甘蔗成花控制技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠使植物特別是甘蔗及其近緣屬種進(jìn)行有效的交配育種的技術(shù)。
【專利說明】甘薦成花控制技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA 和成花誘導(dǎo)基因的、具有促進(jìn)植物的成花或出穗的功能和/或促進(jìn)植物的分葉的功能的 DNA及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 甘藏是在己西、印度等W約2000萬ha生產(chǎn)、被用于制糖用?己醇生產(chǎn)用途的資源 作物，今后由于生物燃料的普及而有持續(xù)需求增長的前景，期待其增產(chǎn)。
[0003]出于作為原料作物的甘藏的廉價并且穩(wěn)定的供給的目的，甘藏的品種改良和育種 盛行。一直W來，甘藏的品種改良和育種通過交配來進(jìn)行（非專利文獻(xiàn)1)。
[0004] 然而，由于甘藏是起源于熱帶地方的植物，所W在國±幾乎都屬于溫帶的日本國 內(nèi)不能出穗?開花，而且由于基因組構(gòu)成復(fù)雜，因此有效的品種改良和育種是非常困難的。
[0005] 另外，W往的雜交育種，W依靠經(jīng)驗、直覺的組合雜交進(jìn)行交配，對大量后代作出 全面評價來進(jìn)行選拔。一般而言，為了進(jìn)行交配，必須經(jīng)過成花誘導(dǎo)、開花?受粉、結(jié)實促 進(jìn)?采種的過程，對于甘藏的情況，甚至在適合生長發(fā)育的地方，1年也只能組織1次該過 程。因此，開發(fā)出一個品種必須花費非常長的時間。
[0006] 并且，在交配的品種是不易開花的品種、要交配的品種彼此的開花時期不吻合的 情況下，進(jìn)行所希望的交配是非常困難的。
[0007] 因此，在該領(lǐng)域中，迫切需要甘藏的有效的交配育種方法。
[0008] 迄今為止，報告了通過在擬南芥、稻子中過量表達(dá)了FT基因或者化Hd3a基因之類 的成花誘導(dǎo)基因，能夠誘導(dǎo)成花（出穗）（專利文獻(xiàn)1-3、非專利文獻(xiàn)2-3)。另外，現(xiàn)在，F(xiàn)T 基因或者化Hd3a基因被確認(rèn)在許多植物種中發(fā)揮相同的效果。
[0009] 然而，沒有在甘藏中使該些基因過量表達(dá)的重組體的報告。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[0012] 專利文獻(xiàn)1 ;日本特開2000-139250號公報
[0013] 專利文獻(xiàn)2 ;日本特表2002-511270號公報
[0014] 專利文獻(xiàn)3 ;日本特開2002-153283號公報
[0015] 非專利文獻(xiàn)
[0016] 非專利文獻(xiàn)1 ;宮里清松，甘藏及其栽培，1986年，日本分蜜糖工業(yè)會發(fā)行
[0017] 非專利文獻(xiàn) 2;KardailskyI.etal.，Science. 1999Dec3 ;286 巧446) :1962-5.
[0018]非專利文獻(xiàn) 3;KojimaS.etal.，PlantCellPhysiol20020ct;43 (10): 1096-105.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]本發(fā)明的目的在于提供能夠使植物特別是甘藏及其近緣屬種進(jìn)行有效的交配育 種的技術(shù)。
[0020] 本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在具有對成熟葉特異性 促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA的控制下，使成花誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而能促進(jìn)植 物體的成花（出穗），能夠有效地得到可交配的植物體，進(jìn)而完成本發(fā)明。
[0021]目P，本發(fā)明包含W下山?[5]的特征。
[002引 山一種DNA，包含選自W下的（a)?（d)中的任一種DNA和編碼選自W下的 (e)?（g)中的任一種多膚的DNA，具有促進(jìn)植物的成花或出穗的功能和/或促進(jìn)植物的分 葉的功能，
[002引 （a)由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，
[0024]化）由在序列號1所示的堿基序列中缺失、取代、添加或插入了1個?多個堿基的 堿基序列構(gòu)成，并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA，
[00巧](C)由與序列號1所示的堿基序列具有90%W上的序列同源性的堿基序列構(gòu)成， 并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA，
[0026] (d)在嚴(yán)格的條件下與由跟序列號1所示的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交， 并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA;
[0027] (e)由序列號7所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚，
[002引訊由在序列號7所示的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入了 1個?多個氨基 酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多膚，
[0029] (g)由與序列號7所示的氨基酸序列具有90%W上的序列同源性的氨基酸序列構(gòu) 成，并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多膚。
[0030] 凹一種重組載體，包含山的DNA。
[00引]閒一種轉(zhuǎn)化植物，導(dǎo)入了山的DNA或凹的重組載體。
[00礎(chǔ)W]根據(jù)閒的轉(zhuǎn)化植物，屬于禾本科。
[0033][引根據(jù)[4]的轉(zhuǎn)化植物，屬于甘藏屬、高梁屬或者芒屬。
[0034] 本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本國專利申請2012-140231號的 說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供可使植物特別是甘藏及其近緣屬種進(jìn)行有效的交配育種的 技術(shù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1表示來源于甘藏（Saccharumofficinarum)的ecc0002EST的堿基序列（序列 號 4)(用DFCISugarcaneGeneIndex檢索）。
[0037] 圖2表不Saccharumspp.CV.NiF8的各組織中的ecc0002EST的表達(dá)量的分析結(jié) 果。將表達(dá)最強(qiáng)的成熟葉的表達(dá)量表示為100%。
[003引 圖3表示在5'末端導(dǎo)入化ndlll限制酶識別序列和在3'末端導(dǎo)入Blnl限制酶 識別序列的ecc0002基因的基因表達(dá)控制區(qū)域的堿基序列（序列號5)。
[00測 圖4表示（A)來源于梗稻組（OryzasativaJaponicaGroup)的Hd3a基因的堿 基序列（CDS:153-692)(序列號6)和炬）該基因所編碼的多膚的氨基酸序列（序列號7)。
[0040]圖5表示包含彼此連接的ecc0002基因的基因表達(dá)控制區(qū)域和目-葡萄糖酵酸酶 基因的基因表達(dá)載體的示意圖。
[0041] 圖6表示利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制目-葡萄糖酵酸酶基因的表達(dá) 的基因重組甘藏的各組織中的GUS基因的表達(dá)量的分析結(jié)果。將觀察到的最強(qiáng)的表達(dá)量的 該基因重組甘藏的成熟葉的表達(dá)量表示為100%。
[0042] 圖7表示向基因表達(dá)載體插入的包含ecc0002基因的表達(dá)控制DNA和稻子Hd3a 基因的DNA的堿基序列（序列號3)。大文字；ecc0002基因的表達(dá)控制DNA;小文字：稻子 Hd3a基因。
[0043] 圖8表示包含彼此連接的ecc0002基因的基因表達(dá)控制區(qū)域和稻子Hd3a基因的 基因表達(dá)載體的示意圖。
[0044] 圖9表示利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制稻子Hd3a基因的基因重組甘 藏、利用CaMV35S啟動子來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基因重組甘藏W及野生型甘藏的 各組織中的稻子Hd3a基因的表達(dá)量的分析結(jié)果。表中，"基因重組體eccOOO化ro."表示利 用ecc0002基因的基因表達(dá)控制區(qū)域來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基因重組甘藏。另外， "基因重組體35SCaMVpro."表示通過CaMV35S啟動子來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基 因重組甘藏。
[0045] 圖10表示利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制稻子Hd3a基因的基因重組甘 藏的分葉誘導(dǎo)能力的分析結(jié)果。分葉數(shù)為基因重組甘藏（n= 5)和野生型（n= 3)的平均 值。
[0046] 圖11表示利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制稻子Hd3a基因的基因重組甘 藏的出穗誘導(dǎo)能力的分析結(jié)果。出穗數(shù)為基因重組甘藏（n= 5)和野生型（n= 3)的平均 值。

【具體實施方式】
[0047]W下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0048] 本發(fā)明的具有促進(jìn)植物的成花或出穗的功能和/或促進(jìn)植物的分葉的功能的 DNA，包含具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA和成花誘導(dǎo)基因。
[0049] 本發(fā)明中，"促進(jìn)植物的成花或出穗"是指在導(dǎo)入了具有該功能的DNA的植物體中， 促進(jìn)花芽、花器官的分化?形成和/或促進(jìn)出穗和/或開花（縮短到出穗和/或開花為止 的時期）。
[0050] 另外，本發(fā)明中，"促進(jìn)植物的分葉"是指在導(dǎo)入了具有該功能的DNA的植物體中， 促進(jìn)根附近的側(cè)枝的形成，縮短該側(cè)枝的形成開始時期和/或增大該側(cè)枝的數(shù)目。
[0051] 首先，說明具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA。應(yīng)予說 明，W下將"具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA"記載為"基因 表達(dá)控制DNA"，本說明書中該些術(shù)語可彼此互換使用。
[005引本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA包含W下的（a)?（d)中任一種DNA。
[005引 （a)由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，
[0054]化）由在序列號1所示的堿基序列中缺失、取代、添加或插入了1個?多個堿基的 堿基序列構(gòu)成，并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA，
[0(巧日](C)由與序列號1所不;的堿基序列具有90%W上的序列同源性的堿基序列構(gòu)成， 并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DM，
[0056] (d)在嚴(yán)格的條件下與由跟序列號1所示的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DM雜交， 并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA。
[0057] 本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA可W通過如下方式取得；通過利用來源于甘藏的各組 織（例如，莖、成熟葉、幼葉）的總RNA或者來源于其的cDNA的基因表達(dá)分析，取得成熟葉 特異性表達(dá)的候補(bǔ)基因，對該候補(bǔ)基因評價表達(dá)特性，從而確定被評價為成熟葉特異性表 達(dá)的基因，基于確定的基因的cDNA或者基因組DNA鑒定該候補(bǔ)基因的5'上游區(qū)域的堿基 序列。該里基因表達(dá)分析可W使用DNA芯片、差異顯示法等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基因 表達(dá)的各種分析方法。
[005引具體而言，序列號1的堿基序列存在于在甘藏的成熟葉中特異性表達(dá)的基因（W下，記載為"ecc0002")的5'上游區(qū)域。本說明書中"甘藏"包含屬于甘藏屬的植物，例如甘 藏（Saccharumofficinarum)、竹藏（Saccharumsinense)、細(xì)桿甘藏（Saccharumbarberi)、 大莖野生種（Saccharumrobustum)、割手密（Saccharumspontaneum)、肉質(zhì)花穗野生種 (Saccharumedule)、甘藏屬雜交栽培種（Saccharumspp.Hybridscv.NiFS)等（不特別限 定于該些）及其近緣屬種，例如高梁等。優(yōu)選為甘藏屬雜交栽培種（Saccharumspp.Hybrids cv.化F8)。
[0059] 分離5'上游區(qū)域的DNA的方法沒有特別限定，可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知 的一般方法進(jìn)行。例如，可W使用基于上述ecc0002基因的堿基序列（序列號4)克隆 未知的區(qū)域（該時為5'上游區(qū)域）的公知方法進(jìn)行分離。例如，作為其中之一，對包含 ecc0002基因的5'上游區(qū)域的基因組DNA進(jìn)行限制酶處理而使由規(guī)定的堿基序列構(gòu)成的 接頭（adapter)結(jié)合，對ecc0002基因的堿基序列和接頭設(shè)定引物而進(jìn)行PCR。由此，能 夠?qū)⑴cecc0002基因的堿基序列在5'上游鄰接的未知的堿基序列擴(kuò)增。而且測定擴(kuò)增了 的堿基序列的序列后，基于測定的堿基序列，再設(shè)計一對引物，將與測定的堿基序列鄰接的 另外的未知的堿基序列同樣地進(jìn)行擴(kuò)增。該方法中，可W使用市售的克隆試劑盒，例如， 化曲tWa化（注冊商標(biāo)）試劑盒炬E幻進(jìn)行。另外，作為上述W外的方法，可舉出基于反向 PCR的方法。該時，基于ecc0002基因的堿基序列信息設(shè)計一對引物，使用該一對引物和用 規(guī)定的限制酶處理后而自身連接的基因組DNA片段進(jìn)行PCR，從而能夠擴(kuò)增ecc0002基因的 上游區(qū)域。另外，作為其它方法，可舉出將ecc0002基因的上游區(qū)域從基因組DNA文庫分離 的方法。此時，將包含ecc0002基因的cDNA作為探針，從根據(jù)常規(guī)方法制備的基因組DNA 文庫中篩選包含ecc0002基因的基因組DNA。其后，通過測定篩選出的基因組DNA的堿基序 列來確定存在于ecc0002基因的上游區(qū)域的5'上游區(qū)域，并且，能夠通過PCR等僅擴(kuò)增5' 上游區(qū)域。
[0060] 該樣，依次擴(kuò)增或者篩選位于ecc0002基因的上游的未知的堿基序列，根據(jù)常規(guī) 方法測定堿基序列，從而能夠得到由序列號1表示的堿基序列。該樣，如果測定由序列號 1表示的堿基序列，則其后使用基于序列號1所示的堿基序列設(shè)計的引物，利用W從甘藏提 取出的基因組DNA為模板的PCR，能夠得到序列號1所示的堿基序列。
[0061] 序列號1所示的堿基序列，作為在成熟葉中特異性誘導(dǎo)基因表達(dá)的基因表達(dá)控制 區(qū)域發(fā)揮功能?；虮磉_(dá)控制區(qū)域包含啟動子區(qū)域、增強(qiáng)子區(qū)域、TATA盒和/或CAT盒等 (不特別限定于該些）、涉及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的堿基序列。
[0062] 本說明書中"特異性"是指在構(gòu)成植物體的各種組織中僅在成熟葉中具有基因表 達(dá)誘導(dǎo)功能，除此之外是指成熟葉中的基因表達(dá)誘導(dǎo)功能與成熟葉W外的組織（例如，幼 葉、莖髓、莖皮、根、分生組織等）中的基因表達(dá)誘導(dǎo)功能相比明顯高，或者統(tǒng)計學(xué)有意義地 高（例如，大約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或者其W上）。
[0063] 本說明書中"成熟葉"是指為了進(jìn)行光合作用而將葉綠體蓄積在細(xì)胞內(nèi)、帶綠色的 葉子，是除作為不具有用于光合作用的葉綠體的葉子的幼葉W外的葉組織。
[0064] 基因表達(dá)誘導(dǎo)功能可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的報告基因試驗等來確認(rèn)。報 告基因試驗可W通過如下方式確認(rèn)；制備在研究基因表達(dá)誘導(dǎo)功能的堿基序列的控制下 (下游區(qū)域）連接各種報告基因（例如，目-葡萄糖酵酸酶基因（GU巧、英光素酶基因（LUC)， 綠色英光蛋白基因（GF巧等）而成的載體，使用該載體導(dǎo)入或者短暫導(dǎo)入宿主的基因組后， 測定該報告基因的表達(dá)水平。作為該報告基因，只要其表達(dá)是可檢測的，就沒有特別限制， 例如，可W舉出本領(lǐng)域技術(shù)人員一般使用的CAT基因、lacZ基因、英光素酶基因（W下為 LUC)、目-葡萄糖酵酸酶（W下為GU巧基因W及綠色英光蛋白（W下為GF巧基因等。
[0065] 報告基因的表達(dá)水平，可W根據(jù)該報告基因的種類，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知 的方法進(jìn)行測定。例如，報告基因為CAT基因時，通過檢測該基因產(chǎn)物所致的氯霉素的己醜 化，從而能夠測定報告基因的表達(dá)水平。各報告基因的表達(dá)水平可W用W下方法測定。報告 基因為lacZ基因時，檢測該基因表達(dá)產(chǎn)物的催化劑作用所致的色素化合物的發(fā)色。為LUC 基因時，檢測該基因表達(dá)產(chǎn)物的催化劑作用所致的英光化合物的英光。為GFP基因時，檢測 GFP蛋白質(zhì)所致的英光。例如，報告基因為GUS時，在宿主細(xì)胞內(nèi)的啟動子活性可W分別通 過如下方式確認(rèn)；通過（i)利用組織化學(xué)的GUS染色的方法（EMB0J. 6, 3901-3907 (1987)) 和/或根據(jù)（ii)使用英光底物的（^istle&Morris的方法（PlantMolecularBiology Manual,B5,1-16(1994) ；S.B.Gelvin&R.A.Schilperoort,KluwerAcademicPublishers) 測定GUS活性，進(jìn)一步根據(jù)化a壯ord的方法（Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976))測定蛋白 質(zhì)量，按蛋白質(zhì)量換算GUS活性（計算為nmole4-MU/min/mgprotein)。
[0066] 另外，使用上述W外的基因作為報告基因時可W通過如下方式進(jìn)行；使用 Northern雜交法、RT-PCR法、DNA陣列技術(shù)等測定該基因的轉(zhuǎn)錄水平，或者使用SDS-PAGE 等電泳法、Western印跡法等測定該基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
[0067] 本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA不限定于由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，如上 述化）所記載，只要具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性，也可W是序列號1所示的堿 基序列中缺失、取代、添加或插入了 1個?多個堿基的堿基序列。
[006引例如，即使是序列號1所示的堿基序列中缺失、取代、添加或插入了1?100個的 堿基、優(yōu)選1?50個的堿基、更優(yōu)選1?10個的堿基的堿基序列，只要顯示對成熟葉特異 性促進(jìn)基因表達(dá)的活性，就包括在本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA中。
[0069] 另外，本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA不限定于由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的 DNA，如上述（C)所記載，只要顯示對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性，也可W是與序列 號1所示的堿基序列具有80%W上、更優(yōu)選90%W上、進(jìn)一步優(yōu)選95%W上、最優(yōu)選99% W上的序列同源性的堿基序列。堿基序列的比較可W通過公知的方法進(jìn)行，例如，可W按例 如默認(rèn)設(shè)置使用BLAST炬asicLocalAlignmentSearchToolatthe^tionalCenter 化rBiologicalIn化rmation(美國國立生物學(xué)信息中也的基本局部比對搜索工具））等實 施。
[0070] 另外，本發(fā)明的基因表達(dá)控制DM不限定于由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的 DNA，如上述（d)所記載，只要顯示對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性，也可W是在嚴(yán)格 的條件下與由跟序列號1所示的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的堿基序列。
[0071]本發(fā)明中"嚴(yán)格的條件"是指形成所謂的特異性雜交體、不形成非特異性雜交體的 條件，例如指在含有2?6XSSC(1XSSC的組成；0. 15MNaCl，0. 015M巧樣酸軸，抑7. 0)和 0. 1?0. 5%SDS的溶液中在42?55°C進(jìn)行雜交并在含有0. 1?0. 2XSSC和0. 1?0. 5% SDS的溶液中在55?65C進(jìn)行清洗的條件。
[0072] 另外，本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA，只要顯示對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活 性，也可W是在序列號1所示的堿基序列中從5'末端和/或3'末端缺失了連續(xù)的100個、 200 個、300 個、400 個、500 個、600 個、700 個、800 個、900 個、1000 個、1100 個、1200 個、1300 個、1400個、1500個或者其W上的堿基的DNA片段。堿基的缺失可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知的一般方法（例如，PCR法、限制酶處理等）進(jìn)行。該DNA片段可W是在本發(fā)明的基 因表達(dá)控制DNA中的啟動子區(qū)域。規(guī)定的基因表達(dá)控制DNA中的啟動子區(qū)域可W使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員所公知的啟動子分析工具（例如，Bioln化rmaticsandMolecularAnalysis Section(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/) ；Prestridge,D.S. (1995). PredictingPolIIPromoterSequencesUsingTranscriptionFactorBindingSites. J.Mol.Biol. 249 :923-32)進(jìn)行檢索。作為該樣的序列號1所示的堿基序列的片段，可舉出 由序列號1的第869?1119位的堿基構(gòu)成的DNA。得到的該片段可W通過上述報告基因試 驗等來確認(rèn)其基因表達(dá)誘導(dǎo)功能。
[0073] 該樣，如果本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA的堿基序列被確定，則其后通過化學(xué)合成， 或者通過W基因組DNA為模板的PCR，或者通過將具有該堿基序列的DNA片段作為探針進(jìn) 行雜交，能夠得到本發(fā)明的基因表達(dá)控制DNA。并且，可W通過定點突變等合成具有突變的 序列號1所示的堿基序列。應(yīng)予說明，在向序列號1所示的堿基序列導(dǎo)入突變中，可W采用 Kunkel法、Gapped化plex法等公知的方法或者基于它們的方法。例如使用利用了定點突 變法的突變導(dǎo)入用試劑盒（例如Mutant-K(TAKARA公司制）、Mutant-G(TAKARA公司制）） 等或者使用TAKARA公司的LAPCRinvitroMutagenesis系列試劑盒進(jìn)行突變的導(dǎo)入。
[0074] 接下來，對成花誘導(dǎo)基因進(jìn)行說明。
[0075] 本說明書中"成花誘導(dǎo)基因"是指對具有促進(jìn)植物的成花或者出穗的活性的蛋白 質(zhì)進(jìn)行編碼、參與植物中的成花或者出穗的基因。
[0076] 成花誘導(dǎo)基因是公知的，在擬南芥、稻子中作為FT基因、化Hd3a基因等已經(jīng)被確 定（日本特開2000-139250號公報、日本特表2002-511270號公報、日本特開2002-153283 號公報、KardailskyLetal.，上載，KojimaS.etal.，上載），本發(fā)明中可W利用該些。 成花誘導(dǎo)基因可W通過公開的數(shù)據(jù)庫（GenBank等）進(jìn)行檢索，例如，來源于化yzasativa JaponicaGroup的Hd3a基因的堿基序列（圖4,序列號6)和氨基酸序列（圖4,序列號7) 作為AB052944. 1登錄在GenBank上。
[0077] 成花誘導(dǎo)基因可W通過分子生物學(xué)的領(lǐng)域中公知的克隆方法取得。例如，可W通 過使用基于公知的基因序列（例如，作為AB052944. 1登錄在GenBank上）設(shè)計的探針或者 引物，篩選來源于植物的基因組文庫或者cDNA文庫而得到。來源于序列信息未知的植物的 基因可w通過使用利用序列已知的植物的基因信息而設(shè)計的探針或者引物，篩選來源于該 植物的基因組文庫或者cDNA文庫而得到。如果序列被分離，則使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)該 樣的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增法來擴(kuò)增DNA，能夠得到適合于轉(zhuǎn)化（基因?qū)耄┑牧康幕蛑礜A)。
[0078]優(yōu)選成花誘導(dǎo)基因包含編碼選自W下的（e)?（g)中的任一種多膚的DNA:
[0079] (e)由序列號7所示的氨基酸序列構(gòu)成的多膚，
[0080] (f)由在序列號7所示的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入了1個?多個氨基 酸的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多膚，
[0081] (g)由與序列號7所示的氨基酸序列具有90%W上的序列同源性的氨基酸序列構(gòu) 成，并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多膚。
[0082]序列號7所示的氨基酸序列表示來源于稻子的Hd3a蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0083] 本發(fā)明中成花誘導(dǎo)基因所編碼的多膚不限定于由序列號7所示的氨基酸序列構(gòu) 成的多膚，如上述（f)所記載，也可W是由在序列號7所示的氨基酸序列中缺失、取代、添加 或插入了1個?多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多膚。
[0084]例如，即使是序列號7所示的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入了1?20個的 堿基、優(yōu)選1?10個、更優(yōu)選1?5個的氨基酸的氨基酸序列，只要具有促進(jìn)成花的活性， 就能夠用于本發(fā)明。
[0085]另外，本發(fā)明中成花誘導(dǎo)基因所編碼的多膚不限定于由序列號7所示的氨基酸序 列構(gòu)成的多膚，如上述（g)所記載，只要具有促進(jìn)成花的活性，也可W是與序列號7所示的 氨基酸序列具有80 %W上、更優(yōu)選90 %W上、進(jìn)一步優(yōu)選95 %W上、最優(yōu)選99 %W上的序 列同源性的氨基酸序列。堿基序列的比較，如上所述，例如可W按例如默認(rèn)設(shè)置使用BLAST 等實施。
[008引作為該樣的成花誘導(dǎo)基因，可舉出由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA。由該序 列號2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA編碼來源于稻子的Hd3a蛋白質(zhì)。
[0087]另外，作為本發(fā)明的成花誘導(dǎo)基因，不限定于由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的 基因，只要編碼具有促進(jìn)成花或出穗的活性的蛋白質(zhì)，就能夠利用在序列號2所示的堿基 序列中缺失、取代、添加或插入了 1個?多個堿基的堿基序列。
[008引例如，即使是序列號2所示的堿基序列中缺失、取代、添加或插入了1?50個的堿 基、更優(yōu)選1?10個的堿基的堿基序列，只要編碼具有促進(jìn)成花的活性的蛋白質(zhì)，就可W用 于本發(fā)明。
[0089]并且，作為本發(fā)明的成花誘導(dǎo)基因，不限定于由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的 基因，只要編碼具有促進(jìn)成花或出穗的活性的蛋白質(zhì)，也可W是與序列號2所示的堿基序 列具有80%W上、更優(yōu)選90%W上、進(jìn)一步優(yōu)選95%W上、最優(yōu)選99%W上的序列同源性 的堿基序列。堿基序列的比較，如上所述，例如可W按例如默認(rèn)設(shè)置使用BLAST等實施。
[0090]并且，作為本發(fā)明的成花誘導(dǎo)基因，不限定于由序列號2所示的堿基序列構(gòu)成的 基因，只要編碼具有促進(jìn)成花或出穗的活性的蛋白質(zhì)，也可W是在嚴(yán)格的條件下與由跟序 列號2所示的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的堿基序列。
[0091]"嚴(yán)格的條件"如上所述。
[009引接著，對使用了上述的基因表達(dá)控制DNA和成花誘導(dǎo)基因的重組載體進(jìn)行說明。
[0093]本發(fā)明的重組載體，可W通過將W能發(fā)揮功能的形式對上述的基因表達(dá)控制DNA 連接成花誘導(dǎo)基因而成的DM導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體來構(gòu)建。本說明書中，"W能發(fā)揮功能的形 式連接"、能發(fā)揮功能的形式被連接"是指在導(dǎo)入了該載體的宿主細(xì)胞內(nèi)，W在該基因表 達(dá)控制DNA的控制之下成花誘導(dǎo)基因被正確地表達(dá)的方式，含有彼此連接的基因表達(dá)控制 DNA和成花誘導(dǎo)基因。該里"連接"可W是直接連接，也可W是隔開適當(dāng)?shù)拈L度和序列的間 隔而間接連接。優(yōu)選W利用存在于序列號1所示的堿基序列的3'末端的"ATG"作為成花 誘導(dǎo)基因中編碼第一蛋氨酸的"ATG"的形式進(jìn)行連接。作為該樣的DNA，可舉出W利用存在 于序列號1所示的堿基序列的3'末端的"ATG"作為存在于序列號2的5'末端的"ATG"的 形式被連接的、由序列號3所示的堿基序列構(gòu)成的DNA。
[0094]作為本發(fā)明中使用的載體，優(yōu)選使用能夠借助農(nóng)桿菌屬向植物導(dǎo)入功能性基因 的地I系、pBII系、pPZP系化ajcl址iewiczP，Sv油Z，MaligaP.;Thesmall，versatile pPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.,PlantMol Biol.，25 :989-94,1994)、pCAMBIA系（ht1:p://www.Gambia,org/main/r_et_camvec. htm)、pSMA系的載體等。特別優(yōu)選使用地II系和地I系的雙元載體或者中間載體系，例如， 可舉出地11221、地I121、pBI101、地1101. 2、pBI101. 3、pIG121等。雙元載體是在大腸桿菌 巧scherichiacoli)和農(nóng)桿菌屬中可復(fù)制的穿梭載體，如果使植物感染保持雙元載體的農(nóng) 桿菌屬，則能夠?qū)⒂晌挥谳d體上的LB序列和RB序列構(gòu)成的邊界序列所圍起的部分的DNA 整合到植物核DNA中（EMB0Journal，10(3)，697-704(1991))。另一方面，pUC系的載體能 夠向植物直接導(dǎo)入基因，例如，可舉出pUC18、pUC19、pUC9等。另外，也可W使用花挪菜花葉 病毒（CaMV)、菜豆花葉病毒炬GMV)、煙草花葉病毒（TMV)等植物病毒載體。
[0095] 為了使連接和/或向載體的插入變得容易，上述的基因表達(dá)控制DNA和/或成花 誘導(dǎo)基因中可W適當(dāng)?shù)厝〈?、插入或者添加限制酶識別序列。向載體插入時，可W使用如下 方法：首先，將上述的基因表達(dá)控制DNA和包含成花誘導(dǎo)基因的純化的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼?切斷，插入到適當(dāng)?shù)妮d體DNA的限制酶識別部位或者多克隆位點與載體連接的方法等。
[0096] 還可W根據(jù)需要在載體中在基因表達(dá)控制DNA和/或成花誘導(dǎo)基因的上游、內(nèi)部、 或下游連接增強(qiáng)子、內(nèi)含子、poly(A)加尾信號、5' -UTR序列、選擇標(biāo)記基因等。
[0097] 作為增強(qiáng)子，例如，用于提高成花誘導(dǎo)基因的表達(dá)效率，例如，可舉出包含CaMV35S 啟動子內(nèi)的上游側(cè)的序列的增強(qiáng)子區(qū)域等。
[0098] 作為終止子，只要是能夠?qū)⒗蒙鲜鰡幼愚D(zhuǎn)錄的基因轉(zhuǎn)錄終結(jié)的序列即可，例 女口，可舉出廁脂堿合成酶基因的終止子、章魚堿合成酶基因的終止子、CaMV35SRNA基因的 終止子等。
[0099] 作為選擇標(biāo)記基因，例如，可舉出潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、雙丙氨麟 抗性基因、滅癌素S抗性基因、己醜乳酸合成酶（Acetolactatesynthase)基因等。選擇標(biāo) 記基因，可W如上述那樣與成花誘導(dǎo)基因一起與相同的質(zhì)粒連接來制備重組載體，或者，分 別制備將選擇標(biāo)記基因與質(zhì)粒連接而得到的重組載體和將成花誘導(dǎo)基因與質(zhì)粒連接而得 到的重組載體。分別制備時，將各載體共轉(zhuǎn)染（共導(dǎo)入）到宿主。
[0100] 可W使用該樣制成的重組載體制備轉(zhuǎn)化體。
[0101] 制備轉(zhuǎn)化植物時，可W適當(dāng)?shù)乩靡呀?jīng)報告并確立的各種的方法，作為其優(yōu)選的 例子，可舉出農(nóng)桿菌屬法、PEG-磯酸巧法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、基因槍法、顯微注射法等。使 用農(nóng)桿菌屬法的情況有使用原生質(zhì)體的情況、使用組織片的情況、W及使用植物體其本身 的情況（inplanta法）。使用原生質(zhì)體時，可W通過與具有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌屬共培養(yǎng)的方 法，與原生質(zhì)化的農(nóng)桿菌屬融合的方法（原生質(zhì)法）進(jìn)行，使用組織片時，可W通過使對象 植物的無菌培養(yǎng)葉片（葉盤）感染的方法、使愈合組織感染等進(jìn)行。另外，使用利用種子或 植物體的inplanta法時，即在不介由添加植物激素的組織培養(yǎng)的體系中，可W通過對吸水 種子、幼植物（幼苗）、盆栽植物等W農(nóng)桿菌屬的直接處理等來實施。
[0102] 包含上述基因表達(dá)控制DNA和成花誘導(dǎo)基因的DNA是否被整合到植物體中的確認(rèn) 可W通過PCR法、Southern雜交法、No;rthe;rn雜交法、Western印跡法等進(jìn)行。例如，從轉(zhuǎn) 化植物制備DNA，設(shè)計DNA特異性引物而進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳、聚丙帰醜胺凝膠電泳或者毛細(xì)管電泳等，利用漠化己錠、SYBRGreen液等染色，然 后作為1根的條帶的形式檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物，從而能夠確認(rèn)已轉(zhuǎn)化。另外，使用預(yù)先W英光色 素等標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，也能夠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，也可W是使擴(kuò)增產(chǎn)物與微孔板等固 相結(jié)合，通過英光或者酶反應(yīng)等確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。
[0103]作為本發(fā)明中轉(zhuǎn)化所使用的植物，例如，可舉出屬于禾本科、茄科、十字花科、豆 科、醫(yī)薇科、菊科、百合科、傘形科、石竹科、葫蘆科、旋花科、黎科等的植物，不特別限定于該 些植物。優(yōu)選禾本科的植物，例如，可舉出甘藏、稻子、大麥、小麥、玉米、結(jié)縷草、高梁、小米、 稗草、象草W及柳枝稷等植物。
[0104] 本發(fā)明中，作為成為轉(zhuǎn)化的對象的植物材料，例如，可舉出根、莖、葉、種子、胚、胚 珠、子房、莖頂（植物的芽的前端的生長點）、花藥、花粉等植物組織或其切片、未分化的愈 合組織、將其進(jìn)行酶處置而去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體等植物培養(yǎng)細(xì)胞。另外使用inplanta 法時，可W使用吸水種子、植物體整體。
[0105] 另外，本發(fā)明中轉(zhuǎn)化植物是指植物體整體、植物器官（例如根、莖、葉、花瓣、種子、 種子、果實等）植物組織（例如表皮、初皮部、薄壁組織、木質(zhì)部、維管束等）、植物培養(yǎng)細(xì)胞 中的任一種。
[0106] 將植物培養(yǎng)細(xì)胞作為對象時，為了從所得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化植物，可W通 過已知的組織培養(yǎng)法使器官或者個體再生。該樣的操作，是利用作為從植物細(xì)胞到植物體 的再生方法而通常為人所知的方法，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易進(jìn)行的。從植物細(xì)胞到 植物體的再生，例如，可W如下進(jìn)行。
[0107] 首先，使用植物組織或者原生質(zhì)體作為成為轉(zhuǎn)化的對象的植物材料時，將它們在 加入無機(jī)要素、維生素、碳源、作為能量源的糖類、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（生長素、細(xì)胞分裂素 等植物激素）等經(jīng)滅菌的愈合組織形成用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成不規(guī)則增殖的脫分化的愈合 組織（W下稱為"愈合組織誘導(dǎo)"）。將該樣形成的愈合組織轉(zhuǎn)移到包含生長素等植物生長 調(diào)節(jié)物質(zhì)的新的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步增殖（繼代培養(yǎng)）。
[0108] 愈合組織誘導(dǎo)如果用瓊脂等固體培養(yǎng)基進(jìn)行，繼代培養(yǎng)例如W液體培養(yǎng)進(jìn)行，貝U 能夠有效且大量進(jìn)行各自的培養(yǎng)。接下來，將通過上述的繼代培養(yǎng)而增殖的愈合組織在適 當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)器官的再分化（W下，稱為"再分化誘導(dǎo)"），最終再生出完整的 植物體。再分化誘導(dǎo)可W通過適當(dāng)設(shè)定培養(yǎng)基中的生長素、細(xì)胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)、碳源等各種成分的種類、量、光、溫度等而進(jìn)行。通過上述再分化誘導(dǎo)，形成不定胚、不定 根、不定芽、不定莖葉等，進(jìn)而發(fā)育成完整的植物體?；蛘撸琖成為完整的植物體前的狀態(tài) (例如膠囊化的人工種子、干燥胚、凍干細(xì)胞W及組織等）進(jìn)行儲藏等。
[0109] 本發(fā)明中"轉(zhuǎn)化植物"中，除了實施了轉(zhuǎn)化的作為再分化當(dāng)代的"T1代"之外，還包 括作為從該植物的種子得到的后代的"T2代"，將通過藥劑選擇或Southern法等進(jìn)行分析 而判斷為基因重組的"T2代"植物的花進(jìn)行自體受粉而得到的下一代（T3代）等后代植物。
[0110] 該樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物W成熟葉特異性的方式表達(dá)導(dǎo)入的成花誘導(dǎo)基因。
[0111] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中，促進(jìn)成花或者出穗，與野生型相比在早期就發(fā)生花芽、花器 官的分化?形成，和/或，發(fā)生出穗和/或開花。目P，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物與野生型相比，從播 種到出穗和/或開花的時間短。
[0112] 另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中，促進(jìn)分葉，與野生型相比，在早期產(chǎn)生分葉和/或發(fā) 生分葉數(shù)的增大。
[0113] 本發(fā)明的包含具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的基因表達(dá)控制DNA和 成花誘導(dǎo)基因的DNA，具有促進(jìn)植物特別是甘藏和甘藏近緣屬種的出穗的功能和/或促進(jìn) 分葉的功能。本發(fā)明的該DNA，即便是不出穗的品種也能夠誘導(dǎo)出穗，能夠提早出穗時期，能 夠提早分葉時期和/或能夠增大分葉數(shù)。根據(jù)該些特征，導(dǎo)入了本發(fā)明的該DNA的轉(zhuǎn)化植 物，能夠增加可出穗的分葉數(shù)，即有效分葉數(shù)，在不受系統(tǒng)所致的出穗時期和出穗能力的影 響下，有效地進(jìn)行系統(tǒng)間交配。另外，導(dǎo)入本發(fā)明的該DNA的轉(zhuǎn)化植物的代與代的時間，與 野生型相比能夠縮短為1/2?1/5,優(yōu)選1/3,能夠提高交配育種的效率。
[0114] 實施例
[0115]W下，使用實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)進(jìn)行說明。然而，本發(fā)明的技術(shù)的范圍不限 定于該些實施例。
[0116](實施例1)成熟葉特異性基因的克隆
[0117]使用RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)從甘藏（Saccharumspp.CV.NiF8)的成熟 葉、幼葉W及莖的各組織中提取純化總RNA，根據(jù)常規(guī)方法構(gòu)建cDNA文庫并用于基因表達(dá) 分析?；虮磉_(dá)分析利用SugarcaneGenomeArray(Affimet;rix)，根據(jù)制造商的說明書進(jìn) 行。
[0118] 基因表達(dá)分析的結(jié)果是在Saccharumspp.CV.NiF8的成熟葉中發(fā)現(xiàn)表達(dá)量特別高 的基因，將該基因作為"ecc0002"。應(yīng)予說明，來源于SaccharumS卵.CV.NiF8的ecc0002 基因的堿基序列與圖1所示的來源于Saccharum0巧cinarum的ecc0002EST的堿基序列一 致。從Saccharumspp.CV.MF8的成熟葉、幼葉、莖髓、莖皮、根W及分生組織中提取純化總 RNA，根據(jù)常規(guī)方法制備cDNA，通過使用AB口500實時PCR裝置（AppliedBiosystems)的 SYBRGreen法對各組織中的ecc0002基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。
[0119] 將結(jié)果示于圖2(將表達(dá)最強(qiáng)的成熟葉的表達(dá)量表示為100% )。根據(jù)該結(jié)果，可 知Saccharumspp.CV.NiF8中ecc0002基因在成熟葉中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)基因表達(dá)。
[0120] (實施例2)成熟葉特異性啟動子的取得
[012U使用DNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)從甘藏（Saccharumspp.CV.NiF8)的成熟 葉組織（0. 5g)中提取純化約3(K)ng基因組DM。W實施例1中得到的ecc0002基因的堿基序 列為基礎(chǔ)，使用化曲tWaUk(注冊商標(biāo)）Kit炬EX)，由上述基因組DM得到存在于ecc0002 基因的5'上游的基因表達(dá)控制區(qū)域。在取得的基因表達(dá)控制區(qū)域的5'末端導(dǎo)入化ndlll 限制酶識別序列（AAGCTT)作為接頭序列，在存在于3'末端的ecc0002基因的翻譯起始位 點（ATG)的3'側(cè)導(dǎo)入Blnl限制酶識別序列（CCTAGG)作為接頭序列，制備編碼ecc0002基 因的表達(dá)控制區(qū)域的DM(圖3)(序列號5)。
[012引 對上述DNA的序列，利用公知的啟動子分析工具炬ioln化rmaticsandMolecular AnalysisSection(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)進(jìn)行分析，結(jié)果 在序列號5中的第875?1125位的堿基區(qū)域被推斷為作為啟動子發(fā)揮功能的區(qū)域。
[0123](實施例3)目-葡萄糖酵酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0124] 構(gòu)建基因表達(dá)載體，該基因表達(dá)載體相連地包含實施例2中得到的編碼基因表達(dá) 控制區(qū)域的DNA與編碼目-葡萄糖酵酸酶（GU巧基因的化dAcDNA。對于該基因表達(dá)載體， 使用植物轉(zhuǎn)化用載體（PBII221)。在編碼基因表達(dá)控制區(qū)域的DNA與化dAcDNA連接時，使 存在于化dAcDNA的5'末端側(cè)的編碼第一蛋氨酸的ATG序列與存在于編碼基因表達(dá)控制區(qū) 域的DNA的3'末端側(cè)的ecc0002基因的編碼第一蛋氨酸的ATG序列一致地連接（翻譯融 合型）。將該基因表達(dá)載體的示意圖示于圖5。
[012引（實施例4)GUS表達(dá)基因重組植物的制作
[0126] 使用農(nóng)桿菌屬法將實施例3中制備的基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主植物體（Saccharum spp.CV.NiF8)中，制作利用ecc0002基因的表達(dá)控制DM來控制GUS基因的表達(dá)的基因重 組甘藏。
[0127] 從該基因重組甘藏的成熟葉、幼葉、莖髓、莖皮、根W及分生組織提取純化總RNA， 根據(jù)常規(guī)方法制備cDNA,通過使用了AB口500實時PCR裝置（AppliedBiosystems)的 SYBRGreen法對各組織中的GUS基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。
[012引作為比較，與上述同樣地對非基因重組甘藏的分生組織（對照），W及來源于利用 花挪菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動子來控制GUS基因的表達(dá)的基因重組甘藏的成熟葉和幼葉 中的GUS基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。
[0129] 將結(jié)果示于圖6。各組織的表達(dá)量表示分析的組織中最高的表達(dá)，W將利用 ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制GUS基因的表達(dá)的基因重組甘藏的成熟葉中的GUS基 因的表達(dá)量設(shè)為100 %時的相對值表示。
[0130] 根據(jù)該結(jié)果，可知ecc0002基因的表達(dá)控制DNA在成熟葉中與利用CaMV35S啟動 子控制的GUS基因的表達(dá)量相比為約17倍，能夠特異性誘導(dǎo)基因表達(dá)。
[013。（實施例引稻子Hd3a基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0132] 構(gòu)建基因表達(dá)載體，該基因表達(dá)載體包含彼此連接的實施例2中得到的編碼基因 表達(dá)控制區(qū)域的DNA與編碼稻子Hd3a的cDNA(記載為"Hd3acDNA")。該基因表達(dá)載體使 用植物轉(zhuǎn)化用載體（PIG121-血)。編碼基因表達(dá)控制區(qū)域的DNA與Hd3acDNA連接時，使存 在于Hd3acDNA的5'末端側(cè)的編碼第一蛋氨酸的ATG序列與存在于編碼基因表達(dá)控制區(qū)域 的DNA的3'末端側(cè)的ecc0002基因的編碼第一蛋氨酸的ATG序列一致地連接（翻譯融合 型）。將連接的編碼基因表達(dá)控制區(qū)域的DNA和Hd3acDNA的序列（序列號3)示于圖7。另 夕F，將該基因表達(dá)載體的示意圖示于圖8。
[0133](實施例6)稻子Hd3a表達(dá)基因重組植物的制作
[0134] 使用農(nóng)桿菌屬法將實施例5中制作的基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主植物體（Saccharum spp.CV.NiF8)中，制作利用ecc0002基因的表達(dá)控制DM來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基 因重組甘藏。
[0135] 作為比較，使用野生型W及制作并使用利用CaMV35S啟動子來控制稻子Hd3a基 因的表達(dá)的基因重組甘藏。
[0136] 從各基因重組甘藏的愈合組織、再分化組織W及成熟葉中提取純化總RNA，根據(jù)常 規(guī)方法制備cDNA，通過使用了AB口500 實時PCR裝置（AppliedBiosystems)的SYBRGreen 法對各組織中的稻子Hd3a基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。應(yīng)予說明，"再分化組織"是指對愈合組 織誘導(dǎo)再分化而得到的組織，不表示完全再生的植物的組織或者器官。同樣地分析作為內(nèi) 標(biāo)的肌動蛋白基因的表達(dá)量。
[0137] 將結(jié)果示于圖9。
[0138] 利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基因重組甘藏 的各系統(tǒng)中，被導(dǎo)入的稻子Hd3a基因在再分化后的成熟葉組織中特異性表達(dá)。
[0139] 應(yīng)予說明，對于利用CaMV35S啟動子來控制稻子Hd3a基因的表達(dá)的基因重組甘 藏，在用于使重組愈合組織再分化的再分化培養(yǎng)基置床后，2周左右愈合組織帶有褐變色， 其后全部的重組愈合組織枯死。該表明與稻子、擬南芥等其它植物不同，Hd3a基因在甘藏 的再分化階段給予致命的影響。
[0140](實施例7)稻子Hd3a表達(dá)基因重組植物中的出穗和分葉的誘導(dǎo)能力
[014。 對上述實施例6中制備的稻子Hd3a表達(dá)基因重組體的出穗和分葉的誘導(dǎo)能力進(jìn) 行研究。
[0142] 將結(jié)果示于圖10和11。
[0143] 在稻子Hd3a表達(dá)基因重組體中，確認(rèn)了播種膠芽苗后從約20天左右的早期生長 階段分葉（圖10)，而且在播種膠芽苗后約2個月后確認(rèn)出穗（圖11)。
[0144] 另一方面，在野生株中，播種膠芽苗后到確認(rèn)分葉的時間比稻子Hd3a表達(dá)基因重 組體長（圖10)，另外播種膠芽苗后即使經(jīng)過3個月也看不到出穗（圖11)。
[0145] 根據(jù)該些結(jié)果，確認(rèn)了利用ecc0002基因的表達(dá)控制DNA來控制稻子Hd3a基因的 表達(dá)的基因重組甘藏，具有分葉和出穗的高誘導(dǎo)能力，能夠從分葉莖進(jìn)一步出穗，該樣能夠 在數(shù)月的長時間維持出穗莖。
[0146] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0147] 根據(jù)本發(fā)明，對植物特別是甘藏及甘藏近緣屬種能夠促進(jìn)出穗和/或促進(jìn)分葉。 由此，能夠在不被系統(tǒng)的出穗時期和出穗的能力影響的情況下，有效地進(jìn)行系統(tǒng)間交配，另 夕F，由于能夠縮短植物的代與代的時間，所W能夠顯著提高交配育種的效率。本發(fā)明可期待 對植物特別是甘藏及甘藏近緣屬種的交配育種作出巨大貢獻(xiàn)。
[0148] 將本說明書中引用的全部出版物、專利W及專利申請直接作為參考引入本說明 書。
【權(quán)利要求】
1. 一種DNA，包含選自以下（a)?（d)中的任一種DNA和編碼選自以下（e)?（g)中 的任一種多肽的DNA，具有促進(jìn)植物的成花或出穗的功能和/或促進(jìn)植物的分蘗的功能， (a) 由序列號1所示的堿基序列構(gòu)成的DNA， (b) 由在序列號1所示的堿基序列中缺失、取代、添加或插入了 1個?多個堿基的堿基 序列構(gòu)成，并且具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA， (c) 由與序列號1所示的堿基序列具有90%以上的序列同源性的堿基序列構(gòu)成，并且 具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA， ⑷在嚴(yán)格的條件下與由跟序列號1所示的堿基序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交，并且 具有對成熟葉特異性促進(jìn)基因表達(dá)的活性的DNA ; (e) 由序列號7所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽， (f) 由在序列號7所示的氨基酸序列中缺失、取代、添加或插入了 1個?多個氨基酸的 氨基酸序列構(gòu)成，并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多肽， (g) 由與序列號7所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同源性的氨基酸序列構(gòu)成， 并且具有促進(jìn)成花或出穗的活性的多肽。
2. -種重組載體，包含權(quán)利要求1所述的DNA。
3. -種轉(zhuǎn)化植物，導(dǎo)入了權(quán)利要求1所述的DNA或權(quán)利要求2所述的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化植物，屬于禾本科。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化植物，屬于甘蔗屬、高粱屬或者芒屬。
【文檔編號】C12N15/09GK104395467SQ201280074082
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】西村哲, 鈴木一代, 都筑祥子 申請人:豐田自動車株式會社