專利名稱：用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水質(zhì)檢測技術領域，具體涉及一種用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素(geosmin)藍藻的引物及PCR方法,用于快速準確地對水體中具有產(chǎn)geosmin能力的藍藻進行定性檢測。
背景技術：
土臭素(geosmin)，中文名二甲萘烷醇，淡黃色油狀物，分子式C12H22O,化學結構式為反 _1，10- 二甲基 _ 反-9-萘燒醇(trans-1, 10-dimethyl-trans-9-decalol),飽和的環(huán)叔醇類物質(zhì)，結構非常穩(wěn)定，難以自然降解。geosmin具土霉味，氣味閾值極低(水體中4-20 ng/L、魚體中0.6 μ g/kg)，水體和魚體中只要含有微量的該物質(zhì)即可被人的嗅覺所覺察，不僅危及飲用水安全、降低水產(chǎn)品質(zhì)量，而且增加供水和水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)成本，對社會、經(jīng)濟的負面影響較大。在水生態(tài)系統(tǒng)中，部分藍藻和放線菌等原核生物是產(chǎn)生上述土霉味化合物的主要生物源，絕大多數(shù)源水異味與之相關。水體異味問題是水環(huán)境問題之一，其種類多樣，包含土霉味、氯味、草木味、沼氣味、芳香味、魚腥味、藥水味及化學藥品味等8種嗅覺異味，但“土霉異味”是世界范圍內(nèi)備受關注的環(huán)境問題。目前，國內(nèi)外對土霉味化合物的檢測方法可分為兩類，即嗅覺鑒定法和儀器分析法。嗅覺鑒定法存在精密度較差、無法測定低于嗅覺閾值濃度等缺點。儀器分析法一般先采用不同的前處理方法對其進行富集，再結合GC-MS來分析，分析方法的靈敏度主要取決于前處理方法的富集效率，且價格相對昂貴、耗時耗力。PCR是一種準 確、高效、應用最廣的技術，但應用于水體中產(chǎn)geosmin藍藻的檢測方面，尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物及PCR方法，采用PCR技術對水體中產(chǎn)geosmin藍藻進行檢測，這樣即使水樣中產(chǎn)geosmin藍藻現(xiàn)存量很低或不高的情況下也可以擴增出應有的產(chǎn)物，是一種很有應用前景的水體異味早期監(jiān)測技術，可為水體異味突發(fā)事件的預警預報、監(jiān)控管理提供有力的技術保障。為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物，其核苷酸序列為GEOl :5’ -GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’，如 SEQ ID NO.1 所示；GE02 :5’ -YTTGTTCATRTARCGGCT-3’，如 SEQ ID No. 2 所示。該方法是以提取的待測藻樣基因組總DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，最后電泳鑒定。詳述如下一、引物的設計和合成
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的geosmin合成酶基因序列設計引物，引物序列為正向引物(GEOl):5，-GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’，如 SEQ ID NO.1 所示；反向引物(GE02):5，-YTTGTTCATRTARCGGCT-3’，如 SEQ ID No. 2 所示。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。二、待測藻樣基因組總DNA的提取采集藻類樣品，置于100 mL聚乙烯水樣瓶中，搖勻待測藻樣，吸取5-10 mL于10000 rpm離心3min，去除上清液，所收集的待測藻細胞采用CTAB法提取基因組總DNA。三、PCR過程以上述得到的待測藻樣基因組總DNA為模板，用設計的上述引物進行PCR擴增。PCR 的反應體系為基因組總 DNA 1μ I (含 DNA1-1OOng), 2. 5U/y ITaq 酶I μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 反應緩沖液 5 μ 1，lOmmol/LdNTPs 混合液 I μ 1,10Mmol/L GEOI/GE02引物各I μ 1，滅菌超純水補足至25 μ I。PCR的反應程序為94°C初始變性5 min，然后進行35個循環(huán)(94°C 30s, 52°C30s, 72 °C 60s)，最后 72°C 延伸 3 min 結束，4°C 保存。四、PCR產(chǎn)物的檢測 取PCR擴增產(chǎn)物8μ 1，加入2μ I 6 X Loading buffer，在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳(EB染色)，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。結果顯示，產(chǎn)geosmin藍藻基因組DNA能擴增出大小為825bp的單一目的條帶。從而，根據(jù)825bp目的片段的有無，可以判斷待測水體樣本中是否存在產(chǎn)geosmin 藍藻。本發(fā)明檢測方法特異性強，對非產(chǎn)geosmin藍藻基因組總DNA無擴增產(chǎn)物，而對產(chǎn)geosmin藍藻基因組DNA能擴增出大小為825 bp的單一目的條帶。本發(fā)明檢測方法快速，從待測藻樣基因組總DNA的提取、PCR擴增、電泳檢測，一般5h可完成檢測，且同時可做多個水樣樣本。適用于水體異味早期監(jiān)測和水體異味突發(fā)事件的預警預報等。


圖1是本發(fā)明實施例的PCR特異性擴增檢測電泳結果。圖中，各泳道分別表示M DNA Marker II ；1 :存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣樣本；2_4 不存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣樣本。
具體實施例方式實施例12012年9月分別采集存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣(采自湖南農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地池塘)和不存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣樣本(采自湖南省益陽市大通湖、瀏陽市株樹橋水庫和長沙市年嘉湖)4個，采用CTAB法分別提取各樣本待測藻樣基因組總DNA，用本發(fā)明的引物對4個樣本進行PCR檢測，電泳結果見圖1，結果表明存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣和不存在產(chǎn)geosmin藍藻水樣樣本PCR檢測結果，僅有I呈陽性，可見本發(fā)明的檢測方法具有很好的特異性。
序列表
<110〉湖侖農(nóng)業(yè)大學
<120>用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物及方法
<130>PHW13029
<160>2
<170〉PatentIn version 3. 3
<210〉I
<211〉20
<212>DNA<213〉人工序列
<400〉 I
gcyttrcttt gytcktatac20
<210〉2
<211〉18
<212〉DNA<213>人工序列
<400> 2
yxtgttcatr tarcggct18
權利要求
1.用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物，其核苷酸序列為GEOl :5’ -GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’ ；GE02 :5’ -YTTGTTCATRTARCGGCT-3’。
2.如權利要求1所述的用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物，其特征在于所述引物是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的土臭素合成酶基因序列設計的。
3.一種快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的方法，其特征在于該方法是以提取的待測藻樣基因組總DNA為模板，利用權利要求1所述的引物進行PCR擴增，最后電泳鑒定。
4.如權利要求3所述的快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的方法，其特征在于所述PCR產(chǎn)物大小為825bp。
5.如權利要求3所述的快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的方法，其特征在于所述PCR的反應體系為含DNA1-1OOng的基因組總DNA 1μ1、2·5 U/μ I Taq酶1μ1、10Χ含Mg2+的 PCR 反應緩沖液 5μ l、10mmol/LdNTPs 混合液 I μ1、10Mmol/L GE01/GE02 引物各 I μ1、及滅菌超純水補足至25 μ I。
6.如權利要求3所述的快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的方法，其特征在于所述PCR的反應程序為94°C初始變性5 min ;然后35個循環(huán)94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s ;最后72°C 延伸 3min，4°C 保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及水質(zhì)檢測技術領域，具體涉及用于快速檢測水體中產(chǎn)土臭素藍藻的引物及方法，可用于快速準確地對水體中具有產(chǎn)土臭素(geosmin)能力的藍藻進行定性檢測。該方法是從采集水樣中離心收集待測藻樣，提取待測藻樣基因組總DNA，使用特異性引物對待測藻樣基因組總DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用本發(fā)明方法可以快速準確地判斷水體中產(chǎn)geosmin藍藻的存在狀況，且可同時檢測多個水體樣本，具有檢測速度快、成本低的優(yōu)點。
文檔編號C12N15/11GK103045749SQ20131001146
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權日2013年1月11日
發(fā)明者張婷, 李德亮, 肖調(diào)義 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學