用于丁醇生產(chǎn)的基因開關(guān)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于評估用于在發(fā)酵過程的繁殖期和生產(chǎn)期差異性基因表達的各種候選啟動子的合適篩選策略。本發(fā)明還涉及包含經(jīng)鑒定的啟動子核酸序列的重組宿主細胞和使用所述重組宿主細胞來生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
【專利說明】用于丁醇生產(chǎn)的基因開關(guān)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及工業(yè)微生物和醇生產(chǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明的實施例涉及鑒定微生物中適用于 在繁殖期和生產(chǎn)期期間差異調(diào)控基因表達以經(jīng)由工程化的途徑實現(xiàn)低級烷基醇生產(chǎn)的啟 動子。
[0002] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0003] 本申請根據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求提交于2011年12月30日且其全文以引用方 式并入本文的美國臨時專利申請61/581，888的優(yōu)先權(quán)。
[0004] 經(jīng)由Efs-ffeb以電子方式提奪的序列表的引用
[0005] 以電子方式遞交的序列表的內(nèi)容（名稱：20121228_CL5192USNP_SEQLIST_final_ ST25.txt ;大小：1,882,796字節(jié)；創(chuàng)建日期：2012年12月28日）隨同此文件提交，其全文 以引用方式并入本文。

【背景技術(shù)】
[0006] 丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)品，作為燃料添加劑、在塑料工業(yè)中作為化學(xué)原料、以及在 食品和風(fēng)味劑工業(yè)中作為食品級的提取劑是有用的。每年有100至120億磅的丁醇通過石 油化學(xué)方法而生產(chǎn)，并且對這種日用化學(xué)品的需求未來將很可能增加。
[0007] 化學(xué)合成的異丁醇方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳的催化氫化（Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第 6 版，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH 和 Co.， Weinheim，Germany,第5卷，第716-719頁）、以及甲醇與正丙醇的格爾伯特縮合（Carlini 等人，J.Molec. Catal. A :Chem. 220 :215-220,2004)。這些工藝利用來源于石油化學(xué)產(chǎn)品的 起始材料并通常昂貴，并且對環(huán)境不友好。用植物來源的原材料生產(chǎn)異丁醇將會使溫室氣 體排放達到最低程度并將代表本領(lǐng)域的進步。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本文提供了生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。在多個實施例中，所述方法包括:A)將包含異 源多核苷酸的重組宿主細胞與碳底物在第一組條件下接觸，所述異源多核苷酸包含i)啟 動子核酸序列；和ii)編碼生物催化劑多肽的核酸序列；以及（B)將所述重組宿主細胞與 碳底物在第二組條件下接觸；其中所述第一組條件和所述第二組條件不同，并且其中與在 所述第二組條件下相比，所述編碼生物催化劑多肽的核酸序列在所述第一組條件下是差異 表達的。在多個實施例中，所述宿主細胞在所述第一組條件或所述第二組條件中的至少一 個條件下產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，諸如丁醇或2- 丁酮。
[0009] 在多個實施例中，所述第一組條件和所述第二組條件不同在于碳底物源、溶解氧 濃度、溫度、pH、葡萄糖濃度或發(fā)酵產(chǎn)物濃度（諸如丁醇或2-丁酮濃度）中的至少一個。 在多個實施例中，在所述第一組條件期間的溶解氧濃度比在第二組條件期間的溶解氧濃度 大。在多個實施例中，一組條件是厭氧的。在多個實施例中，所述第二組條件是厭氧的。在 多個實施例中，在所述第一組條件期間的平均葡萄糖濃度比在所述第二組條件期間的平均 葡萄糖濃度低。在多個實施例中，在所述第一組條件下的平均葡萄糖濃度比在所述第二組 條件下的平均葡萄糖濃度低至少約5倍、比在所述第二組條件下的平均葡萄糖濃度低至少 約50倍、比在所述第二組條件下的平均葡萄糖濃度低至少約100倍、或比在所述第二組條 件下的平均葡萄糖濃度低至少約1000倍。在多個實施例中，在所述第一組條件下的丁醇產(chǎn) 率比在所述第二組條件下的丁醇產(chǎn)率低。
[0010] 在多個實施例中，所述第一組條件所用的碳底物源不同于所述第二組條件的。在 多個實施例中，所述第一組條件所用的碳底物源是糖蜜。在多個實施例中，所述第二組條件 所用的碳底物源是玉米醪。
[0011] 因此，本文提供了包含i)啟動子核酸序列；和ii)編碼生物催化劑多肽的核酸序 列的異源多核苷酸，可用于本發(fā)明所公開的方法。
[0012] 在多個實施例中，本文提供的分離的多核苷酸包含：(a)啟動子核酸序列；和（b) 編碼生物催化劑多肽的核酸序列；其中將（b)的核酸序列可操作地結(jié)合至（a)的核酸序列， 使得所述生物催化劑多肽在發(fā)酵過程的生產(chǎn)期和繁殖期差異表達。在多個實施例中，在發(fā) 酵的生產(chǎn)期所述生物催化劑多肽的表達比繁殖期高。在多個實施例中，所述生物催化劑多 肽催化在丁醇或2- 丁酮生物合成途徑中的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在多個實施例中，所述生 物催化劑多肽選自具有下列酶學(xué)委員會編號的酶：EC 2. 2. 1. 6、EC 1. 1. 1. 86、EC 4. 2. 1. 9、 EC 4. 1.1. 72、EC 1.1. 1.1、EC 1.1. 1.265、EC 1.1. 1.2、EC 1.2. 4. 4、EC 1.3.99.2、 EC 1.2. 1.57、EC 1.2. 1.10、EC 2. 6. 1.66、EC 2. 6. 1.42、EC 1.4. 1.9、EC 1.4. 1.8、 EC 4. 1.1. 14、EC 2. 6. 1.18、EC 2. 3. 1.9、EC 2. 3. 1.16、EC 1.1. 130、EC 1.1. 1.35、EC 1.1. 1.157、EC 1.1. 136、EC 4. 2. 1.17、EC 4. 2. 1.55、EC 1.3. 1.44、EC 1.3. 1.38、EC 1. 3. 1. 44、EC 1. 3. 1. 38、EC 5. 4. 99. 13、EC 4. 1. 1. 5、EC 1. 1. 1. 1、2. 7. 1. 29、1. 1. 1. 76、 1. 2. 1. 57、以及4. 2. 1. 28。在多個實施例中，所述生物催化劑多肽催化異丁醇生物合成途 徑中的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在多個實施例中，所述生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶、乙酰羥 酸異構(gòu)還原酶、乙酰羥酸脫水酶、支鏈a -酮酸脫羧酶、支鏈醇脫氫酶、支鏈酮酸脫氫酶、丁 酰-CoA脫氫酶、丁醛脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、纈氨酸脫氫酶、纈氨酸脫羧酶、轉(zhuǎn)氨酶、乙酰-CoA 乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-羥丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫酶、異丁酰-CoA變位酶、乙酰 乳酸脫羧酶、乙偶姻胺化酶（acetonin aminase)、丁醇脫氫酶、丁醛脫氫酶、乙偶姻激酶、乙 偶姻磷酸胺化酶、氨基丁醇磷酸磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇脫氫酶、或丁二醇脫水酶。 在多個實施例中，所述生物催化劑多肽是參與耐酸性的、GPI-錨定的細胞壁蛋白。在多個 實施例中，所述生物催化劑多肽是Sedl蛋白或Spil蛋白或其同源物。根據(jù)權(quán)利要求28、 29或31所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是參與耐酸性的、GPI-錨定的 細胞壁蛋白。在多個實施例中，所述生物催化劑多肽包含與SEQ ID N0:397、399、401、403、 405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433或435至少90%的同 一性。
[0013] 在多個實施例中，生物催化劑多肽可以是生物合成途徑多肽、細胞完整性多肽、繁 殖多肽、甘油生物合成途徑多肽、產(chǎn)生副產(chǎn)物的多肽、或生成NADPH的多肽。在多個實施例 中，所述生物催化劑多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在多個實施例中，所 述生物催化劑多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，并且包含與SEQ ID N0 :1 或其變體或活性片段至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一 性。
[0014] 在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :170、171、172、175、176、 177、186、186、188、189、190、191、192、193、194、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、 223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257 或 258 或其活性 片段至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟 動子核酸序列包含與 SEQ ID N0 :268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、 280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、 299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、 318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、 337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、 356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、 375、376、377、378、379、380、381、382或383或其活性片段至少約90%、至少約95%、至少約 99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :775、776、 777或778或其活性片段至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多 個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段至少約90%、至少 約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :686至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所 述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :384、360、386或331或它們的活性片段至少約90%、 至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與 SEQ ID NO :772或773或它們的活性片段至少約90%、至少約95%、至少約99%或100% 的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段至 少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸 序列包含與SEQ ID N0 :168、169、388或173或它們的活性片段至少約90%、至少約95%、 至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0: 768或769至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所 述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段至少約90%、至少約95%、至少約 99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :711或 其活性片段至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所 述啟動子核酸序列包含與 SEQ ID N0 :140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150或 151或其片段至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。
[0015] 在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :140、141、142、143、144、 145、146、147、148、149、150或151或其片段至少約90%或至少約95%的同一性。在多個實 施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :168、169、170、171、172、173、174、175、176 或177或其片段至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%的同一性。
[0016] 在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :168、169、170、171、172、 173、174、175、176或177或其片段至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%，并 且其中所述生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶或酮醇酸還原異構(gòu)酶。在多個實施例中，所述 乙酰乳酸合酶與SEQ ID NO :1或其變體或其活性片段具有至少約80%、至少約85%、至少 約90%、至少約95%、至少約99%或100%的同一性。在多個實施例中，所述乙酰乳酸合酶 是枯草芽孢桿菌（B. subtilis)AlsS或其變體或其活性片段。
[0017] 在多個實施例中，發(fā)酵繁殖期中所述生物催化劑多肽的表達比發(fā)酵生產(chǎn)期中所述 生物催化劑多肽的表達高。在多個實施例中，所述生物催化劑多肽是生物合成途徑多肽或 細胞完整性多肽。在一些實施例中，所述生物催化劑多肽是繁殖多肽、異丁醇途徑副產(chǎn)物 多肽、甘油生物合成途徑或NADPH生成途徑的多肽。在一些實施例中，所述生物催化劑多 肽是磷酸酮醇酶。在一些實施例中，所述磷酸酮醇酶來源于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)。在一些實施例中，所述生物催化劑多肽是磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶。在一些實施例中， 所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶來源于植物乳桿菌。在一些實施例中，生物催化劑多肽是乙酰乳酸還原 酶。在一些實施例中，所述乙酰乳酸還原酶是YMR226C。在一些實施例中，所述生物催化劑 多肽是醛脫氫酶。在一些實施例中，所述生物催化劑多肽是ALD6。在一些實施例中，所述 生物催化劑多肽是氧化戊糖磷酸途徑的酶。在一些實施例中，所述生物催化劑多肽是葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶或6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶。在多個實施例中， 所述生物催化劑多肽是甘油-3-磷酸脫氫酶。在多個實施例中，所述啟動子核酸序列包含 與 SEQ ID N0 :152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162 或 163 或其片段至少約 90 %或至少約95%的同一性。
[0018] 在多個實施例中，所述編碼生物催化劑多肽的核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以在特定宿 主細胞中表達。
[0019] 本文還公開了包含本發(fā)明所公開的分離的多核苷酸的重組宿主細胞。在多個實施 例中，所述宿主細胞是細菌、藍細菌、絲狀真菌或酵母細胞。在多個實施例中，所述宿主細胞 是細菌或藍細菌細胞。在多個實施例中，所述宿主細胞的屬是沙門氏菌屬（Salmonella)、 節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、短桿菌屬（Brevibacterium)、梭 菌屬（Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、葡糖桿菌屬（Gluconobacter)、 諾卡氏菌屬（Nocardia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、紅球菌屬（Rhodococcus)、鏈霉 菌屬（Streptomyces)、發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas)、埃希氏菌屬（Escherichia)、乳桿 菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、腸球菌屬（Enterococcus)、產(chǎn)喊菌 屬（Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus)或黃 單胞菌屬（Xanthomonas)。在多個實施例中，所述宿主細胞是絲狀真菌或酵母細胞。在 多個實施例中，所述宿主細胞的屬是酵母屬（Saccharomyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、 漢遜酵母屬（Hansenula)、耶氏酵母屬（Yarrowia)、曲霉屬（Aspergillus)、克魯維酵 母屬（Kluyveromyces)、管囊酵母屬（Pachysolen)、紅酵母屬（Rhodotorula)、接合 酵母屬（Zygosaccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、有抱圓酵母屬 (Torulaspora)、德巴利酵母屬（Debayomyces)、擬威爾酵母屬（Williopsis)、德克酵母 屬（Dekkera)、克勒克酵母屬（Kloeckera)、梅奇酵母屬（Metschnikowia)、伊薩酵母屬 (Issatchenkia)或假絲酵母屬（Candida)。在多個實施例中，所述宿主細胞是釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。在多個實施例中，所述宿主細胞包含降低或消除的內(nèi)源丙 酮酸脫羧酶的表達。在多個實施例中，降低或消除的脫羧酶的表達是由基因缺失、破壞、或 突變引起的。在多個實施例中，所述破壞或缺失的基因是H)C1、PDC5、H)C6、或它們的組合。 在一些實施例中，所述宿主細胞包含降低或消除的內(nèi)源酶的表達，所述內(nèi)源酶具有醛脫氫 酶活性、甘油-3-磷酸脫氫酶活性、乙酰乳酸還原酶活性、或影響Fe-S簇生物合成的多肽。 在一些實施例中，降低或消除的內(nèi)源酶的表達是由基因缺失、破壞、或突變引起的，所述內(nèi) 源酶具有醛脫氫酶活性、甘油-3-磷酸脫氫酶活性、乙酰乳酸還原酶活性、或影響Fe-S簇生 物合成的多肽。
[0020] 前提條件是重組酵母宿主細胞包含異丁醇生物合成途徑和至少一個經(jīng)修飾的表 達構(gòu)建體，所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體在如下條件下差異表達多肽，在該條件中，生物質(zhì)的繁 殖傾向于超過異丁醇的產(chǎn)量，由此在所述條件下異丁醇產(chǎn)量與相同條件下不含所述表達構(gòu) 建體的宿主細胞相比是基本上減少的。在多個實施例中，所述表達構(gòu)建體包含SEQ ID N0: 711。在多個實施例中，所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽能夠 催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在多個實施例中，所述編碼多肽的多核苷酸 包含與SEQ ID N0 :2至少約85%、至少約90%、至少約95%或100%的同一性，所述多肽能 夠催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在多個實施例中，所述能夠催化丙酮酸至 乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽包含與SEQ ID N0 :1至少約85%、至少約90%、至少 約95%或100%的同一性。在多個實施例中，所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體包含與SEQ ID N0: 790至少約85%、至少約90%、至少約95%或100%的同一性。在多個實施例中，所述酵母 宿主細胞是釀酒酵母。
[0021] 本文還公開了用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括：（a)提供本發(fā)明所公開的重組 宿主細胞；(b)使所述宿主細胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中的可發(fā)酵碳底物在由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條 件下接觸；以及（c)任選地，回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
[0022] 在多個實施例中，所述方法還包括在由此宿主細胞的繁殖先于（b)的接觸的條件 下使所述宿主細胞繁殖。在多個實施例中，由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件是厭氧的。在多個實 施例中，由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件是微氧的。在多個實施例中，所述發(fā)酵產(chǎn)物選自：丁醇、 2_ 丁酮、丙醇、異丙醇和乙醇。在多個實施例中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是丁醇或2-丁酮。在多個 實施例中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇。在多個實施例中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇，并且所述分 離的多核苷酸包含所述啟動子核酸序列，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0 :168、169、 170、171、172、173、174、175、176或177或其片段至少約90%或至少約95%的同一性，并且 所述生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶或酮醇酸還原異構(gòu)酶。
[0023] 本文還公開了用于篩選在發(fā)酵的生產(chǎn)期優(yōu)先表達的候選啟動子序列的方法，其包 括：
[0024] (a)在繁殖條件下培養(yǎng)微生物；
[0025] (b)從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子；
[0026] (c)在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物；
[0027] (d)從（c)中培養(yǎng)的微生物分離核糖核酸分子；
[0028] (e)僅選擇其表達水平高于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些 分離的核糖核酸分子；以及
[0029] (f)測定與（e)中選擇的核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的啟動子的多核苷酸序列。
[0030] 本文還公開了用于篩選在發(fā)酵的生產(chǎn)期優(yōu)先抑制的候選啟動子序列的方法，其包 括：
[0031] (a)在繁殖條件下培養(yǎng)微生物；
[0032] (b)從（a)中培養(yǎng)的微生物分離核糖核酸分子；
[0033] (c)在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物；
[0034] (d)從（c)中培養(yǎng)的微生物分離核糖核酸分子；
[0035] (e)僅選擇其表達水平低于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些 分離的核糖核酸分子；以及
[0036] (f)測定與（e)中選擇的核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的啟動子的多核苷酸序列。
[0037] 本文還公開了用于篩選在發(fā)酵的繁殖期優(yōu)先抑制的候選啟動子序列的方法，其包 括：
[0038] (a)在繁殖條件下培養(yǎng)微生物；
[0039] (b)從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子；
[0040] (c)在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物；
[0041] (d)從（c)中培養(yǎng)的微生物分離核糖核酸分子；
[0042] (e)僅選擇其表達水平高于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些 分離的核糖核酸分子；以及
[0043] (f)測定與（e)中選擇的核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的啟動子的多核苷酸序列。
[0044] 在多個實施例中，在（b)和（d)中分離的核糖核酸分子是標記的。在多個實施例 中，在（b)和（d)中分離的核糖核酸分子與編碼熒光蛋白的多核苷酸可操作地結(jié)合。在多 個實施例中，所述繁殖條件包括使微生物在包含某一濃度的可發(fā)酵碳底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中 生長，所述生產(chǎn)條件包括使微生物在包含更高濃度的相同可發(fā)酵碳底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生 長。在多個實施例中，所述可發(fā)酵碳底物選自：單糖、寡糖、多糖、以及它們的混合物。在多 個實施例中，所述繁殖條件包括使微生物在包含某一濃度的溶解氧的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長， 所述生產(chǎn)條件包括使微生物在包含更低的溶解氧濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長。在多個實施例 中，更低濃度的溶解氧是小于約3%。
[0045] 在其它實施例中生長和生產(chǎn)解耦不是產(chǎn)生自差異表達，而是產(chǎn)生自通過加入或刪 除另一種組分改變了條件或細胞途徑、蛋白、或其它組分的活性。所述其它組分的加入、刪 除或發(fā)揮作用可與差異表達結(jié)合，或可引起不依賴差異表達的控制生長和/或生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1描述了繁殖罐中細胞生長情況和葡萄糖消耗。0D (生物質(zhì)）被圖解作為發(fā)酵 時間的函數(shù)。
[0047] 圖2描述了在26和37小時處合成異丁醇，并且在細胞培養(yǎng)50小時的時候異丁醇 積聚停止。
[0048] 圖3描述了隨發(fā)酵時間的異丁醇產(chǎn)生速率（g/L/小時）。
[0049] 圖4描述了隨發(fā)酵時間的二氧化碳釋放速率（carbon dioxide evolution rate)。
[0050] 圖5描述了隨發(fā)酵時間的氧氣消耗。
[0051] 圖6描述了菌株P(guān)NY1556的染色體XII中遺傳因子的圖譜，顯示了驅(qū)動alsS的表 達的FBA1啟動子以及上游緊接的roci終止子。
[0052] 圖7描述了一種酵母-大腸桿菌（E.coli)穿梭載體PBP2092,其攜帶了帶有用于 在酵母中表達的調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因KARI和DHAD。
[0053] 圖8描述了不同的異丁醇生物合成途徑。標記為"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、"f"、 "8"、"}1"、"1"、"」"、和"1^的步驟表示下述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的底物。" &"可被例如乙酰乳酸合酶催 化。"b"可被例如乙酰羥基酸異構(gòu)還原酶催化。"c"可被例如乙酰羥基酸脫水酶催化。"d" 可被例如支鏈酮酸脫羧酶催化。"e"可被例如支鏈醇脫氫酶催化。"f"可被例如支鏈酮酸 脫氫酶催化。"g"可被例如乙?；┟摎涿复呋?。"h"可被例如轉(zhuǎn)氨酶或纈氨酸催化。"i" 可被例如纈氨酸脫羧酶催化。"j"可被例如轉(zhuǎn)氨酶催化。
[0054] 圖9顯示了用葡萄糖在釀酒酵母菌株P(guān)NY2289中導(dǎo)入alsS轉(zhuǎn)錄物。
[0055] 圖10顯示了加入3%的葡萄糖對啟動子-綠色熒光蛋白（GFP)融合的效應(yīng)，如實 例9中所述。

【具體實施方式】
[0056] 本發(fā)明涉及重組宿主細胞以及使用相同的重組宿主細胞的方法，所述重組宿主細 胞生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物并且包含啟動子序列，所述啟動子序列提供了在過程的繁殖期相對生產(chǎn)期 的差異表達。
[0057] 使用酵母的工業(yè)發(fā)酵工藝可采用生物質(zhì)生產(chǎn)的階段以為所述發(fā)酵階段提供足夠 的生物催化劑，以具有期望的收率和產(chǎn)生速率。產(chǎn)乙醇生物例如釀酒酵母通常使用分批補 料技術(shù)繁殖，其中低糖濃度和非限制性透氣利于高生物質(zhì)收率的呼吸代謝，例如Yxs?0. 5 克生物質(zhì)/克葡萄糖。在分批補料體系中低糖濃度的維持對于Crabtree陽性（酵解抑制 有氧氧化）酵母類似的釀酒酵母是尤其重要的，在這些酵母中呼吸代謝占總體代謝的級份 與增加的細胞外葡萄糖濃度負相關(guān)。由于所述低糖濃度，限制了比葡萄糖攝取速率并且呼 吸容量足以完全代謝在碳水化合物底物至C02的分解代謝中形成的丙酮酸。在無氧的，或 者在有氧條件下高葡萄糖濃度同時Crabtree效應(yīng)（酵解抑制有氧氧化）起作用的發(fā)酵條 件下，酵母類似的產(chǎn)乙醇生物例如釀酒酵母產(chǎn)生乙醇并且只獲得低生物質(zhì)收率，例如Yxs? 0. 15克生物質(zhì)/克葡萄糖。
[0058] 產(chǎn)生低級烷基醇類的生物催化劑（諸如產(chǎn)丁醇的生物催化劑）的繁殖的注意事項 包括（i)毒性產(chǎn)物諸如丁醇或2-丁酮的負面效應(yīng)，（ii)抑制途徑副產(chǎn)物或中間體的積聚， 以及（iii)底物形成發(fā)酵副產(chǎn)物的損耗導(dǎo)致更低的生物催化劑收率和發(fā)酵產(chǎn)物形成。例 如，當(dāng)酵母中丁醇生產(chǎn)途徑組成型起作用時，然后生產(chǎn)的丁醇可在生產(chǎn)過程的繁殖期抑制 生長，并且可對所述生物催化劑生產(chǎn)期的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和操作的任一者或兩者增加成本和低效 率。對照，具體地講在所述生物質(zhì)形成階段丁醇生產(chǎn)的減少或消除，會代表本領(lǐng)域的進展。
[0059] 申請者通過鑒定在不同條件下提供所關(guān)注的基因的差異表達的多個啟動子核酸 序列已經(jīng)解決了所述問題，從而提供了在生物催化劑繁殖期和發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)期差異表達的 策略。本文還提供了合適的篩選策略以鑒定和評價候選在生物催化劑繁殖期和發(fā)酵產(chǎn)物生 產(chǎn)期控制基因的差異表達的核酸序列。此外，提供了包含來源于多于一個啟動子區(qū)的核酸 序列的雜交體序列。本文所述核酸序列可被用作啟動子表達與繁殖或生產(chǎn)相關(guān)的多個多 肽，在下文中有時被稱為"基因開關(guān)"。本文所公開的序列和方法由此允許（i)生物催化劑 多肽，諸如催化生物合成途徑（諸如丁醇或2-丁酮生物合成途徑）中底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的 多肽，在發(fā)酵的生產(chǎn)期差異表達，（ii)有利于細胞完整性的生物催化劑多肽在發(fā)酵的生產(chǎn) 期差異表達，（iii)生物催化劑多肽諸如繁殖多肽在生物催化劑繁殖期差異表達，（iv)生 物催化劑多肽作為NADPH生成途徑的一部分在繁殖期差異表達，或（V)多肽作為丁醇以外 的NADH消耗產(chǎn)物途徑的一部分在發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)期差異表達，或它們的組合。申請者還提供 了重組宿主細胞和使用相同的重組宿主細胞生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述重組宿主細胞利用 了包含經(jīng)鑒定的啟動子的重組多核苷酸序列。
[0060] 在多個實施例中，本文所述的重組宿主細胞從植物來源的碳源生產(chǎn)丁醇或2- 丁 酮。因此，本文所提供的是使用重組宿主細胞生產(chǎn)丁醇或2-丁酮的方法，所述重組宿主細 胞包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含在發(fā)酵過程的和生產(chǎn)期差異性調(diào)控相關(guān) 基因表達的啟動子核酸序列。在一個實施例中，催化丁醇生物合成途徑第一步的多肽能在 生產(chǎn)期優(yōu)先表達。在一個實施例中，催化異丁醇生物合成途徑中底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽 能在生產(chǎn)期優(yōu)先表達。在一個實施例中，乙酰乳酸合酶能在生產(chǎn)期優(yōu)先表達。在一個實施 例中，酮醇酸還原異構(gòu)酶能在生產(chǎn)期優(yōu)先表達。在一個實施例中，二羥酸脫水酶能在生產(chǎn)繁 殖期優(yōu)先表達。
[0061] 除非另行定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員通常理解的一樣。如發(fā)生矛盾，以本申請（包括其定義）為準。此外，除非上下文另 有所需，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。為所有目的，所有的出版物、專利、 以及本文提及的其它參考資料均全文以引用方式并入本文。
[0062] 如本文所用，術(shù)語"包含"、"包括"、"具有"、"含有或它們的任何其它變型"將被理解 為是指包括指定的整數(shù)或整數(shù)組但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。例如，包括沒有明確列 出的或僅為那些要素固有的要素列表的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備，還可以包 括其它未明確列出的要素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備固有的要素。此 夕卜，除非明確指明相反，"或"是指包含性的"或"而不是指排他性的"或"。例如，以下中任 一者均滿足條件A或B :A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不 存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。
[0063] 此外，涉及元素或組分實例（即出現(xiàn)）的數(shù)目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞 "一個"或"一種"旨在為非限制性的。因此，應(yīng)將"一個"或"一種"理解為包括一個或至少 一個，并且元素或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。
[0064] 如本文所用，術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"為非限制性術(shù)語，并且不旨在意指本發(fā)明的 任何單獨實施例，而是涵蓋如申請所述的所有可能的實施例。
[0065] 如本文所用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語"約"是指可以通過例如 以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化：在真實世界中用于產(chǎn)生濃縮物或溶液的一般測 量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的 制造、來源或純度中的差異；等。術(shù)語"約"還包括由于產(chǎn)生自特定起始混合物的組合物的 不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語"約"來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。在 一個實施例中，術(shù)語"約"指在報告數(shù)值的10%范圍內(nèi)，或者在報告數(shù)值的5%范圍內(nèi)。 [0066] 術(shù)語"生長期"或"繁殖期"是指其中產(chǎn)生酵母生物質(zhì)并且出現(xiàn)種菌積累的工藝步 驟。
[0067] 術(shù)語"生產(chǎn)期"是指其中出現(xiàn)所需發(fā)酵產(chǎn)物包括但不限于丁醇、異丁醇、1-丁醇、 2_ 丁醇和/或2- 丁酮產(chǎn)物的發(fā)酵工藝步驟。
[0068] 在一些情況下，如本文使用的"生物質(zhì)"是指產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的微生物的細胞生物 質(zhì)，通常提供為單位克/升干細胞重（dew)。
[0069] 術(shù)語"發(fā)酵產(chǎn)物"包括任何所關(guān)注的所需產(chǎn)物，包括低級烷基醇類，包括但不限于 丁醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸、衣康酸、1，3-丙 二醇、乙烯、甘油、異丁酸等。
[0070] 術(shù)語"低級烷基醇"指任何直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的、具有1-10個碳原子的 醇分子。
[0071] 術(shù)語"丁醇"是指1-丁醇、2-丁醇、異丁醇或它們的混合物。異丁醇也被稱為2-甲 基-1-丙醇。
[0072] 如本文所用，術(shù)語"丁醇生物合成途徑"是指產(chǎn)生1-丁醇、2-丁醇或異丁醇的酶途 徑。例如，在美國專利7, 851，188中公開的異丁醇生物合成途徑，該文獻以引用方式并入本 文。所述途徑的組分由途徑中所有底物、輔助因子、副產(chǎn)物、中間體、終端產(chǎn)物和酶類組成。
[0073] 如本文所用術(shù)語"2-丁酮生物合成途徑"是指用于產(chǎn)生2-丁酮的酶途徑。
[0074] 術(shù)語"繁殖多肽"包括與生物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的多肽，以及與生物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián) 的酶的性能相關(guān)聯(lián)的多肽。
[0075] 術(shù)語"生物催化劑多肽"包括與指明的生物合成途徑（例如丁醇或2- 丁酮生物合 成途徑）的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化相關(guān)聯(lián)的多肽，以及與指明的生物合成途徑相關(guān)聯(lián)的生物催 化劑的繁殖或性能相關(guān)聯(lián)的多肽，包括但不限于細胞完整性多肽和繁殖多肽。例如，NADPH 生成途徑的一部分的多肽或非丁醇NADH消耗產(chǎn)物途徑的部分的多肽可以是生物催化劑多 肽。
[0076] 術(shù)語"生物合成途徑多肽"包括催化列舉的生物合成途徑的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的 多肽。
[0077] 術(shù)語"細胞完整性多肽"包括參與細胞完整性的多肽，包括構(gòu)成細胞構(gòu)造所需的多 肽。
[0078] "重組微生物宿主細胞"被定義為經(jīng)過遺傳學(xué)操作的宿主細胞。在多個實施例中， 重組微生物宿主細胞經(jīng)過遺傳學(xué)操作以表達生物合成產(chǎn)物途徑，其中所述宿主細胞產(chǎn)生生 物合成產(chǎn)物量高于未經(jīng)修飾的宿主細胞或產(chǎn)生未經(jīng)修飾的宿主細胞通常不產(chǎn)生的生物合 成產(chǎn)物。
[0079] 術(shù)語"可發(fā)酵碳底物"是指能被微生物代謝的碳源，所述微生物諸如本文所公開的 那些。合適的可發(fā)酵碳底物包括但不限于單糖，諸如葡萄糖或果糖；二糖如乳糖或蔗糖；寡 糖；多糖，諸如淀粉、纖維素或木質(zhì)纖維素、半纖維素；一碳底物，脂肪酸；以及這些物質(zhì)的 組合。
[0080] 如本文所用，"發(fā)酵培養(yǎng)基"是指水、糖（可發(fā)酵碳底物）、液化固體、微生物產(chǎn)生的 發(fā)酵產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物及發(fā)酵容器內(nèi)具有的所有其它物質(zhì)組分的混合物，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物 是通過在微生物存在的情況下使可發(fā)酵碳底物反應(yīng)生成發(fā)酵產(chǎn)物、水和二氧化碳（co2)而 制得。有時，如本文所用，術(shù)語"發(fā)酵液（fermentation broth)"和"發(fā)酵混合物"可與"發(fā) 酵培養(yǎng)基（fermentation medium)"同義使用。
[0081] 如本文所用術(shù)語"有氧條件"是指有氧氣存在下的生長條件。
[0082] 如本文所用術(shù)語"微氧條件"是指具有低水平溶解氧的生長條件。例如，氧氣水平 可為小于約1%的空氣飽和度。
[0083] 如本文所用術(shù)語"厭氧條件"是指不存在氧氣時的生長條件。應(yīng)當(dāng)理解在許多發(fā) 酵工藝中氧氣的初始量存在于過程的開始，但是此類氧氣經(jīng)過發(fā)酵過程被耗盡使得過程大 部分發(fā)生在不存在可檢測的氧氣的情況下。
[0084] 如本文所用，術(shù)語"收率"指以g/g表示的產(chǎn)物量/碳源量。可將收率例示為用葡 萄糖作為碳源。應(yīng)當(dāng)理解，除非另外指明，將收率表達為理論收率的百分比。對于微生物或 代謝途徑，將"理論收率"定義為每個底物總量能夠產(chǎn)生的產(chǎn)物最大量，所述最大量通過化 學(xué)計量用于生產(chǎn)所述產(chǎn)物的代謝途徑獲得。例如，一種典型的葡萄糖至異丙醇的轉(zhuǎn)化的理 論收率是〇. 33 y g。同樣地，從29. 7g/g的葡萄糖中產(chǎn)生的異丙醇的收率將被表達為90% 的理論收率或90%的理論收率。應(yīng)當(dāng)理解，雖然在本公開中將收率例示為用葡萄糖作為碳 源，本發(fā)明能夠應(yīng)用于其它碳源并且所述收率可能取決于使用的碳源而變化。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員能夠計算不同碳源的收率。
[0085] 術(shù)語"乙酰羥酸合酶"、"乙酰乳酸合酶"和"乙酰乳酸合成酶"（本文縮寫為"ALS"、 "AlsS"、"alsS"和/或"AHAS"）本文互換使用，指催化丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸和C02的 酶。已知乙醜乳酸合酶的例子為EC編號2. 2. 1.6 (Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press, San Diego)。這些酶可得自多種來源，包括但不限于：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)(GenBank N〇:CAB07802.1(SEQ ID N0:1)，Z99122(SEQ ID N0:2)，分別是 NCBI (National Center for Biotechnology Information，國家生物技術(shù)信息中心）氨 基酸序列、NCBI核苷酸序列），CAB15618(SEQ ID NO :789)，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) (GenBank No :AAA25079(SEQ ID NO :3)、M73842(SEQ ID NO :4))，以及乳酸乳 球菌（Lactococcus lactis)(GenBank No:AAA25161(SEQ ID N0:5)、L16975(SEQ ID NO: 6))。
[0086] 術(shù)語"酮醇酸還原異構(gòu)酶"（"KARI"）、和"乙酰羥酸異構(gòu)還原酶"將被可互換 地使用，并且是指能夠催化（S)-乙酰乳酸至2,3_二羥基異戊酸的反應(yīng)的酶。KARI酶 的例子可歸類為 EC 編號 EC 1. 1. 1. 86(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press， San Diego),并且購自多種微生物，包括但不限于大腸桿菌（Escherichia coli) (GenBank No :NP_418222(SEQ ID NO :7)、NC_000913(SEQ ID NO :8))，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)(GenBank No ：NP_013459(SEQ ID NO ：9), NC_001144(SEQ ID NO： 10)), 海沼甲燒球菌（Methanococcus maripaludis)(GenBank No :CAF30210(SEQ ID NO: 11)、BX957220(SEQ ID NO :12))，和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)(GenBank No :CAB14789(SEQ ID NO :13)、Z99118(SEQ ID NO :14))。KARI 包括糞厭氧棒狀菌 (八仙61'08^口68。3(^36)1^1?1變體"1(969，'、"1(9〇 3，'和"1(9邛4?，'（分別為5￡〇10吣：1 67、 166和791)。在一些實施例中，KARI利用NADH。在一些實施例中，KARI利用NADPH。
[0087] 術(shù)語"乙酰羥酸脫水酶"和"二羥基酸脫水酶"（"DHAD"）是指催化2, 3-二羥基異 戊酸轉(zhuǎn)化成a-酮異戊酸的酶。乙酰羥酸脫水酶的例子已知其EC編號為EC 4.2. 1.9。此 類酶可得自多種微生物，包括但不限于大腸桿菌（E. coli) (GenBank No :YP_026248(SEQ ID 勵：15)、從：_000913(5￡〇10勵：16))、釀酒酵母（66118&1^吣：即_012550(5￡〇10勵 ：17)、 NC 001142(SEQ ID NO :18))，海沼甲烷球菌（M.maripaludis) (GenBank NO :CAF29874(SEQ ID NO :19)、BX95721920))、枯草芽孢桿菌（B. subtilis) (GenBank NO :CAB14105(SEQ ID NO :21)、Z99115(SEQ ID NO :22))，乳酸乳球菌（L. lactis)、粗糙脈孢菌（N. crassa)以及變 異鏈球菌（S. mutans)。DHAD包括變異鏈球菌變體"12V5"（SEQ ID NO :792)。
[0088] 術(shù)語"支鏈a _酮酸脫羧酶"、或" a _酮酸脫羧酶"、或" a _酮異戊酸脫羧酶"、或 "2-酮異戊酸脫羧酶"（"KIVD"）是指催化a -酮異戊酸轉(zhuǎn)化成異丁醛和C02的酶。已知支 鏈a -酮酸脫羧酶的例子為EC編號4. 1. 1. 72,并且得自許多來源，包括但不限于乳酸乳球 菌（Lactococcus lactis)(GenBank N0:AAS49166(SEQ ID N0:23)、AY548760(SEQ ID N0: 24) ;CAG34226(SEQ ID NO :25)、AJ746364(SEQ ID NO :26)，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)(GenBank N0:NP_461346(SEQ ID N0:27)、NC_003197(SEQ ID N0:28))，丙 酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)(GenBank NO :NP_149189(SEQ ID NO :29)、 NC_001988(SEQ ID NO :30))，解酪微球菌（M. caseolyticus) (SEQ ID NO :165)，以及格雷氏 李斯特菌（L. grayi) (SEQ ID NO :164)。
[0089] 術(shù)語"支鏈醇脫氫酶"（"ADH"）是指催化異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的酶。支鏈醇脫氫 酶的例子是已知EC編號1. 1. 1. 265的酶，但是所述酶也可被歸類為其它醇脫氫酶（具體地 講，EC 1. 1. 1. 1或1. 1. 1. 2)。醇脫氫酶可為NADPH依賴型或NADH依賴型。這些酶可得自多 種來源，包括但不限于釀酒酵母（S.cerevisiae)GenBank N〇:NP_010656(SEQ ID N0:31)、 NC_001136(SEQ ID N0:32) ;NP_014051(SEQ ID N0:33)NC_001145(SEQ ID N0:34))，大腸 桿菌（E. coli) (GenBank NO :NP_417484(SEQ ID NO :35)、NC_000913(SEQ ID NO :36))，丙 酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (GenBank NO :NP_349892(SEQ ID NO :37)、NC_003030(SEQ ID N0:38) ;NP_349891(SEQ ID N0:39)、NC_003030(SEQ ID N0:40))，木糖氧化無色桿菌 (A. xylosoxidans),以及印度拜葉林克菌（B. indica)。
[0090] 術(shù)語"丁醇脫氫酶"是指多肽（或多個多肽），其具有催化異丁醛轉(zhuǎn)化成異丁醇或 催化2- 丁酮和2- 丁醇的轉(zhuǎn)化的酶活性。丁醇脫氫酶是乙醇脫氫酶大家族中的一個子集。 丁醇脫氫酶可為NAD-或NADP-依賴型。NAD-依賴型酶已知為EC 1. 1. 1. 1并且可得自例如 赤紅球菌（Rhodococcus ruber) (GenBank No :CAD36475、AJ491307)。NADP 依賴型酶已知為 EC1. 1. 1. 2 并且可得自例如激烈熱球菌（Pyrococcus furiosus) (GenBank No :AAC25556、 AF013169)。另外，丁醇脫氧酶得自大腸桿菌（Escherichia coli) (GenBank NO :NP 417484、 NC_000913)，環(huán)己醇脫氧酶得自不動桿菌屬（Acinetobacter sp.) (GenBank No :AAG10026、 AF282240)。術(shù)語"丁醇脫氫酶"也指催化丁醛轉(zhuǎn)化成1- 丁醇的酶，其使用NADH或NADPH 作為輔因子。丁醇脫氫酶得自例如丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum) (GenBank NO: NP_149325、NC_001988 ;注釋：這種酶具有醛和醇脫氫酶活性）；NP_349891、NC_003030 ;和 NP_349892、NC_003030)以及大腸桿菌（E. coli) (GenBank NO :NP_417484、NC_000913)。 [0091] 術(shù)語"支鏈酮酸脫氫酶"是指催化a _酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁酰-CoA(異丁酰-輔 酶A)的酶，通常使用NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為電子受體。支鏈酮酸脫氫酶 的例子已知其編號為EC 1.2. 4. 4。此類支鏈酮酸脫氫酶由四個亞基構(gòu)成，并且來自所有 亞基的序列可得自多種微生物，包括但不限于枯草芽孢桿菌（B. subtilis) (GenBank No :CAB14336(SEQ ID NO ：41).Z99116(SEQ ID NO ：42) ；CAB14335(SEQ ID NO ：43).Z99116(SEQ ID N0:44) ;CAB14334(SEQ ID N0:45)、Z99116(SEQ ID N0:46);和 CAB14337(SEQ ID NO :47)、Z99116(SEQ ID NO :48))和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida) (GenBank NO: AAA65614(SEQ ID NO ：49).M57613(SEQ ID NO ：50) ；AAA65615(SEQ ID NO ：51).M57613(SEQ ID N0:52) ;AAA65617(SEQ ID N0:53)、M57613(SEQ ID N0:54);和 AAA65618(SEQ ID NO: 55)、M57613(SEQ ID NO :56))。
[0092] 術(shù)語"?；┟摎涿?指催化異丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成異丁醛的酶，其通常使 用NADH或NADPH作為電子供體。已知?；┟摎涿傅睦訛镋C編號1. 2. 1. 10和 1.2. 1.57。此類酶得自多種來源，包括但不限于拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) (GenBank No :AAD31841 (SEQ ID NO :57)、AF157306(SEQ ID NO :58))，丙酮丁 醇梭菌 (C. acetobutylicum) (GenBank NO ：NP_149325 (SEQ ID NO ：59), NC_001988 (SEQ ID NO： 60) ;NP_149199(SEQ ID N0:61)、NC_001988(SEQ ID 勵：62))，惡臭假單胞菌（卩41^1(1&) (GenBank NO :MA89106 (SEQ ID NO :63)、U13232 (SEQ ID NO :64))、和嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus)(GenBank NO :YP_145486(SEQ ID NO :65)、NC_006461(SEQ ID NO :66))。
[0093] 術(shù)語"轉(zhuǎn)氨酶"指催化a _酮異戊酸轉(zhuǎn)化成L_纈氨酸的酶，其使用丙氨酸或谷 氨酸作為胺供體。轉(zhuǎn)氨酶的例子已知為EC編號2. 6. 1.42和2. 6. 1.66。這些酶可得自多 個來源。依賴丙氨酸的酶的來源例子包括但不限于（大腸桿菌（E.coli) (GenBank N0: YP_026231 (SEQ ID NO :67)、NC_000913(SEQ ID NO :68))和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis) (GenBank NO ：YP_093743 (SEQ ID NO ：69) , NC_006322 (SEQ ID NO： 70))。依賴谷氨酸的酶的來源例子包括但不限于（大腸桿菌（E.coli) (GenBank NO: YP_026247(SEQ ID N0:71)、NC_000913(SEQ ID N0:72))、釀酒酵母（S.cerevisiae) (GenBank N0:NP_012682(SEQ ID N0:73)、NC_001142(SEQ ID N0:74))和嗜熱自養(yǎng)甲烷桿 菌（Methanobacterium thermoautotrophicum)(GenBank N0:NP_276546(SEQ ID N0:75)、 NC_000916(SEQ ID NO :76))。
[0094] 術(shù)語"纈氨酸脫氫酶"指催化a _酮異戊酸轉(zhuǎn)化成L_纈氨酸的酶，其通常使用 NAD(P)H作為電子供體并用氨作為胺供體。纈氨酸脫氫酶的例子已知為EC編號1. 4. 1. 8 和1. 4. 1. 9并且此類酶可得自多個來源，包括但不限于天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor) (GenBank No :NP_628270(SEQ ID NO :77)、NC_003888(SEQ ID NO :78))和枯草 芽孢桿菌（B. subtilis) (GenBank NO :CAB14339(SEQ ID NO :79)、Z99116(SEQ ID NO :80))。 [0095] 術(shù)語"纈氨酸脫羧酶"指催化L-纈氨酸轉(zhuǎn)化成異丁胺和C02的酶。纈氨酸脫羧酶的 例子已知為EC編號4. 1. 1. 14。此類酶存在于鏈霉菌屬（Str印tomyces)中，例如生綠鏈霉 菌（Streptomyces viridifaciens)(GenBank NO :AAN10242(SEQ ID NO :81)、AY116644(SEQ ID NO ：82))〇
[0096] 術(shù)語轉(zhuǎn)氨酶"催化異丁胺轉(zhuǎn)化成異丁醛的酶，其使用合適的氨基酸作為胺供 體。已知《轉(zhuǎn)氨酶的例子為EC編號2. 6. 1.18,并且得自許多來源，包括但不限于反硝化 產(chǎn)堿菌（Alcaligenes denitrificans)(AAP92672(SEQ ID N0:83)、AY330220(SEQ ID N0: 84) ，）、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha)(GenBank N0:YP_294474(SEQ ID NO: 85) 、1'^_007347(3￡(>)10腸：86))，奧奈達希瓦式菌（3116￥3116118〇1161(1611818)(661113已111^ 勵：即_719046(5￡〇10勵：87)、從：_004347(5￡〇10勵：88))，和惡臭假單胞菌（？41^1(1&) (GenBank NO :AAN66223(SEQ ID NO :89)、AE016776(SEQ ID NO :90))。
[0097] 術(shù)語"乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶"是指催化兩分子乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰-CoA和 輔酶A (CoA)的酶。乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶的例子是具有對短鏈?；?CoA和乙酰-CoA的底 物偏好（在正向上反應(yīng)）的乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶，并且該酶歸類為E. C. 2. 3. 1. 9[Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego];但是具有更廣泛底物范圍的酶 (E.C. 2. 3. 1.16)也將具有功能。乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶得自多種來源，例如大腸桿菌 (Escherichia coli) (GenBank No ：NP_416728 (SEQ ID NO ：91), NC_000913 (SEQ ID NO： 92) ;NCBI (National Center for Biotechnology Information，國家生物技術(shù)信息中心） 氨基酸序列，NCBI核苷酸序列）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum) (GenBank NO ：NP_349476. 1 (SEQ ID NO ：93), NC_003030 (SEQ ID NO ：94) ；NP_149242 (SEQ ID NO： 95)、NC_001988 (SEQ ID NO :96)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) (GenBank NO : NP_390297(SEQ ID N0:97)、NC_000964(SEQ ID 勵：98))，和釀酒酵母（5&(^1^1'〇11^。68 cerevisiae)(GenBank NO :NP_015297(SEQ ID NO :99)、NC_001148(SEQ ID NO :100))。
[0098] 術(shù)語"3-羥丁酰-CoA脫氫酶"是指催化乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成3-羥丁酰-CoA的酶。 3_羥丁酰-CoA脫氫酶的例子可為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)-依賴型的、具有對 (S) -3-羥丁酰-CoA或（R) -3-羥丁酰-CoA的底物偏好的酶。例子可歸類為E. C. 1. 1. 1. 35 和E. C. 1. 1. 1. 30。另外，3-羥丁酰-CoA脫氫酶可為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)-依賴型的、具有對（S)-3-羥丁酰-CoA或（R)-3-羥丁酰-CoA的底物偏好的酶， 并且其可分別歸類為E.C. 1. 1. 1. 157和E.C. 1. 1. 1.36。3-羥丁酰-CoA脫氫酶得自多種 來源，例如丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (GenBank NO :NP_349314(SEQ ID N0 :101)、 NC_003030(SEQ ID NO :102))，枯草芽孢桿菌（B. subtilis) (GenBank NO :AAB09614(SEQ ID NO :103)、U29084(SEQ ID NO :104))，富養(yǎng)羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha) (GenBank NO :YP_294481 (SEQ ID NO :105)、NC_007347 (SEQ ID NO :106))，和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌 (Alcaligenes eutrophus)(GenBank NO ：AAA21973(SEQ ID NO ： 107), J04987 (SEQ ID NO： 108))。
[0099] 術(shù)語"巴豆酸酶"是指催化3-羥丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成丁烯酰-CoA和H20的酶。巴 豆酸酶的例子可具有對（S)-3-羥丁酰-CoA或（R)-3-羥丁酰-CoA的底物偏好并可分別 歸類為E. C. 4. 2. 1. 17和E. C. 4. 2. 1. 55。巴豆酸酶得自多種來源，例如大腸桿菌（E. coli) (GenBank N0:NP_415911(SEQ ID N0:109)、NC_000913(SEQ ID N0:110))，丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum) (GenBank NO ：NP_349318 (SEQ ID NO ：111), NC_003030 (SEQ ID NO： 112))，枯草芽孢桿菌（B. subtilis) (GenBank NO :CAB13705 (SEQ ID NO :113)、Z99113 (SEQ 10勵：114))和豚鼠氣單胞菌仏61'〇111〇1^8。3￥136)(6611831^勵：84421816(5￡0 10勵：115)、D88825(SEQ ID N0:116))。
[0100] 術(shù)語"丁酰-CoA脫氫酶"指催化丁烯酰-CoA轉(zhuǎn)化成丁酰-CoA的酶。丁酰-CoA 脫氫酶的例子可為NADH-依賴型的、NADPH-依賴型的、或黃素-依賴型的，并且可分別 歸類為 E. C. 1. 3. 1. 44、E. C. 1. 3. 1. 38、和 E. C. 1. 3. 99. 2。丁酰-CoA 脫氫酶得自多種來 源，例如丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (GenBank NO :NP_347102(SEQ ID N0 :117)， NC_003030(SEQ ID NO :118)))，小眼蟲（Euglena gracilis) (GenBank NO :Q5EU90SEQ ID 勵：119)，六￥741582(5￡0 10勵：120))，山丘鏈霉菌（5釷印仂11^。68。〇11111118)(66118&1^ NO :AAA92890(SEQ ID NO :121)、U37135(SEQ ID NO :122))和天藍色鏈霉菌（Str印tomyces coelicolor) (GenBank NO :CAA22721 (SEQ ID N0:123)、AL939127(SEQ ID N0:124))。
[0101] 術(shù)語"異丁酰-CoA變位酶"指催化丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成異丁酰-CoA的酶。這種酶 使用輔酶B12作為輔因子。異丁酰-CoA變位酶的例子已知為EC編號5. 4. 99. 13。這些 酶存在于多個鏈霉菌屬（Streptomyces)中，包括但不限于肉桂地鏈霉菌（Streptomyces cinnamonensis)(GenBank N0:AAC08713(SEQ ID N0:125)、U67612(SEQ ID N0:126); CAB59633(SEQ ID N0:127)、AJ246005(SEQ ID 勵：128))，天藍色鏈霉菌（5.。〇611。〇1〇1〇 (GenBank NO ：CAB70645(SEQ ID NO ：129), AL939123(SEQ ID NO： 130) ；CAB92663(SEQ ID N0:131)、AL939121(SEQ ID N0:132))和除蟲鏈霉菌（Str印tomyces avermitilis) (GenBank NO ：NP_824008 (SEQ ID NO ： 133), NC_003155 (SEQ ID NO： 134) ；NP_824637 (SEQ ID N0:135)、NC_003155(SEQ ID N0:136))。
[0102] 術(shù)語"丁醛脫氫酶"是指催化丁酰-CoA轉(zhuǎn)化成丁醛的酶，該酶使用NADH或NADPH 作為輔因子。丁醛脫氫酶具有對NADH的偏好性，該酶已知為E. C. 1. 2. 1. 57并且得自例如 拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) (GenBank NO :AAD31841、AF157306)和丙酮丁醇梭 菌（Clostridium acetobutylicum)(GenBank NO :NP_149325、NC_001988)。
[0103] 術(shù)語"乙酰乳酸脫羧酶"指具有催化a-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻的酶活性的 多肽（或多個多肽）。乙酰乳酸脫羧酶的例子已知編號為EC 4. 1.1. 5并且可例如來 自（枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) (GenBank NO :AAA22223，L04470)、土生克雷伯 氏菌（K;ebsiella terrigena)(GenBank N0:AAA25054，L04507)和（肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiells pneumoniae)(GenBank NO：AAU43774,AY722056)〇
[0104] 術(shù)語"乙偶姻胺化酶"或"乙偶姻轉(zhuǎn)氨酶"指具有催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成3-氨基-2- 丁 醇的酶活性的多肽（或多個多肽）。乙偶姻胺化酶可利用輔因子5'-磷酸吡哆醛或 NADH (還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）或NADPH (還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。所 得產(chǎn)物可在3-位點具有（R)或（S)立體化學(xué)構(gòu)型。依賴磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸如 丙氨酸或谷氨酸作為氨基供體。依賴NADH-和NADPH-的酶可使用氨作為第二底物。Ito等 人（美國專利6, 432, 688)描述了 NADH依賴的乙偶姻胺化酶（也稱為氨基醇脫氫酶）的合 適例子。依賴吡哆醛的乙偶姻胺化酶的例子是胺：丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶（也稱為胺：丙酮酸轉(zhuǎn) 氨酶），由 Shin 和 Kim 所述（J. Org. Chem. 67 :2848-2853 (2002))。
[0105] 術(shù)語"乙偶姻激酶"指具有催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成磷酸乙偶姻的酶活性的多肽（或 多個多肽）。乙偶姻激酶可利用ATP(三磷酸腺苷）或磷酸烯醇式丙酮酸作為反應(yīng)的磷酸 供體。催化相似底物二羥基丙酮的類似反應(yīng)的酶類，例如，包括已知為EC 2. 7. 1. 29的酶 (Garcia-Alles 等人（2004)Biochemistry 43 :13037-13046)。術(shù)語"乙偶姻憐酸胺化酶"是 指具有催化磷酸乙偶姻轉(zhuǎn)化至3-氨基-2- 丁醇0-磷酸的酶活性的多肽。乙偶姻磷酸胺化 酶可利用輔因子吡哆醛5'-磷酸、NADH或NADPH。所得產(chǎn)物可在3-位點具有（R)或（S)立 體化學(xué)構(gòu)型。依賴磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸如丙氨酸或谷氨酸。依賴NADH和NADPH-的 酶可使用氨作為第二底物。雖然沒有對催化這種磷酸乙偶姻反應(yīng)的酶的報道，但是提出有 一種吡哆醛磷酸-依賴型的酶，其對相似的底物絲氨醇磷酸進行相似的反應(yīng)（Yasuta等人， (2001) Appl. Environ. Microbial. 67 :4999-5009)。術(shù)語"氨基丁醇憐酸憐酸裂解酶"，也稱 為"氨基醇鄰位磷酸裂解酶"，指具有催化3-氨基-2- 丁醇鄰位磷酸轉(zhuǎn)化成2- 丁酮的酶活 性的多肽（或多個多肽）。氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶可利用輔因子5'-磷酸吡哆醛。有 對催化相似底物1-氨基-2-丙醇磷酸的類似反應(yīng)的酶的報道（Jones等人（1973) Biochem. J. 134:167-182)。美國申請公布2007/0259410描述了來自生物體胡蘿卜軟腐歐文氏菌 (Erwinia carotovora)的
[0106] 氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶。術(shù)語"氨基丁醇激酶"指具有催化3-氨基2- 丁醇 轉(zhuǎn)化成3-氨基-2- 丁醇鄰位磷酸的酶活性的多肽（或多個多肽）。氨基丁醇激酶可利用 ATP作為磷酸供體。雖然沒有對催化這種3-氨基-2- 丁醇反應(yīng)的酶的報道，但是報道了 催化相似底物膽胺和1-氨基-2-丙醇的類似反應(yīng)的酶（Jones等人，上文）。美國申請公 布2009/0155870在實例14中描述了胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑腐亞種（Erwinia carotovora subsp.Atroseptica)的氨基醇激酶。
[0107] 術(shù)語"丁二醇脫氫酶"也稱為"乙偶姻還原酶"，指具有催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成2, 3- 丁 二醇的酶活性的多肽（或多個多肽）。丁二醛脫氫酶是乙醇脫氫酶大家族中的一個子集。丁 二醇脫氫酶對于在醇類產(chǎn)物中的（R)_或（S)_立體化學(xué)生產(chǎn)可具有特異性。（S)-特異性丁 二醇脫氫酶已知為EC1. 1. 1. 76并且可來自例如肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumomae) (66汕&1^勵疋8413085、086412)。〇〇-特異性丁二醇脫氫酶已知為￡(：1.1.1.4并且可 來自例如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)(GenBank N0NP 830481、NC_004722;AAP07682、 AE017000)，和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)(GenBank N〇.AAK04995、AE006323)。
[0108] 術(shù)語"丁二醇脫水酶"，也稱為"二醇脫水酶"或"丙二醇脫水酶"，是指具有催化 2,3_ 丁二醇向2-丁酮的轉(zhuǎn)化的酶活性的多肽（或多種多肽）。丁二醇脫水酶可利用輔 因子腺苷鈷胺素（也稱為輔酶Bw或維生素B12 ;但是維生素B12也可指非輔酶B12的、其 它形式的鈷胺素）。腺苷鈷胺素-依賴型酶已知為EC 4.2. 1.28并且可得自例如產(chǎn)酸克 雷伯菌（Klebsiella oxytoca) (GenBank NO :AA08099( a 亞基），D45071 ;BAA08100(@ 亞 基），D45071 ;和BBA08101U亞基），D45071(注意：所有三個亞基是活性所需的）]、和 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoma)(GenBank NO :AAC98384(a 亞基），AF102064; GenBank NO :AAC98385 ( P 亞基），AF102064, GenBank NO :AAC98386 U 亞基），AF102064)。 其它合適的二醇脫水酶包括但不限于B12-依賴型二醇脫水酶，其得自鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium) (GenBank NO :AAB84102(大亞基），AF026270 ;GenBank N0 : AAB84103(中亞基），AF026270 ;GenBank NO :AAB84104(小亞基），AF026270);和丘狀菌 落乳桿菌（Lactobacillus collinoides) (GenBank NO :CAC82541(大亞基），AJ297723; GenBank NO :CAC82542(中亞基）；AJ297723;GenBank NO :CAD01091(小亞基），AJ297723); 和來自短乳桿菌（Lactobacillus brevis)(尤其是菌株 CNRZ 734 和 CNRZ 735，Speranza 等人，J.Agric. Food Chem. (1997)45:3476-3480)的酶，以及編碼相應(yīng)酶的核苷酸序列。二 醇脫水酶基因分離的方法是本領(lǐng)域人們所熟知的（例如，美國專利5, 686, 276)。
[0109] 術(shù)語"丙酮酸脫羧酶"是指催化丙酮酸脫羧成乙醛和二氧化碳的酶。丙酮酸脫 氫酶已知為EC編號4. 1. 1. 1。這些酶存在于多種酵母中，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)(GenBank NO ：CAA97575 (SEQ ID NO ： 137), CAA97705(SEQ ID NO： 138), CAA97091(SEQ ID NO :139))。
[0110] 術(shù)語"磷酸酮醇酶"是指催化木酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸的 酶。例子磷酸酮醇酶已知為EC編號4. 1.2.9。在一些實施例中，所述磷酸酮醇酶是來自植 物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)(核酸 SEQ ID N0 :180;氨基酸 SEQ ID NO :181)的 xpk〇
[0111] 術(shù)語"磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶"是指催化乙酰-CoA和磷酸轉(zhuǎn)化為CoA和乙酰磷酸的酶。例 子磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶已知為EC編號2. 3. 1. 8。在一些實施例中，所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶是來自植 物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)(核酸 SEQ ID N0:178;氨基酸 SEQ ID N0:179)的 eutD。
[0112] 如本文所用，術(shù)語"多肽"旨在涵蓋單數(shù)的"多肽"以及復(fù)數(shù)的"多肽"，并指由單 體（氨基酸）通過酰胺鍵（也被稱為肽鍵）線性連接組成的分子。術(shù)語"多肽"是指任何 兩個或更多個氨基酸的鏈，并且不涉及產(chǎn)物的特定長度。因此，定義"多肽"包括用于指兩 個或更多個氨基酸的單鏈或多鏈的肽、二肽、三肽、低聚肽、"蛋白、""氨基酸鏈、"或任何其 它術(shù)語，并且術(shù)語"多肽"可用于取代任何這些術(shù)語或與它們互換使用。術(shù)語"多肽"也旨 在指多肽的表達后修改形式產(chǎn)物，其不受限制的包括糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、已知 保護/封閉基團的衍生化、蛋白水解裂解、或非天然存在的氨基酸修改形式。在多個實施例 中，本文所提供的多肽，包括但不限于生物合成途徑多肽、細胞完整性多肽、繁殖多肽、和包 含全長多肽和它們的活性片段的其它酶類。
[0113] 以"分離的"多肽或片段形式的變體和其衍生物擬為不在其自然環(huán)境下的多肽。不 需要特別的純化水平。例如，分離的多肽能夠從它原生的或天然的環(huán)境中移除。為了本發(fā) 明的目的，在宿主細胞中重組產(chǎn)生的多肽和表達的蛋白被認為是分離的，即為天然的或重 組的多肽，其已通過任何適合的技術(shù)被分離、分餾、或部分地或充分地純化。
[0114] 本發(fā)明的多肽大小可為約10或更多個、20或更多個、25或更多個、50或更多個、75 或更多個、100或更多個、200或更多個、500或更多個、1，000或更多個、或2, 000或更多個 氨基酸。多肽可具有限定的三維結(jié)構(gòu)，但是它們不一定具有此類結(jié)構(gòu)。具有限定的三維結(jié) 構(gòu)的多肽稱為折疊多肽，并且不具有限定三維結(jié)構(gòu)，而是可能采用多種不同構(gòu)型的多肽稱 為非折疊多肽。
[0115] 本發(fā)明的多肽也包括前述多肽的衍生物、類似物、或變體，以及它們的任何組合。 術(shù)語"活性變體"、"活性片段"、"活性衍生物"、和"類似物"指本發(fā)明的多肽并包括任何能夠 催化指明的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽。本發(fā)明多肽的變體包括具有由于氨基酸取代、缺失 和/或插入導(dǎo)致的修改氨基酸序列的多肽。變體可為天然存在的或非天然存在的。非天然 存在的變體可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可包含保守的或非保守的氨基酸 取代、缺失和/或添加。本發(fā)明多肽的衍生物是已經(jīng)經(jīng)修改以表現(xiàn)出天然多肽不存在的附 加特性的多肽。例子包括融合蛋白。變體多肽本文也可稱為"多肽類似物"。如本文所用， 多肽的"衍生物"指具有一個或多個通過功能側(cè)基反應(yīng)化學(xué)衍生化的殘基的受試多肽。"衍 生物"也包括包含一個或多個天然存在的氨基酸（二十個標準氨基酸）衍生物的那些肽。 例如，可將4-羥脯氨酸取代成脯氨酸；可將5-羥賴氨酸取代成賴氨酸；可將3-甲基組氨酸 取代成組氨酸；可將高絲氨酸取代成絲氨酸；并且可將鳥氨酸取代成賴氨酸。
[0116] "片段"是本發(fā)明所用多肽的獨特的部分，其與親本全長序列的序列相同，長度更 短。片段可包含至多減去一個氨基酸殘基的全長指定序列。例如，片段可包含5個至1000 個鄰接氨基酸殘基。片段長度可為至少5個、10個、15個、16個、20個、25個、30個、40個、 50個、60個、75個、100個、150個、250個或至少500個鄰接氨基酸殘基。片段可優(yōu)選選自 分子的某些區(qū)。例如，多肽片段可包含某一長度的鄰接氨基酸，其選自多肽前100個或200 個氨基酸，如某些限定序列所示。清楚地是，這些長度是示例性的，并且本實施例包括由本 說明書（包括序列表、表和圖）支持的任何長度。相似地，當(dāng)用于參照多肽時，"活性片段" 是多肽的一部分，其保留了受試多肽的功能性，但包含小于所述多肽的整個序列。
[0117] 作為另外一種選擇，編碼這些相同或相似多肽的重組變體可通過利用基因編碼中 的"冗余"來合成或選擇?？蓪⒍鄠€密碼子取代例如產(chǎn)生多個限制性位點的沉默改變導(dǎo)入 以將克隆優(yōu)化到質(zhì)粒或病毒載體中或在宿主細胞系統(tǒng)中表達。
[0118] 優(yōu)選地，氨基酸"取代"是可為一個氨基酸替換為另一個具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué) 性質(zhì)的氨基酸的結(jié)果，即，保守的氨基酸替換，或可為一個氨基酸替換為另一個具有不同結(jié) 構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸的結(jié)果，即，非保守的氨基酸替換。"保守"氨基酸取代可基于涉 及殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)上的相似性進行。例如，非極 性（疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲 硫氨酸；極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷 氨酰胺；帶正電的（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；而帶負電的（酸性）氨基 酸包括天冬氨酸和谷氨酸。作為另外一種選擇，"非保守的"氨基酸取代可以通過選擇任何 這些氨基酸在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、或兩親性性質(zhì)方面的差異實現(xiàn)。"插入" 或"缺失"優(yōu)選地在約1個至約20個氨基酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在1個至10個氨基酸的范 圍內(nèi)。通過系統(tǒng)地利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或取代，并檢 測所得重組變體的活性，可以以實驗方法確定所允許的變型。
[0119] 適用于本發(fā)明的多肽及其片段由多核苷酸編碼。術(shù)語"多核苷酸"旨在涵蓋單個核 酸以及多個核酸，并且指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使RNA(mRNA)、病毒來源的RNA、 或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常規(guī)的磷酸二酯鍵或非常規(guī)的鍵（例如酰胺鍵，諸如 存在于肽核酸（PNA)中的）。術(shù)語"核酸"指任何一個或多個核酸片段，例如DNA或RNA片 段，它們存在于多核苷酸中。根據(jù)本發(fā)明多核苷酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。本發(fā)明的 多核苷酸可為宿主細胞天然具有的或異源的。此外，多核苷酸或核酸可為或可包括調(diào)控元 件如啟動子、核糖體結(jié)合位點、或轉(zhuǎn)錄終止子。
[0120] 多核苷酸序列可意為"分離的"，其中它從天然的環(huán)境中移除出來。例如，出于本發(fā) 明的目的分離了包含在載體中的異源多核苷酸，其編碼具有酶活性（例如將底物轉(zhuǎn)化成木 酮糖的能力）的多肽或多肽片段。分離的多核苷酸的另一個例子包括異源宿主細胞擁有的 重組多核苷酸或溶液中的純化的（部分地或基本上）多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明分離的多核苷 酸或核酸還包括此類人工合成生產(chǎn)的分子。DNA聚合物形式的分離的多核苷酸片段可以由 cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個片段構(gòu)成。
[0121] 術(shù)語"基因"指能夠被表達為特定蛋白的核酸片段，其任選包括編碼序列前的調(diào)節(jié) 序列（5'非編碼序列）和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列（3'非編碼序列）。
[0122] 如本文所用，"編碼區(qū)"或"0RF"是核酸的一部分，其由翻譯成氨基酸的密碼子組 成。雖然"終止密碼子"（TAG、TGA、或TAA)不翻譯成氨基酸，如果存在的話，可認為它是編 碼區(qū)的一部分，但是任何側(cè)接序列，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子、5' 和3'非翻譯區(qū)等，不是編碼區(qū)的一部分。"合適的調(diào)控序列"是指位于編碼序列上游" (5' 非編碼序列）、中間、或下游（3'非編碼序列）并影響相關(guān)聯(lián)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工 或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷 酸化識別序列、RNA加工位點、效應(yīng)子結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0123] 術(shù)語"啟動子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般來講，編 碼序列位于啟動子序列的3'端。啟動子可整個源于天然基因，或者由源于天然存在的不同 啟動子的不同元件構(gòu)成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，不同的啟 動子可指導(dǎo)基因在不同的組織或細胞類型中、在不同的發(fā)育階段、或響應(yīng)于不同的環(huán)境或 生理條件的表達。通常將在大多數(shù)細胞類型中、在大多數(shù)情況下引起基因表達的啟動子稱 為"組成型啟動子"。此外還認識到，由于大多數(shù)情況下調(diào)控序列的確切界限還未被徹底地 界定，不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。
[0124] 本文所公開的一些啟動子核酸序列，包括在表1、2、7和8中的那些，是隨意取自 每個基因的起始密碼子5'的lOOObp。然而，所述序列可取自公共可用的數(shù)據(jù)庫，諸如 Yeastract database, www. yeastract. com(訪問于 2012 年 12 月 21 日）或 Saccharomyces Genome Database www.yeastgenome.org (訪問于 2012 年 12 月 21 日）。指明了基因名（在 可用情況下）和系統(tǒng)名（在cf. Saccharomyces Genome Database可用情況下）。如上所 述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會理解所提供序列的不同長度的片段可具有相同的啟動子活 性，因此，參照例如"HEM13啟動子"，將被理解涵蓋了本文提供的序列或HEM13基因的啟動 子區(qū)的任一片段，其具有相同啟動子活性或?qū)τ诎袠硕嚯牡谋磉_或指明產(chǎn)物的生產(chǎn)具有基 本上類似的效果。因此，所公開的核酸序列不能理解為僅限定于所提供的序列。
[0125] 在某些實施例中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況下，包含編碼多肽的 核酸的多核苷酸通?？砂▎幼雍?或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，它們可操作地結(jié)合一 個或多個編碼區(qū)。可操作地結(jié)合是基因產(chǎn)物（例如多肽）的編碼區(qū)與一個或多個調(diào)控序列 以將基因產(chǎn)物的表達置于調(diào)控序列的影響或控制下的方式結(jié)合。兩個DNA片段（諸如多肽 編碼區(qū)和與其相關(guān)聯(lián)的啟動子），如果啟動子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼期望基因產(chǎn)物的mRNA轉(zhuǎn) 錄并且如果兩個DNA片段間的連鎖本質(zhì)不干擾表達調(diào)控序列引導(dǎo)基因產(chǎn)物表達的能力或 干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，它們是"可操作地結(jié)合的"或"可操作地連接的"或"耦合的"。 因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉(zhuǎn)錄，該啟動子區(qū)將與編碼多肽的核酸可操作地結(jié)合。除 啟動子之外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件例如增強子、操縱子、阻遏蛋白和轉(zhuǎn)錄終止信號可與所述 多核苷酸可操作地結(jié)合。本文公開了適用的啟動子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。"表達構(gòu)建體"，如 本文所用，包含啟動子核酸序列，其可操作地連接至多肽的編碼區(qū)和，任選地，終止子核酸 序列。
[0126] 多種翻譯控制元件是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。這些元件包括但不限于核糖 體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子、以及來源于病毒體系的元件（尤其是內(nèi)部核糖體進 入位點或IRES)。在其它實施例中，本發(fā)明的多核苷酸是RNA，例如信使RNA(mRNA)形式的 RNA。本發(fā)明的RNA可為單鏈的或雙鏈的。
[0127] 本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可與編碼分泌肽或信號肽的附加編碼區(qū)相關(guān)聯(lián)， 它們引導(dǎo)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。
[0128] 如本文所用，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指將核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物體的基因組內(nèi)，導(dǎo)致在基 因上穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體被稱為"重組的"或"轉(zhuǎn)化的"生物體。
[0129] 如本文所用術(shù)語"表達"和"表達的"指來源于本發(fā)明的核酸片段的有義RNA (mRNA) 或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達也可指將mRNA翻譯成多肽。"差異表達的"是指根據(jù) 宿主細胞的環(huán)境，差異性產(chǎn)生從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA或由基因編碼的蛋白產(chǎn)物。相比于在其它 條件下的表達水平，差異表達的基因可以是過表達的或低表達的。在一個方面，差異性是指 比參照環(huán)境中測定的表達水平高或低1、2、3、4、5、10或20倍。術(shù)語"差異表達的"還指在 細胞中的核苷酸序列在對照環(huán)境中沉默或不表達的情況下表達或在對照細胞中表達的情 況下不表達。
[0130] 術(shù)語"質(zhì)粒"、"載體"指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外 元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。此類元件可以是線性或環(huán)狀的、單鏈或雙鏈 DNA或RNA的、來源于任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，在 其中許多核苷酸序列已被接合或組合為能夠?qū)⑨槍λx擇的基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA 序列與適當(dāng)?shù)?'非翻譯序列一起引入細胞中的獨特構(gòu)造。"轉(zhuǎn)化盒"指含有外來基因并且 除了該外來基因外還含有有利于轉(zhuǎn)化特定宿主細胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。"表達盒"指含 有基因并且除了該基因外還含有兀件以允許基因表達的特異性構(gòu)建體。
[0131] 如本文所用，"天然的"是指多核苷酸、基因或多肽的形式與天然存在的一樣，帶有 其自身的調(diào)節(jié)序列（如果存在調(diào)節(jié)序列）。
[0132] 如本文所用，"內(nèi)源"是指多核苷酸、基因或多肽在其在生物體中或生物體的基因 組中的天然位置的天然形式。"內(nèi)源多核苷酸"包括在其在生物體的基因組中的天然位置的 天然多核苷酸。"內(nèi)源基因"包括在其在生物體的基因組中的天然位置的天然基因。"內(nèi)源 多肽"包括在其在生物體中的天然位置的天然多肽。
[0133] 如本文所用，"異源"是指正常情況下不存在于宿主生物中，而是被導(dǎo)入宿主生物 的多核苷酸、基因或多肽。"異源多核苷酸"可包括原生的編碼區(qū)、或它們的一部分，即以不 同于對應(yīng)的原生多核苷酸的形式重新導(dǎo)入源生物體。"異源基因"也包括原生的編碼區(qū)、或 它們的一部分，即以不同于對應(yīng)的原生基因的形式重新導(dǎo)入源生物體。例如，異源基因可包 括被再引入至天然宿主的原生編碼區(qū)，其為包括非天然的調(diào)控區(qū)的嵌合基因的一個部分。 "異源多肽"包括天然多肽，其以不同于對應(yīng)的天然多肽的形式被重新導(dǎo)入源生物體。
[0134] 與本發(fā)明的參考核苷酸序列具有至少例如95% "相同"的核苷酸序列的核酸或多 核苷酸指多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，不同的是多核苷酸序列每100個參考核 苷酸序列的核苷酸可包括至多五個點突變。換句話講，為了獲得與參考核苷酸序列具有至 少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5 %的核苷酸可被刪除或用另一個 核苷酸取代，或者可將占參考序列至多5%的總核苷酸的多個核苷酸插入?yún)⒖夹蛄小?br> [0135] 實際上，可使用已知的計算機程序常規(guī)地測定是否任何特定的核酸分子或多肽與 本發(fā)明的核苷酸序列或多肽序列為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相 同的。用于測定查詢序列（本發(fā)明的序列）與受試序列間的最佳總體匹配的優(yōu)選方法也 稱為全局序列比對，可使用FASTDB計算機程序基于Brutlag等人，Comp. Appl. Biosci. 6 : 237-245(1990)的算法。在一個序列比對中，查詢和受試序列都是DNA序列。RNA序列可通 過將U轉(zhuǎn)換成T進行比較。所述全面序列比對的結(jié)果是百分比同一性。在用于計算百分比 同一性的DNA序列的FASTDB比對中使用的優(yōu)選參數(shù)是：Matrix = Unitary, k-tuple = 4， Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty-30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1，Gap Penalty = 5,Gap Size Penalty = 0? 05, Window Size = 500 或者受試核 苷酸序列的長度，取任何一個更短的。
[0136] 如果因為5'或3'端的缺失而不是由于內(nèi)部缺失導(dǎo)致受試序列比查詢序列更 短，必須對結(jié)果進行人工修正。這是因為FASTDB程序當(dāng)計算百分比同一性時不截短受試序 列的5'和3'端。對于相對于查詢序列在5'端和3'端截短的受試序列，通過計算為受試 序列的5'端和3'端的查詢序列堿基的數(shù)目來修正百分比同一性，上述堿基不是匹配的/ 對齊的，將它們計算為占查詢序列總堿基的百分比。通過FASTDB序列比對的結(jié)果測定是否 核苷酸是匹配的/對齊的。然后從百分比同一性中減去通過上述FASTDB程序使用特定參 數(shù)計算出的這個百分比以得到最終的百分比同一性評分。將這個修正評分用于本發(fā)明的目 的。如FASTDB比對所示，僅有在受試序列5'端和3'端堿基之外的堿基不與查詢序列匹 配/對齊，它們進行計算以人工調(diào)節(jié)百分比同一性評分。
[0137] 例如，90個堿基的受試序列與100個堿基的查詢序列進行比對以測定百分比同一 性。缺失發(fā)生在受試序列的5'端并且因此FASTDB比對不顯示5'端前10個堿基的匹配 /對齊。所述10個未配對的堿基占序列的10% (在5'端和3'端未匹配的堿基數(shù)目/查 詢序列中的堿基總數(shù)），因此從通過FASTDB程序計算的百分比同一性評分中減去10 %。如 果剩余的90個堿基是完全匹配的，百分比同一性將為90 %。在另一個實例中，90個堿基的 受試序列與100個堿基的查詢序列進行比較。這時所述缺失為內(nèi)部缺失，因此在不與查詢 序列匹配/對齊的受試序列的5'或3'無堿基。在這種情況下，不對通過FASTDB計算出 的百分比同一性進行人工修正。再次，僅人工修正不與查詢序列匹配/對齊的受試序列的 5'和3'堿基。出于本發(fā)明的目的，不進行其它的人工修正。
[0138] 本發(fā)明中所用的多肽是由核酸序列編碼的，所述核酸序列與說明書中其它位置描 述的核苷酸序列（包括活性變體、片段或其衍生物）至少約80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 相同。
[0139] 術(shù)語"活性變體"、"活性片段"、"活性衍生物"和"類似物"是指本發(fā)明的多核苷酸 并且包括任何編碼在本發(fā)明中所用的生物催化劑多肽、保持它們相應(yīng)的酶活性或結(jié)構(gòu)的多 核苷酸。本發(fā)明多核苷酸的變體包括具有由于堿基對取代、缺失和/或插入導(dǎo)致的修改核 苷酸序列的多核苷酸。變體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在的變體可使用本 領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。本發(fā)明多核苷酸的衍生物是已經(jīng)經(jīng)修改以便它們編碼的多肽表 現(xiàn)出天然多肽不存在的附加特性的多核苷酸。例子包括編碼融合蛋白的多核苷酸。變體多 核苷酸也可稱為"多核苷酸類似物"。如本文所用，多核苷酸的"衍生物"指具有一個或多個 通過功能側(cè)基反應(yīng)化學(xué)衍生化的核苷酸的受試多核苷酸。"衍生物"也包括包含一個或多個 天然存在的核苷酸衍生物的那些多核苷酸。例如，可將3-甲基胞苷取代成胞嘧啶；可將胸 腺嘧啶核糖核苷取代成胸腺嘧啶核苷；并且可將N4-乙酰胞嘧啶取代成胞嘧啶。
[0140] 當(dāng)用于參考啟動子序列時，"片段"是所述啟動子核酸序列或編碼本發(fā)明中所用生 物催化劑多肽的核酸序列的獨特的部分，其序列與親本核酸序列相同但長度更短。例如，片 段可包含5個至1000個鄰接核苷酸。用作探針、引物、或其它目的的片段可為至少5個、10 個、15個、16個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、75個、100個、150個、250個或至少 500個鄰接的核苷酸。片段可包含至多減去一個核苷酸或氨基酸的全長指定序列。片段可 優(yōu)選選自分子的某些區(qū)。例如，多核苷酸片段可包含某一長度的鄰接核苷酸，其選自多肽前 100個或200個核苷酸，如某些限定序列所示。清楚地是，這些長度是示例性的，并且本實施 例包括由本說明書（包括序列表、表和圖）支持的任何長度。
[0141] 如本文所用術(shù)語"密碼子簡并性"是指在遺傳密碼中核苷酸序列允許變化的性質(zhì)， 這種變化不影響編碼多肽中的氨基酸序列。技術(shù)人員非常了解具體宿主細胞在使用核苷酸 密碼子以確定給定氨基酸時所表現(xiàn)出的"密碼子偏倚性"。因此，當(dāng)合成基因用以改善在宿 主細胞中的表達時，期望對基因進行設(shè)計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細胞優(yōu)選的 密碼子使用頻率。
[0142] 如本文所用，術(shù)語"經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)"指已經(jīng)通過用在指定生物的基因中 較頻繁使用的一個或多個密碼子取代至少一個、或多于一個、或顯著數(shù)量的密碼子，從而適 于在該生物的細胞中表達的核酸編碼區(qū)。
[0143] 包含編碼任何多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的偏差，允許編碼該基因 的序列中的變型。由于每一密碼子由三個核苷酸組成，而組成DNA的核苷酸限于四種特異 性堿基，存在64種可能的核苷酸組合，其中的61種編碼氨基酸（其余三種密碼子編碼結(jié)束 翻譯的信號）。顯示哪個密碼子編碼哪個氨基酸的遺傳密碼被轉(zhuǎn)載為本文表A。因此，許多 氨基酸由一種以上的密碼子命名例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四種三聯(lián)體編碼，絲氨酸 和精氨酸由六種，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一種三聯(lián)體編碼。這種簡并性允許DNA堿基組 成在寬范圍內(nèi)變化而不會改變由該DNA編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0144] 表A :標準遺傳密碼

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)丁醇或2-丁酮的方法，包括： A) 使包含異源多核苷酸的重組宿主細胞與碳底物在第一組條件下接觸，所述異源多核 苷酸包含 i) 啟動子核酸序列；和 ii) 編碼生物催化劑多肽的核酸序列；以及 B) 使所述重組宿主細胞與碳底物在第二組條件下接觸； 其中所述第一組條件和所述第二組條件不同，并且其中與在所述第二組條件下相比， 所述編碼生物催化劑多肽的核酸序列在所述第一組條件下是差異表達的；并且 其中所述宿主細胞在所述第一組條件或所述第二組條件中的至少一個下產(chǎn)生丁醇或 2_ 丁酮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一組條件和所述第二組條件的不同在于碳 底物源、溶解氧濃度、溫度、pH、葡萄糖濃度、或丁醇或2-丁酮濃度中的至少一個。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述第一組條件期間的溶解氧濃度比在所述第 二組條件期間的溶解氧濃度大。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述第二組條件是厭氧的。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在所述第一組條件中的平均葡萄糖濃 度比在所述第二組條件期間的平均葡萄糖濃度低。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在所述第一組條件中的平均葡萄糖濃度比在所述 第二組條件期間的平均葡萄糖濃度低至少約5倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在所述第一組條件中的平均葡萄糖濃度比在所述 第二組條件期間的平均葡萄糖濃度低至少約50倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中在所述第一組條件中的平均葡萄糖濃度比在所述 第二組條件中的平均葡萄糖濃度低至少約100倍。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在所述第一組條件下的丁醇產(chǎn)生速率 比在所述第二組條件下的丁醇產(chǎn)生速率低。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述生物催化劑多肽催化丙酮酸至 乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述生物催化劑多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的 底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化且包含與SEQ ID NO :1或其活性片段具有至少約85%的同一性的序列。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO : 170、171、172、175、176、177、186、186、188、189、190、191、192、193、194、194、195、196、 197、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、 217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、 236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、 255、256、257或258或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、 286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、 305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、 324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、 343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、 362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、 381、382或383或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :775、776、777或778或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求15所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :686具有至少約90%的同一性的序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :384、360、386或331或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :772或 773或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :168、169、388或173或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :768或 769具有至少約90%的同一性的序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :779或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :711或其活性片段具有至少約90%的同一性的序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150 或 151 或其片段具有至少約 90% 的 同一'I"生的序列。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中用于所述第一組條件的碳底物源不 同于所述第二組條件的碳底物源。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中用于所述第一組條件的碳底物源是糖蜜。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中用于所述第二組條件的碳底物源是玉米 醪。
28. -種分離的多核苷酸，包含： (a) 啟動子核酸序列；和 (b) 編碼生物催化劑多肽的核酸序列； 其中將（b)的核酸序列偶聯(lián)到（a)的核酸序列，使得所述生物催化劑多肽在發(fā)酵過程 的生產(chǎn)期和繁殖期差異表達。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的分離的多核苷酸，其中在發(fā)酵的生產(chǎn)期中的生物催化劑多 肽的表達比在發(fā)酵的繁殖期中的生物催化劑多肽的表達高。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的分離的多核苷酸，其中在發(fā)酵的繁殖期中的生物催化劑多 肽的表達比在發(fā)酵的生產(chǎn)期中的生物催化劑多肽的表達高。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是生物合 成途徑多肽或細胞完整性多肽。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽在丁醇或 2- 丁酮生物合成途徑中催化底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或32所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽選 自具有下列酶學(xué)委員會編號的酶：EC 2. 2. 1. 6、EC 1. 1. 1. 86、EC 4. 2. 1. 9、EC 4. 1. 1. 72、 EC 1.1. 1.1、EC 1.1. 1.265、EC 1.1. 1.2、EC 1.2. 4.4、EC 1.3. 99.2、EC 1.2.1.57、 EC 1.2. 1.10、EC 2. 6. 1.66、EC 2. 6. 1.42、EC 1.4. 1.9、EC 1.4. 1.8、EC 4.1.1.14、 EC 2. 6. 1.18、EC 2. 3.1.9、EC 2. 3. 1.16、EC 1.1. 130、EC 1.1. 1.35、EC 1.1.1.157、 EC 1. 1. 136、EC 4. 2. 1. 17、EC 4. 2. 1. 55、EC 1. 3. 1. 44、EC 1. 3. 1. 38、EC 1. 3. 1. 44、EC 1. 3. 1. 38、EC 5. 4. 99. 13、EC 4. 1. 1. 5、EC 1. 1. 1. 1、2· 7. 1. 29、1· 1. 1. 76、1· 2. 1. 57 和 4. 2. 1. 28。
34. 根據(jù)權(quán)利要求28、29、32或33所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽在 異丁醇生物合成途徑中催化底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
35. 根據(jù)權(quán)利要求28、29、32或33所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽 是乙酰乳酸合酶、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶、乙酰羥酸脫水酶、支鏈α -酮酸脫羧酶、支鏈醇脫 氫酶、支鏈酮酸脫氫酶、丁酰-CoA脫氫酶、丁醛脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、纈氨酸脫氫酶、纈氨酸脫羧 酶、ω -轉(zhuǎn)氨酶、乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-羥丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脫氫 酶、異丁酰-CoA變位酶、乙酰乳酸脫羧酶、乙偶姻胺化酶、丁醇脫氫酶、丁醛脫氫酶、乙偶姻 激酶、乙偶姻磷酸胺化酶、氨基丁醇磷酸磷酸化酶、氨基丁醇激酶、丁二醇脫氫酶、或丁二醇 脫水酶。
36. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或31所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是參 與耐酸性的、GPI-錨定的細胞壁蛋白。
37. 根據(jù)權(quán)利要求28、29、31或36所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽 包含與 SEQ ID NO :397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、 427、429、431、433或435具有至少90 %的同一性的序列。
38. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或31-37中任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述啟動子核 酸序列包含與 SEQ ID NO : 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150 或 151 或其片 段具有至少約90%或至少約95%的同一性的序列。
39. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或31-37中任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述啟動子核 酸序列包含與 SEQ ID NO :168、169、170、171、172、173、174、175、176或177或其片段具有至 少約90%或至少約95%的同一性的序列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的分離的多核苷酸，其中所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :168、169、170、171、172、173、174、175、176 或 177 或其片段具有至少約 90% 或至少約 95%的同一性的序列，并且其中所述生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離的多核苷酸，其中所述乙酰乳酸合酶與SEQ ID NO :1 具有至少約90%的同一性。
42. 根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求30所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽 是繁殖多肽、異丁醇途徑副產(chǎn)物多肽、甘油生物合成途徑、或NADPH生成途徑的多肽。
43. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是磷 酸酮醇酶。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的分離的多核苷酸，其中所述磷酸酮醇酶來源于植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)〇
45. 根據(jù)權(quán)利要求28、29或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是磷 酸轉(zhuǎn)乙酰酶。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的分離的多核苷酸，其中所述磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶來源于植物乳桿 菌。
47. 根據(jù)權(quán)利要求28、30或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是乙 酰乳酸還原酶。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的分離的多核苷酸，其中所述乙酰乳酸還原酶是YMR226C。
49. 根據(jù)權(quán)利要求28、30或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是醛 脫氫酶。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是ALD6。
51. 根據(jù)權(quán)利要求28、30或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是氧 化戊糖磷酸途徑的酶。
52. 根據(jù)權(quán)利要求28、30、42或51所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶、或6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶。
53. 根據(jù)權(quán)利要求28、30或42所述的分離的多核苷酸，其中所述生物催化劑多肽是甘 油-3-磷酸脫氫酶。
54. 根據(jù)權(quán)利要求28、30、42-53中任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述啟動子核 酸序列包含與 SEQ ID NO :152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162或163或其片 段具有至少約90%或至少約95%的同一性的序列。
55. 根據(jù)權(quán)利要求28-54中任一項所述的分離的多核苷酸，其中（b)的核酸序列經(jīng)密碼 子優(yōu)化以在特定宿主細胞中表達。
56. -種重組微生物宿主細胞，包含權(quán)利要求28-55中任一項所述的分離的多核苷酸。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的重組微生物宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌、藍細菌、 絲狀真菌或酵母細胞。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌或藍細菌細胞。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞的屬是沙門氏菌 屬（Salmonella)、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、短桿菌屬 (Brevibacterium)、梭菌屬（Clostridium)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、葡糖桿 菌屬（Gluconobacter)、諾卡氏菌屬（Nocardia)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、紅球菌 屬（Rhodococcus)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas)、埃希氏菌 屬（Escherichia)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、腸球菌屬 (Enterococcus)、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、類芽孢桿菌屬 (Paenibacillus)或黃單胞菌屬（Xanthomonas)。
60. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌或酵母細胞。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞的屬是酵母屬 (Saccharomyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、漢遜酵母屬（Hansenula)、耶氏酵母屬 (Yarrowia)、曲霉屬（Aspergillus)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、管囊酵母屬 (Pachysolen)、紅酵母屬（Rhodotorula)、接合酵母屬（Zygosaccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、有抱圓酵母屬（Torulaspora)、德巴利酵母屬（Debayomyces)、擬 威爾酵母屬（Williopsis)、德克酵母屬（Dekkera)、克勒克酵母屬（Kloeckera)、梅奇酵母 屬（Metschnikowia)、伊薩酵母屬（Issatchenkia)或假絲酵母屬（Candida)。
62. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是釀酒酵母（Saccharomyces cerevlslae)〇
63. 根據(jù)權(quán)利要求56-62中任一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含降低或消 除的內(nèi)源丙酮酸脫羧酶的表達。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的宿主細胞，其中所述降低或消除的脫羧酶的表達是由基因 缺失、破壞或突變引起的。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的宿主細胞，其中所述破壞或缺失的基因是roci、H)C5、 PDC6、或它們的組合。
66. 根據(jù)權(quán)利要求56-65中任一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含降低或消 除的內(nèi)源酶的表達，所述內(nèi)源酶具有醛脫氫酶活性、甘油-3-磷酸脫氫酶活性、乙酰乳酸還 原酶活性、或影響Fe-S簇生物合成的多肽。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的宿主細胞，其中所述降低或消除的內(nèi)源酶的表達是由基因 缺失、破壞或突變引起的，所述內(nèi)源酶具有醛脫氫酶活性、甘油-3-磷酸脫氫酶活性、乙酰 乳酸還原酶活性、或影響Fe-S簇生物合成的多肽。
68. -種用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括： (a) 提供根據(jù)權(quán)利要求56-67中任一項所述的重組宿主細胞； (b) 使所述宿主細胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中的可發(fā)酵碳底物在由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下接 觸；以及 (c) 回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
69. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，還包括在由此所述宿主細胞的繁殖先于（b)的接觸 的條件下使所述宿主細胞繁殖。
70. 根據(jù)權(quán)利要求68或權(quán)利要求41所述的方法，其中所述由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件是 厭氧的。
71. 根據(jù)權(quán)利要求68或權(quán)利要求69所述的方法，其中所述由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件是 微氧的。
72. 根據(jù)權(quán)利要求68-71中任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物選自：丁醇、2-丁酮、 丙醇、異丙醇和乙醇。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是丁醇或2- 丁酮。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇，并且其中所述分離的 多核苷酸包含啟動子核酸序列，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0:168、169、170、171、 172、173、174、175、176或177或其片段至少約90%或至少約95%的同一性，并且其中所述 生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶或酮醇酸還原異構(gòu)酶。
76. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇，并且其中所述分離的 多核苷酸包含啟動子核酸序列，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID N0:170、171、172、175、 176、177、186、186、188、189、190、191、192、193、194、194、195、196、197、198、199、200、201、 202、203、204、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、268、 269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、 288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、 307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、 326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、 345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、 364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、 383、384、360、386、331、168、169、388或173或其片段具有至少約90%或至少約95%的同一 性的序列。
77. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇，并且其中所述分離的 多核苷酸包含啟動子核酸序列，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :686或711具有至 少約90%或至少約95%的同一性的序列。
78. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是異丁醇，并且其中所述分離的 多核苷酸包含啟動子核酸序列，所述啟動子核酸序列包含與SEQ ID NO :711具有至少約 90%或至少約95%的同一性，其中所述生物催化劑多肽是乙酰乳酸合酶的序列。
79. -種用于篩選在發(fā)酵的生產(chǎn)期期間優(yōu)先表達的候選啟動子序列的方法，包括： (a) 在繁殖條件下培養(yǎng)微生物； (b) 從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (c) 在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物； (d) 從（c)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (e) 僅選擇其表達水平高于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些分離 的核糖核酸分子；以及 (f) 測定與（e)中選擇的所述核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的所述啟動子的多核苷酸序 列。
80. -種用于篩選在發(fā)酵的生產(chǎn)期期間優(yōu)先抑制的候選啟動子序列的方法，包括： (a) 在繁殖條件下培養(yǎng)微生物； (b) 從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (c) 在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物； (d) 從（c)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (e) 僅選擇其表達水平低于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些分離 的核糖核酸分子；以及 (f) 測定與（e)中選擇的所述核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的所述啟動子的多核苷酸序 列。
81. -種用于篩選在發(fā)酵的繁殖期期間優(yōu)先抑制的候選啟動子序列的方法，包括： (a) 在繁殖條件下培養(yǎng)微生物； (b) 從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (c) 在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物； (d) 從（c)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (e) 僅選擇其表達水平高于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些分離 的核糖核酸分子；以及 (f) 測定與（e)中選擇的所述核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的所述啟動子的多核苷酸序 列。
82. -種用于篩選在發(fā)酵的繁殖期期間優(yōu)先表達的候選啟動子序列的方法，包括： (a) 在繁殖條件下培養(yǎng)微生物； (b) 從（a)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (c) 在生產(chǎn)條件下培養(yǎng)微生物； (d) 從（c)中培養(yǎng)的微生物分尚核糖核酸分子； (e) 僅選擇其表達水平低于（b)中對應(yīng)的分離的核糖核酸分子的在（d)中的那些分離 的核糖核酸分子；以及 (f) 測定與（e)中選擇的所述核糖核酸分子的表達相關(guān)聯(lián)的所述啟動子的多核苷酸序 列。
83. 根據(jù)權(quán)利要求79-82中任一項所述的方法，其中將（b)和（d)中分離的所述核糖核 酸分子導(dǎo)入到報道基因構(gòu)建體中。
84. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中將（b)和（d)中分離的所述核糖核酸分子與編 碼熒光蛋白的多核苷酸可操作地連接。
85. 根據(jù)權(quán)利要求79-84中任一項所述的方法，其中所述繁殖條件包括使所述微生物 在包含某一濃度的可發(fā)酵碳底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長，并且所述生產(chǎn)條件包括使所述微生 物在包含更高濃度的相同可發(fā)酵碳底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長。
86. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述可發(fā)酵碳底物選自：單糖、寡糖、多糖、以及 它們的混合物。
87. 根據(jù)權(quán)利要求79-84中任一項所述的方法，其中所述繁殖條件包括使所述微生物 在包含某一濃度的溶解氧的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長，并且所述生產(chǎn)條件包括使所述微生物在包 含更低濃度的溶解氧的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述更低濃度的溶解氧是小于約3%。
89. -種重組酵母宿主細胞，包含異丁醇生物合成途徑和至少一個經(jīng)修飾的表達構(gòu)建 體，所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體在如下條件下差異表達多肽，在該條件中，生物質(zhì)的繁殖傾向 于超過異丁醇的產(chǎn)量，由此在所述條件下的異丁醇產(chǎn)量與在相同條件下不含所述經(jīng)修飾的 表達構(gòu)建體的宿主細胞相比是基本上降低的。
90. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的重組酵母宿主細胞，其中所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體包含 SEQ ID NO :711。
91. 根據(jù)權(quán)利要求89或90所述的重組酵母宿主細胞，其中所述經(jīng)修飾的表達構(gòu)建體包 含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽能夠催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
92. 根據(jù)權(quán)利要求89-91中任一項所述的重組酵母宿主細胞，其中所述編碼多肽的多 核苷酸包含與SEQ ID NO :2至少約85%、至少約90%、至少約95%或100%的同一性，所述 多肽能夠催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
93. 根據(jù)權(quán)利要求89-92中任一項所述的重組酵母宿主細胞，其中所述能夠催化丙酮 酸至乙酰乳酸的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的多肽包含與SEQ ID NO :1至少約85%、至少約90%、 至少約95 %或100%的同一性。
94. 根據(jù)權(quán)利要求89-93中任一項所述的重組酵母宿主細胞，其中所述經(jīng)修飾的表達 構(gòu)建體包含與SEQ ID NO :790具有至少約85%、至少約90%、至少約95%或100%的同一 性的序列。
95. 根據(jù)權(quán)利要求89-94中任一項所述的重組酵母宿主細胞，其中所述酵母宿主細胞 是釀酒酵母。
96. -種用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括： (a) 提供根據(jù)權(quán)利要求89-95中任一項所述的重組宿主細胞； (b) 使所述宿主細胞與發(fā)酵培養(yǎng)基中的可發(fā)酵碳底物在由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件下接 觸；以及 (c) 回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
97. 根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法，其中所述由此產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的條件是厭氧的或微氧 的。
【文檔編號】C12P7/26GK104284980SQ201280070983
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
【發(fā)明者】M.道納, A.L.克魯科伯格, R.A.拉羅薩, B.J.鮑爾, J.F.圖米內(nèi)洛, W.蘇 申請人:布特馬斯先進生物燃料有限責(zé)任公司