體液的細(xì)胞分析的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本文提供在血液學(xué)分析器上進(jìn)行細(xì)胞分析的方法。在各種方面，所述方法提供紅細(xì)胞(RBC)與白細(xì)胞(WBC)之間的分離和/或區(qū)分，其利用熒光染料來(lái)選擇性染色WBC以使得其發(fā)出更強(qiáng)的熒光信號(hào)。所述方法提供對(duì)于WBC和RBC的最佳檢測(cè)極限，從而允許分析具有稀少細(xì)胞濃度的樣品?？墒褂脙H僅一種試劑來(lái)制備用于體液分析的單一稀釋液，從而簡(jiǎn)化所述體液分析。使用本公開(kāi)的多個(gè)方面中描述的無(wú)溶胞方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于WBC的最小破壞。
【專(zhuān)利說(shuō)明】體液的細(xì)胞分析
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年12月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)61/580，623的優(yōu)先權(quán)權(quán)益；所述美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003]各種方法用于細(xì)胞分析，包括經(jīng)由光或熒光顯微術(shù)的目測(cè)和/或自動(dòng)檢驗(yàn)。通常實(shí)施這些類(lèi)型的細(xì)胞檢查和分析以便獲得關(guān)于樣品中的細(xì)胞譜系、成熟階段和細(xì)胞計(jì)數(shù)的信息。
[0004]流式細(xì)胞術(shù)是在非均質(zhì)樣品中的不同細(xì)胞類(lèi)型之間進(jìn)行識(shí)別和區(qū)分的方法。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞一次一個(gè)或幾乎一次一個(gè)穿過(guò)感測(cè)區(qū)域，其中每個(gè)細(xì)胞被能量源照射。典型地，單一波長(zhǎng)光源(例如，激光器等)用作能量源并且各種傳感器中的一個(gè)或多個(gè)基于細(xì)胞與施加能量的相互作用來(lái)記錄數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)普遍地用于血液學(xué)并且已經(jīng)尤其成功地診斷血液癌癥。除了流式細(xì)胞術(shù)以外，其它分析方法用于血液學(xué)中并且表征細(xì)胞群體。
[0005]血液樣品傾向于具有高濃度的細(xì)胞。不論通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或其它技術(shù)，具有顯著較低濃度細(xì)胞的樣品的分析較困難并且因此不太常見(jiàn)。另外，被設(shè)計(jì)成測(cè)量全血樣品的傳統(tǒng)血液學(xué)分析器傾向于具有對(duì)于低端細(xì)胞濃度的有限檢測(cè)靈敏度。在一些情況下，樣品的手動(dòng)檢查是細(xì)胞分析的唯一可用方法。在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和其它領(lǐng)域需要分析具有低細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣品的改進(jìn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]在一方面，本公開(kāi)提供分析含有細(xì)胞的體液的方法，所述方法包括:用熒光染料將體液染色，其中熒光染料滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸以在細(xì)胞內(nèi)形成染料復(fù)合物；用來(lái)自能量源的能量照射染色體液；并且測(cè)量染色體液中的由染料復(fù)合物發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0007]在一些這類(lèi)方面，體液包含少于約20個(gè)細(xì)胞/微升。
[0008]在一些這類(lèi)方面，體液包含超過(guò)約20個(gè)細(xì)胞/微升。
[0009]在一些這類(lèi)方面，核酸選自DNA和RNA。
[0010]在一些這類(lèi)方面，能量源提供具有可見(jiàn)光譜中的波長(zhǎng)的單色光，并且其中單色光的波長(zhǎng)和熒光信號(hào)的波長(zhǎng)是不同的。
[0011]在一些這類(lèi)方面，與染料復(fù)合物相比，未結(jié)合熒光染料在用來(lái)自能量源的能量照射時(shí)發(fā)出較少熒光。
[0012]在一些這類(lèi)方面，在未結(jié)合至核酸時(shí)，未結(jié)合熒光染料在用來(lái)自能量源的能量照射時(shí)不發(fā)熒光，以使得沒(méi)有染料復(fù)合物的細(xì)胞不發(fā)出熒光信號(hào)。
[0013]在一些這類(lèi)方面，所述方法包括基于存在或不存在熒光染料來(lái)區(qū)分具有細(xì)胞核的細(xì)胞與沒(méi)有細(xì)胞核的細(xì)胞。
[0014]在一些這類(lèi)方面,測(cè)量涉及點(diǎn)計(jì)(enumerating,計(jì)算、計(jì)數(shù))和區(qū)分RBC和WBC。
[0015] 在一些這類(lèi)方面，所述方法在測(cè)量之前不涉及使RBC溶解(Iysing)。[0016]在一些這類(lèi)方面，體液包含完整WBC和RBC。
[0017]在一些這類(lèi)方面，測(cè)量使用自動(dòng)血液分析器、流式細(xì)胞儀或體液樣品的其它診斷分析器來(lái)執(zhí)行。
[0018]在一些這類(lèi)方面，測(cè)量包括使體液流經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的流槽(flow cell，流動(dòng)室)。
[0019]在一些這類(lèi)方面，熒光染料提供在進(jìn)一步包括水的組合物中。
[0020]在另一方面，本公開(kāi)提供分析流體的方法，其中所述流體含有少于約40個(gè)細(xì)胞/微升，所述方法包括:使流體與熒光染料接觸，其中熒光染料滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸以在細(xì)胞內(nèi)形成染料復(fù)合物；用來(lái)自能量源的能量照射流體；并且測(cè)量流體中的由染料復(fù)合物發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0021]在一些這類(lèi)方面，所述流體含有少于約20個(gè)細(xì)胞/微升。
[0022]在一些這類(lèi)方面，所述流體含有小于約5個(gè)細(xì)胞/微升。
[0023]在一些這類(lèi)方面，所述流體是體液。
[0024]在一些這類(lèi)方面，所述流體是生物流體。
[0025]在另一方面， 本公開(kāi)提供區(qū)分細(xì)胞的方法，所述方法包括:使細(xì)胞與包含熒光染料的溶液接觸，其中熒光染料是水溶性的，能夠滲透細(xì)胞膜，并且能夠結(jié)合至核酸；用來(lái)自激發(fā)光源的激發(fā)光照射細(xì)胞；并且測(cè)量來(lái)自細(xì)胞的光發(fā)射，并且基于測(cè)量來(lái)區(qū)分含有核酸的細(xì)胞與沒(méi)有核酸的細(xì)胞。
[0026]在另一方面，本公開(kāi)提供分析體液的組合物，所述組合物包括水和熒光染料，其中熒光染料是水溶性的，能夠滲透細(xì)胞膜，并且能夠結(jié)合至核酸。
[0027]在另一方面，本公開(kāi)提供血液學(xué)系統(tǒng)，其包括:用于保持將要分析的樣品的樣品保持器；用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器；用于存儲(chǔ)染色組合物的存儲(chǔ)容器，其中染色組合物包含能夠滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料，并且其中染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光；流槽；用于將電磁能施加至流槽的至少一個(gè)能量源；用于檢測(cè)來(lái)源于流槽內(nèi)的熒光的一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器；和用于檢測(cè)散射的可見(jiàn)光的一個(gè)或多個(gè)可見(jiàn)光檢測(cè)器。
[0028]在一些這類(lèi)方面，所述系統(tǒng)包括抽吸機(jī)構(gòu)，其用于將至少一部分將要分析的樣品從樣品保持器抽吸至混合容器。
[0029]在一些這類(lèi)方面，所述系統(tǒng)包括抽吸機(jī)構(gòu)，其用于將染色組合物從存儲(chǔ)容器抽吸至混合容器。
[0030]在一些這類(lèi)方面，至少一個(gè)能量源提供波長(zhǎng)λ I下的單色光。
[0031]在一些這類(lèi)方面，當(dāng)染料結(jié)合至核酸時(shí)，染料吸收波長(zhǎng)λ I下的光并且發(fā)出波長(zhǎng)λ 2下的光。
[0032]在一些這類(lèi)方面，檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)λ 2下的光。
[0033]在一些這類(lèi)方面，所述系統(tǒng)包括用于提供非單色可見(jiàn)光的至少一個(gè)額外能量源。
[0034]在一些這類(lèi)方面，將要分析的樣品是體液。
[0035]在另一方面，本公開(kāi)提供用于制備血液學(xué)系統(tǒng)的方法，該方法包括:提供用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器；提供用于存儲(chǔ)染色組合物的存儲(chǔ)容器，其中染色組合物包含能夠滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料，并且其中染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光；提供流槽；定位用于將電磁能提供至流槽的能量源；定位用于檢測(cè)從流槽內(nèi)發(fā)出的熒光的檢測(cè)器。
[0036]在另一方面，本公開(kāi)提供制備用于分析體液的容器的方法，所述方法包括將包含能夠滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料的組合物添加至容器，其中染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光，并且其中容器是血液學(xué)系統(tǒng)的一體化或模塊化部分。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1提供本文描述的體液分析方法的方面的示意性圖像。在DNA-染料相互作用和隨后發(fā)出熒光后，WBC與RBC分離。熒光信息，以及其它光學(xué)散射信號(hào)，用于體液樣品的細(xì)胞分析。FLl指示用530±20nm帶通濾波器來(lái)收集的熒光。ALL和IAS是分別在O至I度和3至10度收集的光散射信號(hào)。
[0038]圖2A是體液樣品的細(xì)胞分析的散布圖(ALL相比于IAS)。WBC = 89/ μ L(參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (參考=1733/μ L)。
[0039]圖2B是體液樣品的細(xì)胞分析的散布圖(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在熒光(FLl)中完全分離。WBC = 89/μ L(參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L(參考=1733/μ L)。
[0040]圖3A是另一個(gè)體液樣品的細(xì)胞分析的散布圖(ALL相比于IAS)。WBC = 0.95/μ L (參考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L (參考=122/μ L)。 [0041]圖3B是另一個(gè)體液樣品的細(xì)胞分析的散布圖(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在熒光(FLl)中完全分離。WBC = 0.95/μ L(參考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L(參考=122/μ L)。
[0042]圖4A是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第一稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0043]圖4Β是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第二稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0044]圖4C是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第三稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0045]圖4D是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第四稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0046]圖4Ε是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第五稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0047]圖4F是血沉棕黃層樣品的六個(gè)水平連續(xù)稀釋的第六稀釋的FLl相比于IAS散布圖。原始血沉棕黃層樣品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六個(gè)水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分別基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀釋來(lái)制
備。所有樣品使用稀釋液在原型分析器上測(cè)量。
[0048]圖5提供所有六個(gè)水平的稀釋血沉棕黃層樣品(A)和僅三個(gè)低端樣品(B)之間的WBC(測(cè)量相比于計(jì)算)的相關(guān)圖。每個(gè)水平下的多個(gè)點(diǎn)指示執(zhí)行多個(gè)操作?？傮w相關(guān)性為:對(duì)于所有六個(gè)水平來(lái)說(shuō)，Y=L 0239Χ-4.9 (R2 = 0.9984)，并且對(duì)于具有最低細(xì)胞濃度的三個(gè)水平來(lái)說(shuō)，Y=L 0787Χ-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0049]圖6提供91個(gè)體液樣品的WBC(當(dāng)前方法相比于參考)的相關(guān)圖。相關(guān)性在不同范圍中作圖:(A)完全范圍(約 40，000/μ L)，(B)〈2，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。稀釋比是1:35(樣本相比于標(biāo)記試劑)。 [0050]圖7提供91個(gè)體液樣品的RBC (當(dāng)前方法相比于參考)的相關(guān)圖。相關(guān)性在不同范圍中作圖:(A)完全范圍(約 200，000/μ L)，(B)〈3，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。具有許多RBC影的樣品未包括于相關(guān)分析中。稀釋比是1:35(樣本相比于標(biāo)記試劑)。
[0051]圖8是具有極低細(xì)胞濃度(WBC〈50/ μ L)的72個(gè)體液樣品的WBC(發(fā)明方法相比于參考)的相關(guān)圖表。稀釋比是1:10(樣本相比于標(biāo)記試劑)。
[0052]圖9是具有極低細(xì)胞濃度(RBC〈50/ μ L)的38個(gè)體液樣品的RBC (當(dāng)前方法相比于參考)的相關(guān)圖表。具有許多RBC影的樣品未包括于相關(guān)分析中。稀釋比是1:10(樣本相比于標(biāo)記試劑)。
【具體實(shí)施方式】
[0053]定義
[0054]除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管類(lèi)似于或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但是本文描述了代表性的說(shuō)明性方法和材料。應(yīng)理解的是，如果有矛盾，本公開(kāi)內(nèi)容取代所并入公開(kāi)文獻(xiàn)的任何公開(kāi)內(nèi)容。
[0055]應(yīng)注意的是，如本文所用并且在隨附權(quán)利要求中，除非上下文清楚地另外指出，否則單數(shù)形式“一個(gè)/種(a/an)”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。還應(yīng)注意，所述權(quán)利要求可以起草為排除任何任選的要素。因此，對(duì)于使用諸如“唯一”、“僅”等與權(quán)利要求要素的敘述相關(guān)的排他性術(shù)語(yǔ)或使用“負(fù)面”限制而言，該敘述旨在起到前提基礎(chǔ)的作用。
[0056]術(shù)語(yǔ)“典型地”用于指示本發(fā)明的通常做法。此術(shù)語(yǔ)指示這類(lèi)公開(kāi)對(duì)于本發(fā)明的材料和方法來(lái)說(shuō)是示例性的，而不是必需的(除非另外指示)。因此，術(shù)語(yǔ)“典型地”應(yīng)理解為“典型地，但是不一定”。類(lèi)似地，如在任選存在的材料或組分中，術(shù)語(yǔ)“任選地”指示本發(fā)明包括材料或組分存在的情況，也包括材料或組分不存在的情況。
[0057]如本文使用，術(shù)語(yǔ)“體液”是指存在或從動(dòng)物獲得的流體，包括流體如腦脊液、腹膜液、心包液、胸膜液、滑液、尿液、唾液、眼淚、精液、羊膜水、痰等，以及從包囊、腫瘤等獲得的流體。除非另外規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)“體液”不包括全血，雖然體液可含有紅細(xì)胞(RBC)和/或白細(xì)胞(WBC)。[0058]在一些方面，本公開(kāi)提供分析具有低細(xì)胞計(jì)數(shù)的流體的方法和材料。低細(xì)胞計(jì)數(shù)是指流體具有少于約100個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約80個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約60個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約40個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約30個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約20個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約10個(gè)細(xì)胞/微升，或少于約5個(gè)細(xì)胞/微升。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)低細(xì)胞計(jì)數(shù)是濃度較高原始樣品的稀釋結(jié)果。在其它實(shí)施方案中，這類(lèi)低細(xì)胞計(jì)數(shù)是將要分析的流體的自然特性(即，不需要稀釋以獲得低細(xì)胞計(jì)數(shù))。
[0059]在一些實(shí)施方案中，將要使用本文描述的方法和材料來(lái)分析的流體選自體液。在其它實(shí)施方案中，將要分析的流體在性質(zhì)上是生物的，但是并非體液。在一些實(shí)施方案中，將要分析的流體是“合成的”，意指細(xì)胞群體添加至流體，其中流體生物學(xué)相容但是不是細(xì)胞通常發(fā)現(xiàn)于其中的流體。這類(lèi)流體的實(shí)例包括緩沖水溶液等。
[0060]材料
[0061]在一些實(shí)施方案中 ，所感興趣的方法涉及使細(xì)胞群體與適合于幫助細(xì)胞的所需表征的標(biāo)記組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記組合物包括突光染料，并且任選地進(jìn)一步包括如本文以下描述的那些額外組分。標(biāo)記組合物的組分和這類(lèi)組分的相對(duì)濃度可根據(jù)預(yù)定用途的需要和要求來(lái)改變。在存在或不存在染料的情況下，標(biāo)記組合物可替代地在本文中稱(chēng)為“試劑”。
[0062]所感興趣的方法和材料涉及熒光染料(在本文中也稱(chēng)為“染料”)。熒光染料可為具有執(zhí)行所感興趣的方法需要或合適特性的任何合適染料。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，染料是水溶性的。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，熒光染料具有至少I(mǎi) μ g/L或至少5μ g/L或至少10 μ g/L或至少20 μ g/L或至少50 μ g/L的水溶性。在一些實(shí)施方案中，染料在水溶液中是穩(wěn)定的，意指染料在適合于本文描述的分析方法的時(shí)間尺度內(nèi)不顯著降解。舉例來(lái)說(shuō)，染料在周?chē)鷾囟?例如，近似20-25°C )下、在緩沖水溶液(例如，細(xì)胞試劑)中穩(wěn)定至少30分鐘，或至少I(mǎi)小時(shí)或至少6小時(shí)，或至少12小時(shí)，或至少24小時(shí)，或至少2天，或至少7天，或至少I(mǎi)個(gè)月。還例如，染料在冷藏(例如，低于近似10°C )下、在緩沖水溶液(例如，細(xì)胞試劑)中穩(wěn)定至少I(mǎi)小時(shí)，或至少12小時(shí)，或至少24小時(shí)，或至少2天，或至少7天，或至少I(mǎi)個(gè)月，或至少6個(gè)月，或至少12個(gè)月。
[0063]在一些實(shí)施方案中，染料能夠滲透細(xì)胞膜，如血細(xì)胞的壁等。在一些實(shí)施方案中，一旦在細(xì)胞內(nèi)部,染料進(jìn)一步能夠滲透細(xì)胞核。
[0064]在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合至核酸。在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合至DNA。在一些實(shí)施方案中，所感興趣的染料結(jié)合至DNA但是不結(jié)合至RNA。在一些實(shí)施方案中，所感興趣的染料優(yōu)先結(jié)合至DNA而非RNA。在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合至DNA分子涉及氫鍵合或另一種非共價(jià)相互作用。在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合至DNA的單鏈或雙鏈DNA復(fù)合物的單鏈。在一些實(shí)施方案中，染料結(jié)合至雙鏈DNA復(fù)合物的兩個(gè)鏈。
[0065]在本說(shuō)明書(shū)通篇，結(jié)合至DNA的染料被稱(chēng)為染料復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，染料以高親和力和高結(jié)合常數(shù)來(lái)結(jié)合至DNA。在一些實(shí)施方案中，并且如本文中提到，染料的親和力和濃度足夠大以致于染料足以“染色”(在滲透和DNA結(jié)合后)至少250，000個(gè)細(xì)胞/微升。
[0066]在一些實(shí)施方案中，染料是發(fā)熒光的。因此，染料吸收一個(gè)波長(zhǎng)或圍繞峰吸收波長(zhǎng)(也稱(chēng)為峰激發(fā)波長(zhǎng))的一組波長(zhǎng)下的入射光，并且發(fā)出另一個(gè)波長(zhǎng)或圍繞峰發(fā)射波長(zhǎng)的一組波長(zhǎng)下的光。在一些實(shí)施方案中，峰吸收波長(zhǎng)不同于峰發(fā)射波長(zhǎng)。此外，在一些實(shí)施方案中，峰吸收波長(zhǎng)和/或峰發(fā)射波長(zhǎng)取決于染料環(huán)境。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，結(jié)合至DNA的染料(即，染料復(fù)合物)的峰吸收波長(zhǎng)和/或峰發(fā)射波長(zhǎng)不同于未結(jié)合染料的峰吸收波長(zhǎng)和/或峰發(fā)射波長(zhǎng)。
[0067]在一些實(shí)施方案中，染料復(fù)合物的峰吸收波長(zhǎng)和峰發(fā)射波長(zhǎng)不同達(dá)至少10nm，或至少15nm,或至少20nm,或至少25nm,或至少30nm,或至少35nm,或至少40nm,或至少45nm,或至少50nm。在一些實(shí)施方案中，染料復(fù)合物的峰吸收波長(zhǎng)在400_700nm范圍內(nèi)。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，峰吸收在425-550nm范圍內(nèi)，或在450_525nm范圍內(nèi)，或在475-500nm范圍內(nèi)，或在480_495nm范圍內(nèi)，或在485_490nm范圍內(nèi)。還例如，在一些實(shí)施方案中，峰吸收在500-700nm范圍內(nèi)，或在550_675nm范圍內(nèi)，或在600_650nm范圍內(nèi)，或在620_640nm 范圍內(nèi)。
[0068]在一些實(shí)施方案中，染料復(fù)合物的峰發(fā)射波長(zhǎng)在425_800nm范圍內(nèi)，如在425-700nm范圍內(nèi)。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，峰發(fā)射在450_650nm范圍內(nèi)，或在475-625nm范圍內(nèi)，或在500_550nm范圍內(nèi)，或在510_540nm范圍內(nèi)，或在520_530nm范圍內(nèi)。
[0069]舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，熒光染料選自噻唑橙或1-甲基-4_[(3-甲基-2-(3H)_苯并噻唑亞基)甲基]喹啉鎗對(duì)甲苯磺酸鹽、噻唑藍(lán)、4-[(3_甲基-2-(3H)_苯并噻唑亞基)甲基]-1-[3-(三甲基銨)丙基]喹啉鎗二碘化物、3，3’-二甲基氧雜碳菁碘化物或3-甲基-2-[3 (3-甲基-2 (3H)-苯并噻唑亞基-1-丙烯基]苯并噁唑碘化物、硫黃素T、染色劑SYTO?和TOTO? (Life Technologies)、溴化乙錠、碘化丙啶、吖啶橙、科里膦O、金胺O、染色劑H0ECHST33258 (2’ - (4-羥苯基)-5- (4甲基-1-哌嗪基)-2，5’ -雙-1H-苯并咪唑三鹽酸鹽水合物)和H0ECHST 33342? (2’-(4-乙氧苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2，5’-雙- 1H-苯并咪唑三鹽酸鹽)、4’6-二氨基-2-苯基吲哚鹽酸鹽(DAPI)、4’，6-( 二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚鹽酸鹽(DIPI)、7_氨基放線菌素D、放線菌素D和LDS751 (2- (4- (4- 二甲氨基苯基)-1，3- 丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑聞氯酸鹽)、或以商標(biāo)SYBR? (Life Technologies，例如 SYBR Green、SYBR Gold、SYBRll 等)出售的染料等。
[0070]在一些實(shí)施方案中，除了如上所述染料以外，所感興趣的標(biāo)記組合物進(jìn)一步包括以下段落中識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)組分。應(yīng)認(rèn)識(shí)到以下列表只是代表性的，并且在需要時(shí)可使用化學(xué)和/或生物學(xué)等效材料來(lái)進(jìn)行取代。
[0071]在一些實(shí)施方案中,標(biāo)記組合物含有表面活性劑或洗滌劑?？墒褂秒x子和中性表面活性劑。舉例來(lái)說(shuō)，可使用兩性離子表面活性劑如類(lèi)固醇糖苷(例如，Big CHAP,Big DoxyCHAP等)和吡喃葡萄糖苷，以及在本領(lǐng)域中已知的其它表面活性劑。表面活性劑可以任何合適量存在于標(biāo)記組合物中，如0.0001-0.1% (w/v)。
[0072]在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記組合物進(jìn)一步含有緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑。緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括但不限于PBS、MOPS和HEPES。緩沖劑或pH調(diào)節(jié)劑的額外實(shí)例包括:酸如鹽酸、氫溴酸、醋酸、磷酸等；堿如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、有機(jī)胺(例如咪唑、三乙基胺等)及其類(lèi)似物；和鹽如氯化鈉、氯化鈣等。舉例來(lái)說(shuō)，有機(jī)緩沖劑材料如咪唑可以約0.001-3% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在于標(biāo)記組合物中。還例如，無(wú)機(jī)材料如HCl可以約0.001-5% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。類(lèi)似地，鹽如NaCl可以約0.001-3% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。如前所述，這類(lèi)材料的等效物是已知的并且可在適當(dāng)情況下取代。
[0073]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法和材料進(jìn)一步涉及必要或需要的額外組分。這類(lèi)額外組分的實(shí)例包括著色劑、防腐劑、抗微生物劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和輔溶劑。
[0074]舉例來(lái)說(shuō),可存在抗微生物劑如Proclin (例如,Proclinl50、200、300等)、萬(wàn)古霉素、青霉素等。抗微生物劑可以約0.001-0.5% (w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。
[0075]在一些實(shí)施方案中，可在制備所感興趣的標(biāo)記組合物期間制成各種組分的儲(chǔ)備溶液。舉例來(lái)說(shuō)，可制成任何組分(例如，染料化合物等)的儲(chǔ)備溶液，以例如幫助溶解組分或精確地測(cè)量組分體積。儲(chǔ)備溶液可使用水作為溶劑，或使用有機(jī)溶劑如二甲亞砜、異丙醇、乙醇或甲醇，或使用其組合來(lái)制成。
[0076]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法和材料涉及以上識(shí)別組分的水溶液。應(yīng)認(rèn)識(shí)到存在于標(biāo)記組合物中的各種組分的濃度可根據(jù)預(yù)定用途來(lái)變化。以上和以下段落提供存在于標(biāo)記組合物中的材料濃度的一些準(zhǔn)則。如在本文中指示，在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記組合物與將要分析的流體(例如，體液)組合。因此，雖然本文提供的準(zhǔn)則涉及如存在于標(biāo)記組合物中的各種組分的量，應(yīng)認(rèn)識(shí)到這類(lèi)準(zhǔn)則也可適用于標(biāo)記組合物與將要分析的流體的組合(即，在一些實(shí)施方案中，如在本文描述的血液分析器中實(shí)際上分析的材料含有類(lèi)似百分比和相對(duì)量的各種組分)。
[0077]在一些實(shí)施方案中，染料以預(yù)定濃度存在于標(biāo)記組合物中。應(yīng)認(rèn)識(shí)到預(yù)定濃度可取決于染料特性(即，化學(xué)結(jié)構(gòu)、對(duì)于核酸目標(biāo)的結(jié)合親和力等)以及所使用的分析器的操作參數(shù)而變化。在一些實(shí) 施方案中，染料組分以至少染色存在于體液中的細(xì)胞量的所需量存在，如10個(gè)細(xì)胞/微升或更多，或50個(gè)細(xì)胞/微升或更多。舉例來(lái)說(shuō)，染料以染色100，000個(gè)細(xì)胞/微升或更多，或200，000個(gè)細(xì)胞/微升或更多，或250，000個(gè)細(xì)胞/微升或更多的所需量存在。在一些實(shí)施方案中，存在的染料化合物的量在0.000001-0.5%，或0.00001-0.5%，或 0.0001-0.5%，或 0.001-0.1% (w/v)范圍內(nèi)。
[0078]在一些實(shí)施方案中，有機(jī)緩沖劑存在于標(biāo)記組合物中。這類(lèi)材料的實(shí)例包括有機(jī)胺，如三乙胺、三甲胺，和環(huán)胺如咪唑等。有機(jī)緩沖劑(與任何其它緩沖劑)可以產(chǎn)生和保持分析物組合物中的所需PH的所需量存在。
[0079]在一些實(shí)施方案中，含有所感興趣的染料的標(biāo)記組合物等滲或大致上等滲(即，等滲的約20%內(nèi)，或等滲的約10%內(nèi)，或等滲的約5%內(nèi))。在一些實(shí)施方案中，含有所感興趣的染料的標(biāo)記組合物具有中性PH或大致上中性pH(即，在約6-8，或約6.5-7.5的pH范圍內(nèi))。標(biāo)記組合物的這些特性有助于減少樣品制備和分析期間對(duì)于任何類(lèi)型的細(xì)胞的破壞，因此導(dǎo)致體液樣品的更精確細(xì)胞分析。
[0080]方法
[0081]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法涉及使細(xì)胞群體與標(biāo)記組合物接觸。在一些此類(lèi)實(shí)施方案中，接觸涉及使標(biāo)記組合物與含有將要分析的細(xì)胞的流體(例如，體液)混合。因此，在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法涉及將含有細(xì)胞的流體樣品用標(biāo)記組合物稀釋?zhuān)渲袠?biāo)記組合物包括水和染料，并且任選地包括如本文提供的那些其它組分。在一些此類(lèi)實(shí)施方案中，所述方法涉及預(yù)定稀釋比下的單一稀釋步驟(即將標(biāo)記組合物添加至流體樣品僅一次)，所述稀釋比提供用于熒光檢測(cè)和測(cè)量的分析物的最佳濃度。
[0082]在一些實(shí)施方案中，因?yàn)樗信d趣的染料結(jié)合至DNA，所以沒(méi)有DNA的細(xì)胞在暴露于染料時(shí)不能夠形成染料復(fù)合物。因此，暴露于染料的沒(méi)有DNA的細(xì)胞在使用本文描述的方法分析時(shí)(例如，在暴露于熒光激發(fā)能量源時(shí))不展現(xiàn)染料復(fù)合物的發(fā)射特性或由于自體熒光只發(fā)射最少或微弱熒光。相比之下，含有DNA的細(xì)胞能夠形成染料復(fù)合物。在用所感興趣的染料染色時(shí)，這類(lèi)細(xì)胞在使用本文描述的方法分析時(shí)展現(xiàn)染料復(fù)合物的發(fā)射特性?？紤]到此區(qū)別，在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法提供區(qū)分含有DNA的細(xì)胞與沒(méi)有DNA的細(xì)胞的手段。在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法還提供區(qū)分含有細(xì)胞核的細(xì)胞與沒(méi)有細(xì)胞核的細(xì)胞的手段，尤其在細(xì)胞核含有DNA時(shí)。在一些實(shí)施方案中，基于熒光測(cè)量來(lái)提供區(qū)分，所述熒光測(cè)量觀察到來(lái)自細(xì)胞的熒光(指示存在DNA并且可能指示存在細(xì)胞核)或未觀察到熒光細(xì)胞(指示沒(méi)有DNA并且可能指示細(xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核)。另外，存在于所分析的流體中的非細(xì)胞事件(例如，沒(méi)有DNA的非細(xì)胞對(duì)象)通過(guò)不存在特有熒光發(fā)射來(lái)區(qū)分。
[0083]舉例來(lái)說(shuō)，在RBC暴露于染料，成熟RBC (沒(méi)有細(xì)胞核并且沒(méi)有DNA)不形成染料復(fù)合物。因此，在使用本文描述的方法分析時(shí)，暴露于染料的RBC不展現(xiàn)染料復(fù)合物的發(fā)射特性。相比之下，WBC含有細(xì)胞核和DNA，并且因此在暴露于染料時(shí)形成染料復(fù)合物。因此，在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法允許在含有這類(lèi)細(xì)胞的樣品中區(qū)分WBC與RBC。區(qū)分基于存在或不存在指示形成染料復(fù)合物的熒光信號(hào)。
[0084]除了如上所述的區(qū)分以外，所感興趣的染料與DNA之間的染料復(fù)合物的形成還允許在含有細(xì)胞的流體樣品中點(diǎn)計(jì)含有DNA的細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，所感興趣的方法包括在含有這類(lèi)細(xì)胞的流體樣品中點(diǎn)計(jì)WBC。點(diǎn)計(jì)基于在適合于計(jì)數(shù)細(xì)胞的方法中觀察到指示形成染料復(fù)合物的熒光。合適方法包括自動(dòng)血液學(xué)分析器如流式細(xì)胞儀和其它基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
[0085]如在本文中提到，所感興趣的方法允許在含有WBC和其它對(duì)象(例如，RBC和非細(xì)胞事件)的樣品中點(diǎn)計(jì)和區(qū)分WBC。在一些實(shí)施方案中，樣品是流體如體液，并且含有極低濃度細(xì)胞，如在本文中更詳 細(xì)地描述。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的方法進(jìn)一步允許使用多角度散射技術(shù)將WBC分類(lèi)成2部分、3部分或5部分區(qū)分。在某些實(shí)施方案中，RBC可使用多角度散射技術(shù)來(lái)進(jìn)一步與其它非RBC顆粒分離。
[0086]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法不涉及溶解劑并且在記錄數(shù)據(jù)之前不涉及使細(xì)胞溶解。舉例來(lái)說(shuō)，所感興趣的方法在分析流體樣品之前不涉及將溶解劑添加至含有細(xì)胞的流體樣品。因此，在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記組合物不含有溶解劑。所分析的流體樣品不是溶解產(chǎn)物并且不含有經(jīng)由溶解從細(xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)含物。在一些實(shí)施方案中，將要分析的流體樣品含有完整RBC并且這類(lèi)RBC在熒光測(cè)量之前未溶解。“溶解劑”意欲包括導(dǎo)致顯著細(xì)胞溶解，尤其(但是不限于)RBC溶解的任何材料。溶解劑包括但不限于本領(lǐng)域中已知或后來(lái)發(fā)現(xiàn)的各種類(lèi)型的表面活性劑、酶、抗體、PH調(diào)整劑、滲透劑(滲透壓調(diào)整劑)等。
[0087]因?yàn)槿芙鈩┎簧婕皩⒁治龅牧黧w樣品的制備，所以存在于流體中的WBC不受損，如果使用溶解劑，則其會(huì)或可能受損。這在含有WBC的體液中是尤其有利的，因?yàn)榕c全血中的WBC相比，其中包含的WBC通常更脆弱。
[0088]如上所述，在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法涉及用預(yù)定量標(biāo)記組合物稀釋以提供所需稀釋比和所需分析物濃度。預(yù)定量可基于用于分析流體樣品的設(shè)備中的檢測(cè)極限來(lái)確定。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)極限通過(guò)相對(duì)于樣品注入速率(相對(duì)于流槽速率)、測(cè)量持續(xù)時(shí)間等來(lái)調(diào)整而進(jìn)行優(yōu)化。舉例來(lái)說(shuō)，具有1:10 (血液:試劑)稀釋比、4.0微升/秒注入速率和60秒樣品測(cè)量(數(shù)據(jù)收集)的原型分析器導(dǎo)致收集10個(gè)細(xì)胞/微升的樣品的近似240個(gè)事件，其足以支持精確細(xì)胞分析。
[0089]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法適合于分析具有WBC的任何流體樣品。如前所述，這類(lèi)流體樣品包括體液，并且也包括其它流體樣品，如細(xì)胞的制備水溶液，基于植物和從植物獲得的溶液等，尤其當(dāng)這類(lèi)樣品流體含有低細(xì)胞計(jì)數(shù)(例如，少于40個(gè)細(xì)胞/微升，或少于30個(gè)細(xì)胞/微升等)。
[0090]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法提供在含有WBC并且任選地含有RBC的樣品流體中點(diǎn)計(jì)和區(qū)分WBC的簡(jiǎn)單、可靠和精確手段。使用自動(dòng)血液學(xué)分析器的熒光檢測(cè)確保精確度和可靠性，并且使用單一步驟稀釋提供樣品制備的簡(jiǎn)單性。含有細(xì)胞的樣品流體用標(biāo)記組合物中包含的熒光標(biāo)記來(lái)染色，其中熒光標(biāo)記滲透細(xì)胞壁并且結(jié)合至DNA以產(chǎn)生染料復(fù)合物。染色WBC發(fā)出指示染料復(fù)合物的熒光發(fā)射信號(hào)，而RBC不發(fā)出這類(lèi)信號(hào)或發(fā)出顯著較低強(qiáng)度的這類(lèi)信號(hào)。標(biāo)記組 合物不含溶解劑并且沒(méi)有溶解劑添加至樣品流體，從而保護(hù)所存在的WBC。最佳檢測(cè)極限通過(guò)調(diào)整變量包括樣品流速、檢測(cè)頻率等來(lái)確定。
[0091]分析WBC的方法和執(zhí)行這類(lèi)方法的系統(tǒng)的額外方面可發(fā)現(xiàn)于2011年5月4日提交的共同待決美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)61/482，541，以及2011年5月4日提交的共同待決美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)61/482，549中，其公開(kāi)內(nèi)容以引用方式整體并入本文。
[0092]輸出和優(yōu)勢(shì)
[0093]在一些實(shí)施方案中，分析染色流體產(chǎn)生適合于多維度數(shù)據(jù)分析、圖表等的各種信息。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，本文描述的方法提供精確總WBC計(jì)數(shù)。在一些實(shí)施方案中，所述方法提供關(guān)于樣品中的不同類(lèi)型WBC的相對(duì)比例(例如，嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和/或單核細(xì)胞或其各種組合的細(xì)胞計(jì)數(shù))的數(shù)據(jù)。這類(lèi)數(shù)據(jù)可用作例如治療患者的診斷信息。
[0094]如在本文中提到，在一些實(shí)施方案中，所感興趣的方法涉及通過(guò)引入染料來(lái)將流體樣品中的WBC選擇性染色，所述染料選擇性結(jié)合至DNA并且在以這種方式結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。因此，染色樣品流體的分析包括與來(lái)源于沒(méi)有染料復(fù)合物的細(xì)胞(例如，RBC)的微弱或不存在的熒光發(fā)射比較，記錄到來(lái)源于含有染料復(fù)合物的細(xì)胞(例如，WBC)的更強(qiáng)的熒光發(fā)射。熒光測(cè)量可使用，例如，多通道光學(xué)散射分析器來(lái)獲得。
[0095]在一些實(shí)施方案中，所感興趣的材料和方法允許體液和適用于例如醫(yī)用診斷的其它流體的細(xì)胞分析。通過(guò)本文中的方法能夠進(jìn)行具有極低細(xì)胞計(jì)數(shù)(例如，少于40/μ L，或少于lO/yL等)的流體樣品的細(xì)胞分析，包括具有特別脆弱細(xì)胞的體液。所述方法的簡(jiǎn)單性允許從患者抽取樣品之后1-2小時(shí)內(nèi)分析這類(lèi)樣品，從而也有助于分析脆弱細(xì)胞。本文描述的組合物和方法中不存在細(xì)胞溶解劑進(jìn)一步增加分析含有脆弱細(xì)胞的樣品的能力。所感興趣的流體中的脆弱細(xì)胞的破壞潛在地導(dǎo)致不精確的分析如不精確的細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞區(qū)分。
[0096]本文描述的方法提供的最佳稀釋比率是優(yōu)于傳統(tǒng)血液學(xué)分析的進(jìn)一步改進(jìn)。舉例來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)血液學(xué)分析器所使用的稀釋比率(即對(duì)于RBC稀釋來(lái)說(shuō)血液:稀釋劑=1:300)不足夠敏感以支持測(cè)量具有極低細(xì)胞濃度的樣品。相比之下，在一些實(shí)施方案中，本文中的方法允許單一稀釋提供最佳熒光檢測(cè)的最佳稀釋比。
[0097]本公開(kāi)的方法是簡(jiǎn)單的，例如，在一些實(shí)施方案中，只需要單一試劑和單一稀釋。在一些實(shí)施方案中，稀釋比率可容易地調(diào)整和/或優(yōu)化。此外，本公開(kāi)的方法簡(jiǎn)單實(shí)施，并且可在不需要廣泛調(diào)整和/或修改的情況下例如在傳統(tǒng)血液分析器上執(zhí)行。
[0098]基于本文提供的公開(kāi)內(nèi)容，包括以下實(shí)施例，這些和其它優(yōu)勢(shì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知的。
[0099]實(shí)施例
[0100]一般試驗(yàn)程序:(A)改變CELL-DYN Sapphire血液分析器的流動(dòng)腳本和算法以允許它用于體液測(cè)定。(B)所有體液(BF)測(cè)定使用(稍微改變)WBC擴(kuò)展計(jì)數(shù)模式來(lái)進(jìn)行:BF樣品抽吸(約120 μ L)，隨后樣品(BF)與試劑(Sapphire網(wǎng)織紅細(xì)胞試劑)混合，比率為I比35，隨后將混合樣品孵育(40°C x25秒)，隨后將孵育樣品傳輸至流槽以測(cè)量(32秒測(cè)量)，隨后數(shù)據(jù)收集，原始數(shù)據(jù)記錄為.fcs文件，隨后使用軟件如FCS Express來(lái)分析原始數(shù)據(jù)。
[0101]所有參考結(jié)果使用標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)腔室計(jì)數(shù)程序來(lái)測(cè)量。
[0102]試劑使用以下組分和濃度來(lái)配制:
[0103]
13?濃度1

咪唑0.3400%

IN HCl2.5325%

NaCl0.6800%
Proclin300 0.0315%
BIGCHAP 0.0050%
SYBRll 0.0002%
DMSO20.0220%


至 100%
[0104]1IV0= lg/1 OOmL
[0105]2DMSO (二甲亞砜)用于制得染料組分的儲(chǔ)備溶液。
[0106]實(shí)施例1
[0107]分析低細(xì)胞計(jì)數(shù)樣品
[0108]具有1:35 (血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測(cè)量(數(shù)據(jù)收集)的原型分析器導(dǎo)致收集10細(xì)胞/微升的樣品的超過(guò)20個(gè)事件。
[0109]圖2A和2B展示體液樣品的細(xì)胞分析的散點(diǎn)圖。細(xì)胞在分析之后加以點(diǎn)計(jì):WBC=89/μ L (參考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (參考=1733/μ L)。圖 3Α 和 3B 展示另一個(gè)體液樣品的細(xì)胞分析的散點(diǎn)圖。細(xì)胞在分析之后加以點(diǎn)計(jì)=WBC = 0.95/μ L(參考=0.33/μ L) ；RBC = 142/μ L (參考=122/μ L)。[0110]實(shí)施例2
[0111]分析極低細(xì)胞計(jì)數(shù)樣品
[0112]在使用稀釋血沉棕黃層樣品的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)極限。使用連續(xù)稀釋來(lái)制備六個(gè)水平的稀釋血沉棕黃層樣品。六個(gè)水平稀釋血沉棕黃層樣品的FLl相比于IAS散點(diǎn)圖展示于圖4A-4F。圖5展示W(wǎng)BC的相關(guān)性(測(cè)量相比于計(jì)算)。獲得很好相關(guān)性:(A)對(duì)于所有六個(gè)水平來(lái)說(shuō)，Y = 1.0239X-4.9 (R2 = 0.9984)，并且(B)對(duì)于具有最低細(xì)胞濃度的三個(gè)水平來(lái)說(shuō)，Y=L 0787X-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0113]實(shí)施例3
[0114]1: 35稀釋比的體液樣品的細(xì)胞分析
[0115]進(jìn)行綜合體液研究以評(píng)估本文提供的方法。總共91個(gè)體液樣本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:35(血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測(cè)量(數(shù)據(jù)收集)來(lái)進(jìn)行測(cè)量和分析。WBC和RBC的參考值通過(guò)手動(dòng)腔室計(jì)數(shù)來(lái)獲得。
[0116]在如上所述方法與參考方法之間獲得WBC的極好相關(guān)性(圖6) =(A)Y = 1.1305X-9.8411，R2 = 0.997(完全范圍，多達(dá)近似 40，000/μ L) ； (B) Y = 1.017Χ+7.1395，R2=0.9765 ?2, 000/μ L) ； (C)Y = 1.0899X+1.1253, R2 = 0.9663 ?200/μ L)；和(D)Y =
1.149X+1.1461，R2 = 0.8459 (〈50/μ L)。在如上所述方法與參考方法之間獲得RBC的很好相關(guān)性(圖 7) =(A)Y = 0.8996X+403.62, R2 = 0.9595 (完全范圍，多達(dá)近似 200，000/μ L) ； (B) Y = 1.0833Χ-11.427, R2 = 0.9513 ?3, 000/μ L) ； (C) Y = 0.979X-1.0747，R2 =
0.8284 ?200/μ L);和(D) Y = 0.9994X+0.5951，R2 = 0.6917 (〈50/μ L)。對(duì)于 RBC 分析，具有許多RBC影的樣品未包括于相關(guān)分析中。
[0117]實(shí)施例4
[0118]1:10稀釋比的體液樣品的細(xì)胞分析
[0119]進(jìn)行另一個(gè)綜合體液研究以評(píng)估本文提供的方法。總共155個(gè)體液樣本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:10(血液:試劑)稀釋比、2.3微升/秒注入速率和32秒樣品測(cè)量(數(shù)據(jù)收集)來(lái)進(jìn)行測(cè)量和分析。WBC和RBC的參考值通過(guò)手動(dòng)腔室計(jì)數(shù)來(lái)獲得。
[0120]甚至對(duì)于具有低端WBC濃度的樣品，在如上所述方法與參考方法之間獲得WBC的極好相關(guān)性(圖 8):Y = 1.1327Χ+1.1937，R2 = 0.8195 (WBC<50/μ L, 72 個(gè)樣品)。甚至對(duì)于具有低端RBC濃度的樣品，在如上所述方法與參考方法(圖9)之間獲得WBC的很好相關(guān)性:Y = 0.8244Χ+0.6128，R2 = 0.7465 (RBC〈50/ μ L, 38 個(gè)樣品)。對(duì)于 RBC 分析，具有許多RBC影的體液樣品未包括于相關(guān)分析中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于分析含有細(xì)胞的體液的方法，所述方法包括: 用熒光染料將所述體液染色，其中所述熒光染料滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸以在所述細(xì)胞內(nèi)形成染料復(fù)合物； 用來(lái)自能量源的能量照射所述染色體液；并且 測(cè)量所述染色體液中的由所述染料復(fù)合物發(fā)出的熒光信號(hào)。
2.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述體液包含少于約20個(gè)細(xì)胞/微升。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述體液包含大于約20個(gè)細(xì)胞/微升。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述能量源產(chǎn)生具有所述可見(jiàn)光譜中的波長(zhǎng)的單色光，并且其中所述單色光的所述波長(zhǎng)與所述熒光信號(hào)的所述波長(zhǎng)是不同的。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中與所述染料復(fù)合物相比，未結(jié)合熒光染料在用來(lái)自能量源的能量照射時(shí)發(fā)出較少熒光。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，在未結(jié)合至所述核酸時(shí)，未結(jié)合熒光染料在用來(lái)自所述能量源的能量照射時(shí)不發(fā)熒光，以使得沒(méi)有所述染料復(fù)合物的細(xì)胞不發(fā)出熒光信號(hào)。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括基于所述熒光染料的存在或不存在，來(lái)區(qū)分具有細(xì)胞核的細(xì)胞與沒(méi)有細(xì)胞核的細(xì)胞。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)量涉及點(diǎn)計(jì)并且區(qū)分紅細(xì)胞(RBC)與白細(xì)胞(WBC)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在所述測(cè)量之前不涉及使RBC溶解。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述體液包含完整WBC和RBC。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)量使用自動(dòng)血液分析器、流式細(xì)胞儀，或用于體液樣品的另一種診斷分析器來(lái)執(zhí)行。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測(cè)量包括使所述體液流經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的流槽。
14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熒光染料提供于組合物中，所述組合物進(jìn)一步包括水。
15.一種用于分析流體的方法，其中所述流體含有少于約40個(gè)細(xì)胞/微升，所述方法包括: 使所述流體與熒光染料接觸，其中所述熒光染料滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸以在所述細(xì)胞內(nèi)形成染料復(fù)合物； 用來(lái)自能量源的能量照射所述流體；并且 測(cè)量所述流體中的由所述染料復(fù)合物發(fā)出的熒光信號(hào)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述流體含有少于約20個(gè)細(xì)胞/微升。
17.如權(quán)利要求15至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述流體含有少于約5個(gè)細(xì)胞/微升。
18.如權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述流體是體液。
19.如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述流體是生物流體。
20.一種用于區(qū)分細(xì)胞的方法，所述方法包括: 使所述細(xì)胞與包含熒光染料的溶液接觸，其中所述熒光染料是水溶性的、滲透細(xì)胞膜，并且結(jié)合至核酸； 用來(lái)自激發(fā)光源的激發(fā)光照射所述細(xì)胞； 測(cè)量來(lái)自所述細(xì)胞的光發(fā)射； 基于所述測(cè)量的光發(fā)射來(lái)區(qū)分含有核酸的所述細(xì)胞與沒(méi)有核酸的所述細(xì)胞；并且基于使用一個(gè)或多個(gè)光散射檢測(cè)器從所述樣品獲得的多個(gè)光學(xué)數(shù)據(jù)，將所述細(xì)胞分類(lèi)為白細(xì)胞(WBC)或紅細(xì)胞(RBC)。
21.一種用于分析體液的組合物，所述組合物包含水和熒光染料，其中所述熒光染料是水溶性的、滲透細(xì)胞膜，并且結(jié)合至核酸。
22.—種血液學(xué)系統(tǒng),其包括: 用于保持樣品的樣品保持器； 用于將染色組合物與至少一部分所述樣品混合的混合容器； 用于存儲(chǔ)所述染色組合物的存儲(chǔ)容器，其中所述染色組合物包含滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料，并且 其中所述染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光； 流槽； 用于將電磁能施加至所述流槽的至少一個(gè)能量源； 用于檢測(cè)來(lái)源于所述流槽內(nèi)的熒光的檢測(cè)器；和 用于檢測(cè)散射的可見(jiàn)光的一個(gè)或多個(gè)可見(jiàn)光檢測(cè)器。
23.如權(quán)利要求22所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括抽吸機(jī)構(gòu)，所述抽吸機(jī)構(gòu)用于抽吸至少一部分來(lái)自所述樣品保持器的所述樣品并且將其移動(dòng)至所述混合容器。
24.如權(quán)利要求22至23中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括抽吸機(jī)構(gòu)，所述抽吸機(jī)構(gòu)用于抽吸所述染色組合物并且將其從所述存儲(chǔ)容器移動(dòng)至所述混合容器。
25.如權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其中所述至少一個(gè)能量源產(chǎn)生波長(zhǎng)λ I下的單色光。
26.如權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其中當(dāng)所述染料結(jié)合至核酸時(shí)，所述染料吸收波長(zhǎng)λ I下的光并且發(fā)出波長(zhǎng)λ 2下的光。
27.如權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)λ2下的光。
28.如權(quán)利要求22至27中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括用于提供非單色可見(jiàn)光的至少一個(gè)額外能量源。
29.如權(quán)利要求22至28中任一項(xiàng)所述的血液學(xué)系統(tǒng)，其中所述樣品是體液。
30.一種用于制備血液學(xué)系統(tǒng)的方法,所述方法包括: 提供用于將至少一部分將要分析的樣品與染色組合物混合的混合容器； 提供用于存儲(chǔ)所述染色組合物的存儲(chǔ)容器，其中所述染色組合物包含滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料，并且其中所述染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光； 提供流槽； 建立穩(wěn)定核心流以允許所述樣品穿過(guò)所述流槽；定位用于將電磁能提供至所述流槽的能量源；并且 定位用于檢測(cè)從所述流槽內(nèi)發(fā)出的熒光的檢測(cè)器。
31.一種制備用于分析體液的容器的方法，所述方法包括將包含能夠滲透細(xì)胞膜并且結(jié)合至核酸的染料的組合物添加至所述容器，其中所述染料在結(jié)合至核酸時(shí)發(fā)熒光，并且其中所述容器是血液 學(xué)系統(tǒng)的一體化或模塊化部分。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK104024437SQ201280064502
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月27日
【發(fā)明者】吳炯, 艾米麗·H.·林, 楊金平 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司