專利名稱：一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細(xì)胞分別固定在各自特定的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，細(xì)胞之間通過(guò)微通道進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，為研究細(xì)胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)80年代后期，為了建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長(zhǎng)增殖，人們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或兩種以上的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞研究中。共培養(yǎng)體系主要作用誘導(dǎo)細(xì)胞向另一種細(xì)胞分化；誘導(dǎo)細(xì)胞自身分化；維持細(xì)胞功能和活力；調(diào)控細(xì)胞增殖；促進(jìn)早期胚胎發(fā)育和提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。從上世紀(jì)30年代開(kāi)始，細(xì)胞培養(yǎng)逐漸成為研究人員實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不可缺少的重要步驟，其載體工具培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶也逐步被大家所認(rèn)可，成為了一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)耗材。雖然到目前為止，很多科學(xué)家認(rèn)為培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的這種體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境有著顯著的不同,但是由于沒(méi)有更好的培養(yǎng)載體來(lái)改變這個(gè)現(xiàn)狀，所以生物學(xué)家們也只能退而求次的默認(rèn)這種情況的存在。常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng) 皿很難完成多種細(xì)胞的共培養(yǎng)，因此，發(fā)展一種便捷、快速、高效、低成本的多細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，是細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的迫切需求。近年來(lái)，微流控芯片分析技術(shù)已成為分析化學(xué)中一個(gè)重要的研究方向，是其中最活躍的一支，無(wú)論是在科研還是應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、集成化、多重平行分析、便攜式、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。然而，采用微流控芯片，在其表面制備微結(jié)構(gòu)和微通道，依靠微通道中多層液體之間的層流效應(yīng)驅(qū)動(dòng)樣品微流體，同時(shí)完成多種細(xì)胞的植入技術(shù)，目前在多種細(xì)胞共培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域尚未有實(shí)質(zhì)性的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細(xì)胞分別固定在各自特定的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，細(xì)胞之間通過(guò)微通道進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，為研究細(xì)胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的操作步驟(I)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。(2)通過(guò)微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。(3)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對(duì)齊、粘合、加壓封合，組成兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。(4)將不同細(xì)胞溶液從樣品池加入，控制微流體的層流速度，將兩種細(xì)胞植入到微流控芯片中的主微通道中。(5)完成兩種細(xì)胞在微通道中的植入后，進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。(6)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成細(xì)胞層后，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，以及收集細(xì)胞代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)細(xì)胞間的互相影響。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的芯片基材可以是PMMA、PC、PVC、C0C、銅、鋁、不銹
鋼、硅片、玻璃圓片，也可是市售的各類普通CD光盤。本發(fā)明中，微流 控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的芯片和粘性薄膜的微結(jié)構(gòu)和微通道可以通過(guò)數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕制備，也可用軟刻蝕技術(shù)制備。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片組成，各層芯片之間用粘性薄膜貼合，粘性薄膜可以是雙層力致粘性薄膜，也可是普通雙面膠薄膜。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片上的細(xì)胞溶液的驅(qū)動(dòng)依靠溶液入口與出口間的液差產(chǎn)生的重力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的細(xì)胞植入是依靠微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成的。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片采用原位植入細(xì)胞于BSA蛋白修飾的微通道表面。本發(fā)明中，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片可以研究?jī)煞N細(xì)胞之間的互相作用。本發(fā)明提出的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，操作簡(jiǎn)單、實(shí)現(xiàn)了兩種種細(xì)胞的平行植入和共培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡(jiǎn)化了細(xì)胞植入過(guò)程，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，具有便攜、經(jīng)濟(jì)、快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1.微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。a.左側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)，b.右側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)，c.細(xì)胞溶液儲(chǔ)備區(qū)，d.細(xì)胞溶液儲(chǔ)備區(qū)，e.細(xì)胞代謝物收集區(qū)。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來(lái)水、蒸餾水清洗各層芯片，并用乙醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機(jī)加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對(duì)齊、粘合、加壓封合，制成兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。從左側(cè)和右側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)分別加入兩種細(xì)胞溶液，控制左和右側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)與細(xì)胞溶液儲(chǔ)備區(qū)的液差高度，從而控制層流速度，使細(xì)胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細(xì)胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成兩種細(xì)胞的同時(shí)植入，每隔12小時(shí)更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成單細(xì)胞層后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)生的互相作用，以及收集細(xì)胞代謝產(chǎn)物分析細(xì)胞間的互相影響。實(shí)施例2用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來(lái)水、蒸餾水清洗各層芯片，并用乙醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機(jī)加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對(duì)齊、粘合、加壓封合，制成多細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。從左側(cè)和右側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)分別加入兩種細(xì)胞溶液，控制左和右側(cè)細(xì)胞溶液加入?yún)^(qū)與細(xì)胞溶液儲(chǔ)備區(qū)的液差高度，從而控制層流速度，使細(xì)胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細(xì)胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成兩種細(xì)胞的同時(shí)植入，每隔12小時(shí)更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成單細(xì)胞層后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)生的互相作用，以及收集細(xì)胞代謝產(chǎn)物分析細(xì)胞間的互相影 響。
權(quán)利要求
1.一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細(xì)胞分別固定在各自特定的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，細(xì)胞之間通過(guò)微通道進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，為研究細(xì)胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)。
2.按權(quán)利要求1所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，其制作步驟如下 (1)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。
(2)通過(guò)微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。
(3)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對(duì)齊、粘合、加壓封合，組成兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控芯片。
(4)將不同細(xì)胞溶液從樣品池加入，控制微流體的層流速度，將兩種細(xì)胞植入到微流控芯片中的主微通道中。
(5)完成兩種細(xì)胞在微通道中的植入后，進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。
(6)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成細(xì)胞層后，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，以及收集細(xì)胞代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)細(xì)胞間的互相影響。
3.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的核心功能器件是微流控芯片，此芯片以液差產(chǎn)生的重力作為樣品微流體流動(dòng)的驅(qū)動(dòng)力，可以批量生產(chǎn)、多次利用、靈活設(shè)計(jì)與組裝。
4.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片上的微結(jié)構(gòu)和微通道是通過(guò)數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕、軟刻蝕技術(shù)的微加工方法在芯片基材表面制備，尺寸在微米級(jí)別。
5.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片疊加而成，構(gòu)成三維立體的微結(jié)構(gòu)和微通道網(wǎng)絡(luò)。
6.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片可以在一塊芯片上制作多組微結(jié)構(gòu)和微通道，構(gòu)成多組細(xì)胞培養(yǎng)單元，可同時(shí)培養(yǎng)多組樣品，提高了單位時(shí)間的平行培養(yǎng)能力。
7.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片通過(guò)微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成微通道中細(xì)胞的植入。
8.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片在微通道表面進(jìn)行BSA蛋白表面修飾后進(jìn)行細(xì)胞的原位植入。
9.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片可以用顯微鏡直觀地觀察兩種細(xì)胞層之間的細(xì)胞互相作用。
10.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片便于觀察、設(shè)備簡(jiǎn)單、樣品和試劑用量小，平行培養(yǎng)能力高、樣品無(wú)需轉(zhuǎn)移、樣品交叉污染幾率小，能更真實(shí)地反映人體組織細(xì)胞之間的互相影響，有利于實(shí)驗(yàn)者觀察細(xì)胞與細(xì)胞之間互相作用，在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細(xì)胞分別固定在各自特定的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，細(xì)胞之間通過(guò)微通道進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，為研究細(xì)胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。該微流控芯片實(shí)現(xiàn)了兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單、實(shí)現(xiàn)了兩種種細(xì)胞的平行植入和共培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡(jiǎn)化了細(xì)胞植入過(guò)程，在顯微鏡下可以直觀地研究?jī)煞N細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中的互相作用，以及分析細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，具有便攜、經(jīng)濟(jì)、快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為細(xì)胞生物學(xué)研究提供了一種全新的分析技術(shù)。
文檔編號(hào)C12M3/00GK103060194SQ20121058706
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者葉嘉明, 王曉東, 沙俊, 聶富強(qiáng) 申請(qǐng)人:蘇州汶顥芯片科技有限公司