， 蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70^^90^^95 %的乙醇各洗 2min，取出，自然干燥； 6) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25 μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ; 7) .取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)： 在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ; 在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ; 8) .用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0. 5%封閉液（1ml封閉液加5mllX緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。（此步驟不需加蓋玻片）； 10) .取出玻片，用IX緩沖液ΠΙ洗30s，自然干燥； 11) .將玻片放入保濕盒內(nèi)，加 X-AP抗體（取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入 1.811111\緩沖液111)10(^17片，蓋緊保濕盒在室溫下作用3〇1^11，時(shí)間不能過長，否則會(huì) 產(chǎn)生假陽性（此步驟不需加蓋玻片）； 12) .取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min; 13) .用1 X緩沖液IV洗2min，加顯色劑（顯色劑A73. 3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到 30mLl X緩沖液IV中，混勻），室溫避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的IX緩沖液I混勻）封片鏡檢。
[0038] 本發(fā)明的核酸原位雜交檢測(cè)方法將目的基因用地高辛標(biāo)記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下 觀察RNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的RNA的表達(dá)量。
[0039] 心腦血管病人20例，高危人群（三高人群）20例，正常對(duì)照組20名。抽所有待檢 人的外周血3-5毫升（分離白細(xì)胞）做原位雜交。結(jié)果表示，所有心血管病患者KLF4表達(dá) 量低，細(xì)胞染色淺；高危人群表達(dá)稍降低，小數(shù)染色；正常對(duì)照組KLF4表達(dá)量高，細(xì)胞大多 數(shù)染色，具體結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

【權(quán)利要求】
1. 一種原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針分 為序列表SEQ ID NO. 1所示序列中CDS中的一段的互補(bǔ)序列，從901. ... 1261bp。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光 或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種KLF4基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物 中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件 為：核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)。
8. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人血液中的mRNA標(biāo)本。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的血液mRNA成分選自心腦血管疾 病、高危人群（高血壓、高血脂、高血糖及心梗前期）、正常人標(biāo)本。
10. 如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述標(biāo)本包括臨床上的各種心血管的 高危人群前期病理演變過程中，以及各種心腦血管病經(jīng)治療后病理演變過程中療效評(píng)判。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104141000SQ201310167923
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月9日
【發(fā)明者】裘建英, 張?jiān)聘? 張玉麗, 裘霖 申請(qǐng)人:嘉興瑞康生物科技有限公司