專利名稱：培養(yǎng)基及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及內(nèi)皮細(xì)胞再生技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及培養(yǎng)基及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及用于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的一組培養(yǎng)基和試劑盒，及其在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的用途、體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，以及內(nèi)皮細(xì)胞或其衍生物。
背景技術(shù)：
心血管系統(tǒng)是胚胎發(fā)育中首先出現(xiàn)并發(fā)揮功能的系統(tǒng)。血管的發(fā)生和發(fā)育不僅對(duì)于胚胎形成中器官的發(fā)育和分化十分重要，對(duì)于成體的創(chuàng)傷修復(fù)和生殖功能也是具有重要意義的。血管發(fā)育在一系列病理現(xiàn)象中也有重要作用，如視網(wǎng)膜增殖、衰老相關(guān)的退行性斑點(diǎn)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及迄今仍無(wú)有效治療手段的腫瘤發(fā)生等。血管內(nèi)皮細(xì)胞裱襯在整個(gè)心血管系統(tǒng)的內(nèi)表面，為單層扁平上皮，是血管壁與血液之間的分界細(xì)胞，是形成心血管封閉管道系統(tǒng)的形態(tài)基礎(chǔ)。其在組織的動(dòng)態(tài)平衡、纖維蛋白溶解和凝集、血液-組織分子交換、血管收縮調(diào)控、正常和腫瘤組織的血管化、以及生理和病理?xiàng)l件下的血細(xì)胞的活化和遷移中都發(fā)揮了重要作用。目前人們多認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞除作為血液和組織間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的屏障外，最主要的生物學(xué)功能是使循環(huán)血液保持流動(dòng)狀態(tài)，此外血管內(nèi)皮細(xì)胞尚可合成與分泌多種結(jié)締組織成分、參與一些物質(zhì)的代謝及與白細(xì)胞相互作用等。上述這些生理過程的發(fā)揮都依賴于對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞精密的調(diào)控，而失調(diào)則導(dǎo)致病理現(xiàn)象的發(fā)生。研究決定內(nèi)皮細(xì)胞分化和表型的分子機(jī)制對(duì)于闡明血管發(fā)生發(fā)育的原理、對(duì)梗 死或損傷組織的血管新生治療以及抗腫瘤治療都有重要的指導(dǎo)意義。人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)作為一種具備自我更新和無(wú)限增殖潛能的多能性細(xì)胞，其向內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性為心血管疾病和四肢缺血的治療提供了令人興奮的前景。近年來(lái)，不斷有研究證實(shí)，人胚胎干細(xì)胞hESCs具有分化成不同發(fā)育階段的內(nèi)皮細(xì)胞的能力。通過與小鼠的基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)、誘導(dǎo)形成擬胚體(EBs)并添加促血管發(fā)育的因子、或與特殊的二維介質(zhì)的共培養(yǎng)等策略營(yíng)造內(nèi)皮發(fā)育微環(huán)境，已有多個(gè)研究小組從hESCs中分化、分離到了內(nèi)皮細(xì)胞。近期的研究結(jié)果顯示hESCs來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞能形成新的血管，提高梗死心臟的功能，是細(xì)胞替代治療中新的細(xì)胞源。雖然取得了這些成果，但是使用EBs (擬胚體)添加內(nèi)皮相關(guān)誘導(dǎo)因子，與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或者是使用基質(zhì)膠添加因子來(lái)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞，一般都會(huì)再通過分選的方式獲得相對(duì)較純的內(nèi)皮細(xì)胞，之后再擴(kuò)大培養(yǎng)。但是由于本身使用這些誘導(dǎo)方法產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞的比例及數(shù)量就較少，再加之分選之后在體外擴(kuò)增的倍數(shù)有限，也難以用于臨床治療。高效快速的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化依然是難以解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠用于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞(ESCs)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基、試劑盒及方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一組培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該組培養(yǎng)基包括:第一培養(yǎng)基，該第一培養(yǎng)基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養(yǎng)基；第二培養(yǎng)基，該第二培養(yǎng)基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培養(yǎng)基；以及第三培養(yǎng)基，該第三培養(yǎng)基為EGM2培養(yǎng)基。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述培養(yǎng)基能夠高效快速地誘導(dǎo)ESCs向內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而能夠有效地為ECs (即內(nèi)皮細(xì)胞)應(yīng)用于心血管疾病和四肢缺血的治療提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的一組培養(yǎng)基還可以具有如下附加的技術(shù)特征:根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該MDM/F12培養(yǎng)基包含:75%的添加了 GlutaMAX -1的IMDM培養(yǎng)基；以及25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培養(yǎng)基。其中，在本文中所述的“GlutaMAX -1”表示谷丙氨酸二肽。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該第一培養(yǎng)基中包含1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、0.05%BSA (即牛血清白蛋白)、1% 非必需氨基酸(其英文縮寫為“NEAA”)和25ng/ml rhBMP-4 (即重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有誘導(dǎo)分化因子rhBMP-4的第一培養(yǎng)基，在rhBMP-4合適的濃度及作用時(shí)間下能夠高效誘導(dǎo)ESCs向中內(nèi)胚層進(jìn)行分化，這是由ESCs來(lái)源獲得內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，該第二培養(yǎng)基中包含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%NEAA (非必需氨基酸)、50ng/ml rhVEGF (即重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)以及50ng/ml rhbFGF (即堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有對(duì)于內(nèi)皮誘導(dǎo)分化及擴(kuò)大培養(yǎng)有明顯促進(jìn)作用的rhVEGF和rhbFGF生長(zhǎng)因子的第二培養(yǎng)基，能夠有效地誘導(dǎo)ESCs來(lái)源的中內(nèi)胚層細(xì)胞向內(nèi)皮祖/內(nèi)皮細(xì)胞分化。根據(jù)本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施例，進(jìn)一步包括:第四培養(yǎng)基，該第四培養(yǎng)基為添加了Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巰基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的D-MEM/F-12培養(yǎng)基；以及第五培養(yǎng)基，該第五培養(yǎng)基為mTeSR培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第四培養(yǎng)基中包含20%KnoCkout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0.1mMP-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml bFGF。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，該成分明確，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有能夠維持ESCs (胚胎干細(xì)胞)干性的rhbFGF生長(zhǎng)因子的第四培養(yǎng)基，能夠與滋養(yǎng)層細(xì)胞共同長(zhǎng)期培養(yǎng)ESCs并能夠有效維持ESCs的特性。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含前面所述的本發(fā)明的一組培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，利用本發(fā)明的試劑盒，采用其中的培養(yǎng)基培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，能夠高效地實(shí)現(xiàn)體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，從而能夠有效地制備獲得大量的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)于心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的一組培養(yǎng)基，或者試劑盒在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的用途。從而，利用上述一組培養(yǎng)基或試劑盒，能夠有效地實(shí)現(xiàn)體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，且誘導(dǎo)分化的效率尤其高。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟:利用前面所述的一組培養(yǎng)基，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。由此，能夠高效快速地誘導(dǎo)ESCs向內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內(nèi)皮細(xì)胞，其對(duì)心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，胚胎干細(xì)胞來(lái)源于人類。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，利用前面所述的一組培養(yǎng)基，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步包括:利用該第一培養(yǎng)基對(duì)該胚胎干細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞；利用該第二培養(yǎng)基對(duì)該經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞；以及利用該第三培養(yǎng)基對(duì)該經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得內(nèi)皮細(xì)胞。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用上述方法能夠高效快速地誘導(dǎo)ESCs向內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而能夠有效地為ECs應(yīng)用于心血管疾病和四肢缺血的治療提供了細(xì)胞基礎(chǔ)，意義重大。需要說明的是，利用上述本發(fā)明的方法體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)階段結(jié)束后，已經(jīng)有內(nèi)皮祖和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，即經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞中包含有部分內(nèi)皮祖和內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，進(jìn)行該第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)1.5-3天，優(yōu)選2天。由此，能夠有效促進(jìn)ESCs向中內(nèi)胚層分化。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，進(jìn)行該第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)為4-8天，優(yōu)選4.5天。由此，能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞向內(nèi)皮祖/內(nèi)皮細(xì)胞分化。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施例，在本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法中，進(jìn)行該第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)為3-20天。由此，能夠有效促進(jìn)經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞向內(nèi)皮祖/內(nèi)皮細(xì)胞的分化，以及內(nèi)皮祖/內(nèi)皮細(xì)胞的進(jìn)一步分化成熟。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，經(jīng)過第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，可以繼續(xù)利用第三培養(yǎng)基對(duì)獲得的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。由此，能夠有效制備獲得大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在進(jìn)行該第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括:利用該第五培養(yǎng)基將該胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后依次進(jìn)行消化和傳代處理。由此，可以有效去除部分滋養(yǎng)層細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)無(wú)滋養(yǎng)層培養(yǎng)的ESCs，為后續(xù)的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)做準(zhǔn)備。其中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)行該預(yù)培養(yǎng)5-7天。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，利用1%的dispase酶進(jìn)行該消化處理。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施例，按照1:3的比例進(jìn)行該傳代處理2-3次。由此，經(jīng)過多次無(wú)滋養(yǎng)層的傳代處理后，可以完全去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，從而能夠避免滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)后續(xù)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的影響，同時(shí)，多次的傳代處理也可以獲得大量ESCs細(xì)胞，為進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得大量?jī)?nèi)皮祖/內(nèi)皮細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在將該胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括:利用該第四培養(yǎng)基將該 胚胎干細(xì)胞進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)。由此，能夠在體外條件下長(zhǎng)期維持ESCs的特性。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，進(jìn)一步包括將經(jīng)過滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代處理。由此，可以實(shí)現(xiàn)經(jīng)過滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)，從而能夠獲得大量的ESCs，以便為后續(xù)的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)做準(zhǔn)備。其中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，利用IV型膠原酶進(jìn)行該消化處理，按照1:3或1:5的比例進(jìn)行該傳代處理。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，在進(jìn)行該第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括:將該經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代處理。由此，可以避免由于細(xì)胞的過度增殖而對(duì)誘導(dǎo)分化的效率產(chǎn)生負(fù)面影響。其中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，利用0.25%的胰酶進(jìn)行該消化處理。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，按照1:2或1:3的比例進(jìn)行該傳代處理。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種內(nèi)皮細(xì)胞或其衍生物，其是通過前面所述的本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的內(nèi)皮細(xì)胞或其衍生物，能夠有效用于梗死或損傷組織的血管新生、四肢缺血以及抗腫瘤的治療，對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展意義重大。需要說明的是，本發(fā)明的一組培養(yǎng)基以及利用該組培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，均是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動(dòng)和大量的優(yōu)化工作才完成的。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的一般方法的流程示意圖；圖2顯示了實(shí)施例1中經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞，其干性和中內(nèi)胚層相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果以及細(xì)胞形態(tài)圖，其中，圖2A顯示了干性和中胚層相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，圖2B顯示了細(xì)胞形態(tài)圖；圖3顯示了實(shí)施例1中經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞，其內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果、血管樣結(jié)構(gòu)形成和植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及細(xì)胞形態(tài)圖，其中，圖3A顯示了內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，圖3B顯示了內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，圖3C顯示了細(xì)胞形態(tài)圖，圖3D顯示了血管樣結(jié)構(gòu)形成和植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4顯示了實(shí)施例1中經(jīng)過第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)6天獲得的內(nèi)皮細(xì)胞，其內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果、流式儀檢測(cè)結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)圖，其中，圖4A是偏成熟內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，圖4B是內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因⑶31和KDR表達(dá)水平的流式儀檢測(cè)結(jié)果，圖4C是細(xì)胞形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。—般方法:根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，參照?qǐng)D1，本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法一般包括以下步驟:首先，依次利用第四培養(yǎng)基將胚胎干細(xì)胞進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，以及利用第五培養(yǎng)基將胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后，利用該第一培養(yǎng)基對(duì)該胚胎干細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞。接著，利用該第二培養(yǎng)基對(duì)該經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞。然后，利用該第三培養(yǎng)基對(duì)該經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例1參照?qǐng)D1，采用本發(fā)明的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，按照以下步驟培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞:1、滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)采用第四培養(yǎng)基，將小鼠成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞與未分化的人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞(即hESCs，Hl和H9)共培養(yǎng)。其中，第四培養(yǎng)基的基本組成為:78%D-MEM/F-12基本培養(yǎng)基(GIBC0，N0.12400-016)，添加了 20%Knockout 血清替代物(GIBC0，10828)，ImM L-谷氨酰胺(GIBC0, 35050) ,0.1mM^ -巰基乙醇(Invitrogen, 21985-023)，1% 非必需氨基酸(NEAA(英文縮寫)，Invitrogen, 11140-050),以及5ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF (英文縮寫)，Millipore, GF003)。經(jīng)過滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)后，對(duì)hESCs進(jìn)行觀察，如果需要傳代，則用IV型膠原酶將待傳代的hESCs消化成小的細(xì)胞團(tuán)，之后根據(jù)細(xì)胞密度按照1:3或者是1:5進(jìn)行傳代處理。2、預(yù)培養(yǎng)然后，將上述經(jīng)過滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hESCs傳代至無(wú)飼養(yǎng)層的Matrigel (超純層纖連蛋白，BD，354277)上，用第五培養(yǎng)基即專用的mTeSR培養(yǎng)基(StemCell, #05850)進(jìn)行培養(yǎng)。待hESCs生長(zhǎng)至5_7天時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的大小及密度進(jìn)行消化處理，消化時(shí)使用lmg/ml dispase酶(中性蛋白酶,stem cell, 07923)。然后,將經(jīng)過消化處理的細(xì)胞接種至鋪有Matrigel的孔板中，常規(guī)靜置培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化前將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的hESCs進(jìn)行2-3次無(wú)滋養(yǎng)層的傳代處理。其中，進(jìn)行上述傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(jī)(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養(yǎng)基，用IXPBS洗三次。b、加入lmg/ml dispase酶(stem cell,07923)進(jìn)行消化處理，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞，若克隆發(fā)生卷邊，則棄dispase酶終止消化，并用I XPBS洗三次(避免用力吹打細(xì)胞，防止克隆丟失)。
C、添加入新的mTeSR培養(yǎng)基(Stem Cell, #05850)，并用該培養(yǎng)基輕柔吹打克隆，使得胚胎干細(xì)胞(ESCs)克隆從孔板上脫落。其中，要求盡量將所有克隆均吹打下來(lái)，并盡量將克隆吹打成均一大小的細(xì)胞團(tuán)塊。d、根據(jù)所得細(xì)胞密度，按照1:2或者1:3的比例，將上述hESCs克隆接種于含有mTeSR培養(yǎng)基并處理有Matrigel的孔板中，之后將細(xì)胞置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。e、24小時(shí)后，根據(jù)克隆的大小進(jìn)行換液處理(即繼續(xù)培養(yǎng))或者下面所述的誘導(dǎo)分
化培養(yǎng)。3、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)按照以下步驟，將上述經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)及傳代處理的hESCs進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:3.1第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)首先，待上述經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)及傳代處理的hESCs貼壁后，根據(jù)克隆的大小選擇是否進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。選取合適的孔板，要求孔板中含有盡可能多的大小合適的hESCs克隆(即含十幾至幾十個(gè)細(xì)胞的克隆)，利用第一培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)48小時(shí)，以便獲得經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞。其中，第一培養(yǎng)基為添加了 1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS (英文縮寫)，GIBC0，41400-045)、0.05%BSA (牛血清白蛋白，GIBCO，11021-029)、1% 非必需氨基酸(NEAA (英文縮寫)，Invitrogen, 11140-050)和 25ng/ml 重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4 (rhBMP-4, RD, 314-BP)的MDM/F12培養(yǎng)基。其中，在本文中所述的“MDM/F12培養(yǎng)基”包含:75%的添加了GlutaMAX -1 的 MDM 培養(yǎng)基(GIBC0，31980)，以及 25% 的添加了 GlutaMAX _I 的 F12 培養(yǎng)基(GIBC0，37165)。3.2第二 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)將上述獲得的經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞，棄第一培養(yǎng)基并用PBS洗滌一次，之后利用第二培養(yǎng)基進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-8天，以便獲得經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞。其中，第二培養(yǎng)基為添加了 1%胰島素鐵硒傳遞蛋白(GIBC0，41400-045)、
0.05%BSA(GIBCO, 11021-029)、1% 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)、50ng/ml 重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhVEGF (英文縮寫)，PEPR0TECH，100-20)以及50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhbFGF (英文縮寫)，Millipore, GF003)的頂DM/F12培養(yǎng)基。進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4.5天后，經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至接近孔板密度的90%以上。3.3第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)在開始第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)之前，利用0.25%胰酶，將經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化處理，并按照1:2或者是1:3的比例進(jìn)行傳代處理。其中，進(jìn)行消化和傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(jī)(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養(yǎng)基，用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS進(jìn)行配置，之后過濾除菌，4°C保存或者_(dá)20°C保存)進(jìn)行消化處理，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞與孔板之間發(fā)生脫離則添加含10%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(即MDM培養(yǎng)基+10%FBS)，終止消化。
C、收集細(xì)胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘。之后棄上清并使用PBS重懸洗滌細(xì)胞，以便去除終止消化中使用的血清，然后于IOOOrpm條件下再次離心5分鐘。d、棄上清，用EGM2培養(yǎng)基(Lonza，cc-4176)重懸細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞密度，按照1:2或者1:3的比例進(jìn)行接種，然后置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。e、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，選擇進(jìn)行換液(即繼續(xù)培養(yǎng))或者是傳代處理。然后，利用第三培養(yǎng)基，將上述經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)及傳代處理的細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3-20天，以便獲得內(nèi)皮細(xì)胞。其中，第三培養(yǎng)基為EGM2培養(yǎng)基(Lonza, cc-4176)。進(jìn)行第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3_6天時(shí)，根據(jù)細(xì)胞密度考慮是否進(jìn)行傳代處理。其中，進(jìn)行消化和傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(jī)(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養(yǎng)基， 用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS進(jìn)行配置，之后過濾除菌，4°C保存或者_(dá)20°C保存)進(jìn)行消化處理，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞與孔板之間發(fā)生脫離則終止消化。C、收集細(xì)胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘。之后棄上清并用PBS重懸細(xì)胞，然后于IOOOrpm下離心5分鐘。d、棄上清，用EGM2培養(yǎng)基(Lonza，cc-4176)重懸細(xì)胞，并根據(jù)細(xì)胞密度，按照1:2或者1:3的比例進(jìn)行接種，然后置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中靜置過夜培養(yǎng)。此外，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)一步于第三培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以便獲得更多的內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例2分別對(duì)實(shí)施例1中獲得的經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞、經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞，以及經(jīng)過第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)6天獲得的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測(cè)，并于顯微鏡下觀察三個(gè)階段中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。一、具體檢測(cè)方法:1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)使用儀器:5910型離心機(jī)(日本久保田)，DH-1I旋轉(zhuǎn)混合儀(寧波新芝公司)，流式儀器(BD，F(xiàn)ACSAria)o方法:1.1消化細(xì)胞:(I)棄舊的培養(yǎng)基，用IXPBS洗三次。(2)加入0.25%胰酶將待檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行消化處理，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞與孔板之間發(fā)生脫離則添加入新的終止培養(yǎng)基，終止消化。(3)收集細(xì)胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘，之后棄上清并用PBS重懸細(xì)胞。1.2標(biāo)記抗體:根據(jù)抗體說明書，將上述獲得的經(jīng)過消化處理的細(xì)胞置于離心管中并將4-7 X IO5細(xì)胞重懸于100 ill PBS中，之后添加相應(yīng)的抗體，即抗人CD31-APC(eBioscience, 17-0319-42)和抗人 CD309-PE(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2，VEGFR2/KDR; R&D systems, 560494),然后充分混勻，并將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上進(jìn)行流式抗體的孵育和標(biāo)記，時(shí)間為40分鐘。1.3 洗抗體:標(biāo)記完成后，使用1.4ml PBS重懸上述經(jīng)過抗體標(biāo)記的細(xì)胞，并于IOOOrpm下離心5分鐘。之后棄上清，并使用1.5ml PBS再次重懸細(xì)胞,然后于IOOOrpm下離心5分鐘,之后重復(fù)該步驟(即棄上清、重懸之后離心)。1.4 重懸:棄上清，利用300-500 U I PBS或者2%多聚甲醛重懸經(jīng)過上述處理的細(xì)胞。1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)按照產(chǎn)品說明書及操作指南，將上述獲得的重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)。2、RT-PCR (實(shí)時(shí)定量 PCR)檢測(cè)2.1RNA 提取使用儀器:離心機(jī)(sigma公司，3_18k)。方法:(I)細(xì)胞的收集-貼壁細(xì) 胞:于離心管中，利用膠原酶或胰酶將待檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行消化離心后，PBS洗兩次，再次進(jìn)行離心后棄上清，然后利用ImlTRIZOL(Invitrogen, 15596018)裂解細(xì)胞，之后按照后續(xù)步驟進(jìn)行RNA的提取。(2)將樣品(即經(jīng)過裂解的細(xì)胞)于室溫下靜置5-15分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。(3)每管加入0.2ml氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10006892)蓋上蓋子，劇烈充分搖勻15s，然后于室溫下靜置10分鐘。(4)于4°C，12000g條件下離心15分鐘，RNA溶解在上層的水層里邊，體積大約為50%。(5)將上述離心管中的上層無(wú)色水相層輕柔轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中。(6)向新的離心管中加入0.5ml異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，80109292),之后輕柔混勻，室溫放置lOmin。(7)于4°C，12000g條件下離心15分鐘，棄上清，則底部會(huì)有白色的RNA沉淀。(8)棄上清，向離心管中加入由DEPC水(無(wú)RNA酶的水)配制的75%的酒精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10009292)，重懸RNA，之后于4°C，12000g下離心15分鐘。(9)棄凈上清，靜置5-10min，待酒精揮發(fā)且底部RNA剛好變無(wú)色時(shí)加入10-30 ylDEPC水(無(wú)RNA酶的水)，之后進(jìn)行濃度測(cè)定。(10)將提取獲得的RNA于_70°C下保存，備用。2.2反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，根據(jù)操作說明將0.8 y g上述提取獲得的RNA進(jìn)行20 u I體系的反轉(zhuǎn)錄。使用儀器:PCR儀(Eppendorff公司，mascercycler),小型臺(tái)式離心機(jī)(杭州奧盛，K6)具體方法:(I)按照以下配比，將下述各組分充分混勻:
模版RNA 500-800ng (根據(jù)實(shí)際RNA濃度添加對(duì)應(yīng)的體積)Oligo dT 引物 2.0ii I無(wú)RNA 酶的水(RNase Free dH20 (DEPC 水))使液體終體積為 12.0 iU。(2)將上述混合物進(jìn)行離心，然后置于70°C下lOmin，冰上急冷2min，再離心數(shù)秒，使液體集中于離心管管底，以便獲得經(jīng)過處理的模版RNA。(3)按照以下配比，于離心管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.一組培養(yǎng)基，其特征在于，包括: 第一培養(yǎng)基，所述第一培養(yǎng)基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4 的 MDM/F12 培養(yǎng)基； 第二培養(yǎng)基，所述第二培養(yǎng)基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培養(yǎng)基；以及 第三培養(yǎng)基，所述第三培養(yǎng)基為EGM2培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組培養(yǎng)基，其特征在于，所述IMDM/F12培養(yǎng)基包含: 75%的添加了 GlutaMAX -1的MDM培養(yǎng)基；以及 25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組培養(yǎng)基，其特征在于，所述第一培養(yǎng)基中包含1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸和25ng/ml rhBMP-4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組培養(yǎng)基，其特征在于，所述第二培養(yǎng)基中包含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸、50ng/ml rhVEGF以及50ng/ml rhbFGF。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組培養(yǎng)基，其特征在于，進(jìn)一步包括: 第四培養(yǎng)基，所述第四培養(yǎng)基為添加了 Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巰基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的 D-MEM/F-12培養(yǎng)基；以及第五培養(yǎng)基，所述第五培養(yǎng)基為mTeSR培養(yǎng)基， 其中，所述第四培養(yǎng)基中包含20%Knockout血清替代物、ImM L-谷氨酰胺、0.1mMP-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml rhbFGF。
6.一種用于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一組培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一組培養(yǎng)基,或者權(quán)利要求6所述的試劑盒在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的用途。
8.—種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: 利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一組培養(yǎng)基，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞， 任選地，所述胚胎干細(xì)胞來(lái)源于人類。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的一組培養(yǎng)基，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步包括: 利用所述第一培養(yǎng)基對(duì)所述胚胎干細(xì)胞進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞； 利用所述第二培養(yǎng)基對(duì)所述經(jīng)過第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞；以及 利用所述第三培養(yǎng)基對(duì)所述經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以便獲得內(nèi)皮細(xì)胞，其中 進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)1.5-3天，優(yōu)選2天， 進(jìn)行所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4-8天，優(yōu)選4.5天， 進(jìn)行所述第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3-20天， 在進(jìn)行所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括: 利用所述第五培養(yǎng)基將所述胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后依次進(jìn)行消化和傳代處理，其中，進(jìn)行所述預(yù)培養(yǎng)5-7天，利用1%的dispase酶進(jìn)行所述消化處理，按照1:3的比例進(jìn)行所述傳代處理2-3次， 在將所述胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括:利用所述第四培養(yǎng)基將所述胚胎干細(xì)胞進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，以及進(jìn)一步包括將經(jīng)過滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代處理，其中利用IV型膠原酶進(jìn)行所述消化處理，按照1:3或1:5的比例進(jìn)行所述傳代處理， 在進(jìn)行所述第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)之前，進(jìn)一步包括:將所述經(jīng)過第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代處理，其中利用0.25%的胰酶進(jìn)行所述消化處理，按照1:2或1:3的比例進(jìn)行所述傳代處理。
10.一種內(nèi)皮細(xì)胞或其衍生物，其是通過權(quán)利要求8或9所述的體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法獲得的。 ·
全文摘要
本發(fā)明公開了用于體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的一組培養(yǎng)基和試劑盒，及其在體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞中的用途、體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，以及內(nèi)皮細(xì)胞或其衍生物。其中，該組培養(yǎng)基包括第一培養(yǎng)基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養(yǎng)基；第二培養(yǎng)基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培養(yǎng)基；以及第三培養(yǎng)基，其為EGM2培養(yǎng)基。利用本發(fā)明的該組培養(yǎng)基能夠高效快速地誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分化。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103194423SQ201310073318
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者裴雪濤, 謝小燕, 岳 文, 何麗娟, 李艷華, 南雪, 姚海雷, 房芳, 張博文 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所