專利名稱：染色體10q26上的年齡-相關黃斑病變(ARM)易感基因的制作方法
染色體10q26上的年齡-相關黃斑病變(ARM)易感基因本申請是2006年6月7日遞交的申請?zhí)枮?00680027015. 0，發(fā)明名稱為“染色體10q26上的年齡-相關黃斑病變(ARM)易感基因”的分案申請。發(fā)明者邁克爾 B 高瑞約翰納 加科伯斯多緹爾耶維特 P 孔利丹尼爾 E 威克斯特瑪麥 S 馬何-費瑞瑟羅伯特 E 費瑞爾
背景技術(shù)：
年齡-相關黃斑病變(已知為一種年齡-相關的黃斑變性)是一種在老年人群中引起中心失明的主要原因，并且大量研究表明一種強潛力基因組成了這種復雜疾病。使用大家系的基因組-范圍連鎖掃描，患病同胞對，及最近的表型不一致同胞對，已經(jīng)鑒定了大量潛在的易感 位點。(Klein 等，1998 Age-related maculardegeneration.Clinical features in a large family and linkage tochromosome lq. Archivesof Ophthalomolgy 116 1082-1088. ；Weeks 等 2000A full genomescan for agerelated maculopathy. Human Molecuar Genetics 9 :1329-1349 ;Majewski 等，2003Age~related macular degeneration-a genome scan in extendedfami lies. Am JHum Genet 73 :540-550 ；Schick 等 2003 AwhoIe-genome screen of a quantitativetrait of age-relatedmaculopathy in sibships from the Beaver Dam Eye Study.Am J HumGenet 72 :1412-1424 ;Seddon 等 2003 A genomewide scan forage-relatdmacular degeneration provides evidence for linkage toseveral chromosomalregions. Am J Hum Genet 73 :780-790 ;Abecasis 等 2004-Age-related maculardegeneration a high—resolution genome scan for susceptibility Loci in apopulationenriched for late—stage disease. Am J Hum Genet 74 :482-494 ;Iyengar等，2004 Dissection of genomewide-scan data in extendedfami lies reveals a majorlocus and oligogenic susceptibility forage-related macular degeneration.Am J Hum Genet 74 :20-39 ；Kenealy 等 2004 Linkage analysis for age-relatedmaculardegeneration supports a gene on chromosome 10q26. Mol VislO :57-61 ；Schmidt 等 2004 Ordered subset linkage analysis supportsa susceptibility locusfor age-related macular degeneration onchromosome 16pl2. BMC Genet 5 18 ；Weeks等 2004 Age-relatedmaculopathy a genomewide scan with continued evidenceofsusceptibility loci within the lq31，10q26，and 17q25 regions. Am JHum Gemet75 :174-189 ;Scantangelo 等 2005 A Discordant Sib-Pair Linkage Analysis ofAge-Related Macular Degeneration. Ophthalmic Genetics 26 :61-68)基因組-范圍交聯(lián)掃描強烈顯示10q26區(qū)域含有年齡-相關黃斑變性(AMD)基因(Weeks等2004)；該區(qū)域已經(jīng)被許多其他研究所支持并且是最近meta分析中的頂-級區(qū)域(Fisher等2005 Meta-analysis of genome scans ofage-related macular degeneration. HumMol Genet. 2005 Augl ； 14 (15) :2257-64)。最近，Science 上的三篇文章(Edwards 等2005Complement Factor H Polymorphism and Age-Related MacularDegeneration.Science 308，421-424 ;Haines 等 2005 ComplementFactor H Variant Increases theRisk of Age-Related MacularDegeneration.Science 308，419-421. Klein 等 2005ComplementFactor H Polymorphism in Age-Related Macular Degeneration.Science308,385-389)鑒定了對應于染色體I上交聯(lián)信號的補體因子H(CFH)上的等位基因變體，其在家族和零星情況中導致ARM重要歸因危險性。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被證實(Conley等2005Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesisandregulation of the complement system in the etiology ofage-related maculopathy.Hum Mol Genet 14 :1991-2002 ;Hageman等(2005a)From The Cover A common haplotypein thecomplement regulatory gene factor H(HF1/CFH)predisposesindividualsto age-related macular degeneration. Proc natl Acad SciUSA 102 :7227-7232 ；和 Zareparsi 等 2005a Strong Association of the Y402H Variant in ComplementFactor H at lq32 withSusceptibility to Age-Related Macular Degeneration. AmJ HumGenet 77 :149-53)。CF1H在Hageman和Anderson先前的研究中已經(jīng)懷疑在ARM中起作用(Hageman 和 Mullins 1999 Molecularcomposition of drusen as related tosubstructural phenotype. Molecular Vision 5 :28 ; Johnson 等 2000 A potential rolefor immunecomplex pathogenesis in drusen formation. Experimental EyeResearch70 :441-449 Complement activation and inflammatoryprocesses in Drusenformation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research 73 887-896 ；Mullins 等 2000 Drusenassociated with ageing and age-related maculardegeneration containproteins common to extracellular deposits associatedwithatherosclerosis, elastosis，amyloidosis, and dense deposit desease. FASEBJournal 14:835-846 ；Ha geman 等 2001 An integratedhypothesis that considersdrusen as biomarkers of immune-mediatedprocesses at the RPE-Bruch^ s membraneinterface in aging andage-related macular degeneration. Progress in Retinal &EyeResearch 20 :705-732 Johnson等2001)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多ARM病人中觀察到的視網(wǎng)膜床(玻璃膜疣)含有補體因子。然而直到其他導致ARM的基因被鑒定后，CFII仍然是一個獨立的難題，表明選擇性途徑和炎癥是ARM的發(fā)病機制，但并非眼科中觀察到的唯一病理學。

發(fā)明內(nèi)容
至此，如上所述，等位基因變異型，包括單核甘酸多態(tài)性，已經(jīng)在染色體10q26上鑒定。這里顯示這些等位基因變異型與隨年齡增長-相關黃斑變性的增高危險性相關。等位基因變異型隨L0C387715和/或PLEKHA1基因一起定位在染色體10q26上。一個實施方案中，等位基因變型伴隨L0C387715。
在本發(fā)明的一個非-限制性實施方案中，提供了一種鑒定高危發(fā)生年齡-相關黃斑病變的個體的方法。該方法包括在來源于主體的核酸樣本中，鑒定與發(fā)生年齡-相關黃斑變性危險性相關的染色體10q26上的等位基因變異的存在。在一個非-限制性實施方案中，等位基因變異發(fā)生在染色體10q26上的PLEKHA1/L0C387715/PRSS11。例如并且非限制性的，等位基因變異是發(fā)生于PLEKHA1和L0C387715其一或兩者上的等位基因變異，例如，非限制性的，L0C387715上的絲氨酸69丙氨酸變異。另一個非-限制實施方案中，變異是包括一種或一種以上定義為rs4146894,rsl0490924, rsl045216, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883 和rsl853886變異的多態(tài)性。等位基因變異可以是，非限制性的，產(chǎn)生一種非-功能基因產(chǎn)物的突變和一種基因產(chǎn)物的變異表達，如一種或一種以上移碼突變，啟動子突變和拼接突變。一個實施方案中，該方法包括在來源于主體核酸樣本中進一步定義補體因子H等位基因變異的存在，如，非限制性的，對應于單核甘酸多態(tài)性rsl852883的變異。此方法可以使用任何可用的技術(shù)，例如非限制性的核酸擴增方法，例如PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，等溫擴增，基于核酸序列擴增(NASBA)，5’熒光核酸方法(例如TAQMAN方法)，核酸信標方法和滾環(huán)擴增。這種等位基因變異可以使用一種陣列進行鑒定，其典型地包括一種或一種以上用于在來源于主體的核酸樣本中，鑒定包括兩種或多種單核甘酸多態(tài)性，rs4146894, rsl0490924, rsl045216, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292,rsl483883和rsl853886的等位基因變異的存在的試劑。另一個非-限制性實施方案中，提供一個包括一種或一種以上試劑序列的陣列，其鑒定來源于主體的核酸樣本中與發(fā)生年齡-相關黃斑變性危險性相關的染色體10q26上的等位基因變異的存在。非限制性的，等位基因變異可以發(fā)生在染色體10q26上的PLEKHA1/L0C387715/PRSS11,并且，例如，可以對應于一種或一種以上定義為rs4146894，rsl045216, rsl0490924, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883 和rsl853886的單核甘酸多態(tài)性。


`圖1 :相對于候選基因的CIDR位置和局部基因型SNPs。染色體10上的位點，距離和核酸位點來源于NCBI Entrez-gene和SNP數(shù)據(jù)庫。圖2 :染色體10的單-點和多點連鎖結(jié)果。左圖表示使用所有SNPs時的結(jié)果。右圖表示僅使用H-clust SNPs分析的結(jié)果。標記”F”的峰表示可能為由于高SNP-SNP LD導致的假峰，而標記” G”和” P”的峰，分別對應于包括GRK5和PLEKHA1的位點。水平線表示多點Sall (Sall-1最大值)的1-單位支撐間隔。圖3A-3D :基于196CIDR SNPs和179非相關對照的染色體10的連鎖不平衡模式。圖3A 135cM的假峰(見圖2)，圖3B 142cM的假峰(見圖2)，圖3C :連鎖峰。圖3D-1和3D-2是圖3C的放大版本，源于線A-A’。假峰中帶有最大Sall的SNP (圖3A和3B)以灰色顯示而真實連鎖峰中來源于CCREL(表5)的5個基因(GRK5/RGS10/PLEKHA1/L0C387715/PRSSlI)上的重要SNPs以灰色顯示?；疑幱氨硎維NP對之間的重要LD (無號的深灰方塊表示成對D’= 1)，白色方塊表示無重要LD的跡象，而無號的灰色方塊表示不帶有統(tǒng)計重要性的值為I的成對D，運用D’測定LD并且方塊中的數(shù)字以D’ *100給出成對LD。
圖4 :染色體I的多點連鎖結(jié)果。左圖表示使用所有SNPs時的結(jié)果，而右圖表示僅使用H-clust SNPs分析的結(jié)果。標記”F”的峰表示可能為由于高SNP-SNP LD導致的假峰，而標記”C”的峰對應于CFH基因。水平線表示多點Sall (CFH-1最大值Sall)的1-單位支撐間隔。圖5A-5C提供基于679CIDR SNPs和179非相關對照的染色體I的連鎖不平衡模式。圖5A 188cM的假峰(見圖4)，圖5B 202cM的假峰(見圖4)，圖5C =CFH位點上的連鎖峰。假峰中帶有最大Sall的SNP以灰色顯示而真實連鎖峰中來源于CCREL(表5)的CFH上的重要SNPs以灰色顯示?；疑幱氨硎維NP對之間的重要LD(無號的深灰方塊表示成對D’= 1)，白色方塊表示無重要LD的跡象，而無號的灰色方塊表示不帶有統(tǒng)計重要性的值為I的成對D’。運用D’測定LD并且方塊中的數(shù)字以D’ *100給出成對LD。圖 6A 和 6B :圖 6A GRK5(1 區(qū)域)，RGSlO (SNP6), PLEKHAI (2 區(qū)域)，L0C387715(3區(qū)域)，PRSSlI (4區(qū)域)的連鎖不平衡模式。圖6B:Cm(區(qū)域I)的連鎖不平衡模式?；疑幱氨硎維NP對之間的重要LD (無號的深灰方塊表示成對D’ = I)，白色方塊表示無重要LD的跡象，而無號的灰色方塊表示不帶有統(tǒng)計重要性的值為I的成對D’。運用D’測定LD并且方塊中的數(shù)字以D’ *100給出成對LD。CCREL等位基因試驗中的重要S NPs是灰色中最高的(見表6)。三個SNPs(rs642835·2，rsl2258692和rsll528141)由于非常低的雜合性不包括在內(nèi)，而一個SNPs，rs2736911，由于其無信息也不包括在內(nèi)。表明這些區(qū)域清楚的顯示了基因的位置而非代表單體型區(qū)域。圖1 顯示 CFH，EL0VL4，PLKEHA1，和 L0C387715 基因的評估的粗略 ORs 和 95% CIs0一個或兩個危險等位基因(RR+RN)將與非-危險等位基因(NN)主體純合子比較。實線表示對應于OR(開環(huán))的95% Cl。點垂直線表示OR為I的空值。垂直列給出了在AREDS和CHS隊列中評估的對比值。圖8 顯示了 CFH 的評估 ORs 和 95% Cl S。A :顯性效應(CT+CC vs. TT)評估 ORdonj0B :雜合子(CT vs. TT)危險性評估ORhrt。C :隱形效應(CC vs. CT+TT)評估0RM。。D :雜合子(CC vs. TT)危險性評估ORtal。點垂直線表示OR為I的空值。圖9顯示了 EL0VL4的評估ORs和95 % Cl S。A :顯性效應(AG+GG vs. AA)評估ORd0mo B :雜合子(AG vs. AA)危險性評估0Rhrt。C :隱形效應(GG vs. AG+AA)評估ORra。D 雜合子(GG vs. AA)危險性評估0RhM。點垂直線表示OR為I的空值。圖10 顯示了 L0C387715 的評估 ORs 和 95% CIs0 A :顯性效應(GT+IT vs. GG)評估0RdM。B:雜合子(GT vs. GG)危險性評估0Rhet。C :隱形效應(TT vs. GT+GG)評估0RM。。D :雜合子(TT vs. GG)危險性評估0Rh()m。點垂直線表示OR為I的空值。圖11 顯示了 PLEKHAI 的評估 ORs 和 95% CIs0 A :顯性效應(AG+AA vs. GG)評估ORd0mo B :雜合子(AG vs. GG)危險性評估0Rhrt。C :隱形效應(AA vs. AG+GG)評估ORra。D 雜合子(AA vs. GG)危險性評估0RhM。點垂直線表示OR為I的空值。圖12提供了來源于包括了 CFH中Y402H熔解-分析數(shù)據(jù)組的評估ORs和95%CIs，及從固定和隨機效應模型中匯集的評估值。頂端的數(shù)據(jù)顯示ORhrt(CT雜合子對比于TT的0R)而底部的數(shù)據(jù)顯示ORhom(CC雜合子對比于TT的0R)。‘Hage-C’和iHage-F表不來源于 Hageman 等的 Columbia 和 Iowa cohortsD 評估值(Hageman, G. S 等(2005)Acommon haplotype in the complement regulatory gene factor H(HF1/CFH)predisposesindividuals to age-related macular degeneration. Proc Natl AcadSci USA. 2005 May17 ；102(20) :7227-32. Epub 2005 May 3)，分別地，‘Jakobs’ 表示來源于 Jakobsdottir等文章的評估值(Jakobsdottir, J等(2005) Susceptibility genes for age-relatedmaculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)。” 固定”表不來源于所有試驗的匯集的評估值都假設研究之間的可變性是歸因于偶然的。”隨機”表示來源于所有試驗的匯集的評估值都考慮了研究中的異質(zhì)性。”n_。”是評估值中包括的ARM情況的全部數(shù)量，而” n_”包括在評估值中的無ARM的對照的全部數(shù)量。點垂直線表示同質(zhì)下匯集OR的點評估值(”固定”)。圖13提供了 A :在包括CM中的Y402H的meta-分析的陣列中，非相關ARM情況中的基因型頻率(％)。B :在包括CFH中的Y402H的meta-分析的研究中，無ARM的非相關對照的基因型頻率(％ )?！盚age_C”和”Hage-1”表示來源于Hageman等的Columbia和Iowa陣列的評估值,分別地，” Jakobs”表示來源于Jakobsbottir等文章的評估值。圖14提供了來源于包括了 L0C387715中S69A熔解-分析數(shù)據(jù)組的評估ORs和95% CIs，及從固定和隨機效應模型中匯集的評估值。頂端的數(shù)據(jù)顯示ORhrt (GT雜合子對比于GG的0R)而底部的數(shù)據(jù)顯示ORtal(GG雜合子對比于TT的0R)。“Jakobs”表示來源于 Jakobsdottir 等文章的評估值(Jakobsdottir, J 等(2005) Susceptibility genes forage-related maculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)。，，固定，，表示來源于所有試驗的匯集的評估值都假設研究之間的可變性是歸因于偶然的?！彪S機”表示來源于所有試驗的匯集的評估值都考慮了研究中的異質(zhì)性?！眓_”是評估值中包括的ARM情況的全部數(shù)量，而”n_”包括在評估值中的無ARM的對照的全部數(shù)量。點垂直線表示同質(zhì)下匯集OR的點評估值(”固 定”)。圖15提供了 A :在包括L0C387715中的S69A的meta-分析的陣列中，非相關ARM情況中的基因型頻率(％ )。B :在包括L0C387715中的S69A的meta-分析的研究中，無ARM的非相關對照的基因型頻率(％ )?！癑akobs”表示來源于Jakobsbottir等文章的評估值。圖16提供了 L0C387715的氨基酸(序列號19)和核酸序列(序列號20)。
具體實施例方式如下列所述，等位基因變異型，包括單核苷酸多態(tài)性，已經(jīng)在染色體10q26上被鑒定。這里顯示的等位基因變異型與年齡-相關黃斑變性的高危發(fā)生相關。實施例1鑒定了PLEKHAI和/或L0C387715是ARM相關的等位基因變異型位點。進一步的研究，如實施例2顯示，證實并進一步支持L0C387715變異作為ARM標記的相關性。L0C387715變異作為ARM標記的相關性還未被排除，但最近的遺傳學研究的證據(jù)更加強烈顯示變異發(fā)生在L0C387715基因上。因此提供了對具有高危險性發(fā)生年齡-相關黃斑變性的病人個體進行確認的方法。本方法包括鑒定來源于主體核酸樣本中P LEKHAl和/或L0C387715，在一個非限制性實施方案中，L0C387715中，等位基因變異或特定單倍型的發(fā)生(包括幾種等位基因變異)。特定單核甘酸多態(tài)性(SNPs)在這些位點上已經(jīng)被鑒定，包括，非限制性的，這些SNPs鑒定為 rs4146894, rsl045216, rsl0490924, rsl882907, rs760336，和 rs763720。方法進一步包括在補體因子H(CFH)中對等位基因變異型進行鑒定，例如，非限制性的等位基因變異型定義為 rsl853883。這里使用的，“等位基因變異型”指核酸上的，典型的為主體的，如病人的一個或一個以上等位基因原初氨基酸序列的變異。等位基因變異包括在蛋白表達中具有任何某項效應的單一或多重核苷酸和氨基酸的替換，增加或刪除，包括但不局限于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動子活性，移碼，早期蛋白終止，蛋白錯誤-折疊，選擇性蛋白加工，破壞(或增強)蛋白的活性位點或結(jié)合位點，mRNA的錯誤拼接或影響最終基因產(chǎn)物的表達和/或功能的核酸或蛋白的任何其他特征。一個氨基酸和核酸序列的變異可以是或非沉默的，即非表型效應，如疾病的威脅，可以與序列變異相關。另一方面，等位基因變異可以是公認的”野生型”核酸或氨基酸序列的變異，其通過這里描述的示范性和非限制性統(tǒng)計學方法，被認為與疾病危險，如ARM，是牽連的，相關的或相聯(lián)系的。這樣，L0C387715單核甘酸多態(tài)性rsl0490924 (Ser69Ala)是一種等位基因變異。大量的方法，包括高通量的方法，可用于測定SNPs和/或其他等位基因變異，非限制性地如下列實施例描述的PCR和限制性片斷長度多態(tài)性方法。一個實施方案中，通過任何方法對樣本中的DNA進行測序(重新測序)鑒定SNP或小等位基因變異。許多重新測序的方法在領域中是已知的，包括高-通量方法。擴增-基礎的方法也可以用于鑒定等位基因變異，如SNPs，包括，非限制性的PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，等溫擴增，基于核酸序列的擴增(NASBA)，5’熒光核酸酶方法(例如TAQMAN方法)，分子信標方法和滾環(huán)擴增。其他方法，如作為合適的和有效的鑒定不同等位基因的限制性片斷長度多態(tài)性RFLP，也可以應用。方法可以是多重的，意味兩種或多種反應可以在相同的物理位置同時進行，如在相同的管或陣列中相同位置-只要多重反應的反應產(chǎn)物可以區(qū)分。作為非限制性的實施例，可以通過使用和監(jiān)控對應于兩種不同序列-特意探針的不同熒光燃料的聚集或損耗，復合TAQMAN或分子信標方法。許多情況下，通過個人選擇和經(jīng)驗，現(xiàn)有的設備和試劑，高通量和/或復合方法的需要，費用，方法的精確性，和技術(shù)員操作方法的技術(shù)水平來指定合適的方法。這些技術(shù)的設計和實施是廣 泛-知曉的并在本領域中技術(shù)人員平均能力之內(nèi)。在這里提供的方法的實施中，可以使用一個陣列。在進行高-通量方法時陣列是特別有用的。陣列典型地包括一種或一種以上試劑，例如非限制性的，核酸引物和/或探針，以鑒定人類主體核酸樣本中對應于L0C387715和/或PLEKHA1上的一個或一個以上單核甘酸多態(tài)性的等位基因變異的發(fā)生，例如，非限制性的，以下鑒定的SNPs rs4146894,rsl045216,rsl0490924,rsl882907,rs760336,rs763720,rs800292,rsl483883,rsl853883和rsl853886。陣列可以同時測試和鑒定L0C387715和/或PLEKHA1上的一個或一個以上等位基因變異，例如，非限制性的，以下鑒定的SNPs rs4146894, rsl045216, rsl0490924,rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883, rsl853883 和 rsl853886,以及同時測定CFH，其他基因/位點和對照基因/位點/核酸上的等位基因變異。這里使用的術(shù)語”陣列”指有助于鑒定基因上定位于兩個或更多已鑒定的位置的等位基因變異的試劑。一個實施方案中，陣列是一種裝置，其具有兩個或更多分離的，確認的反應腔室，例如，非限制性的為96-孔板，在其中進行包括確定組分的反應。一個示范性實施方案中，兩種或更多核酸引物或探針以空間可尋址方式固定于基質(zhì)上，從而每個獨立的引物或探針固定于基質(zhì)的不同的和(可尋址的)確定位置?；|(zhì)包括，非限制性的，多-孔板，娃片和娃珠。一個實施方案中，陣列包括兩套或多套珠，每套珠具有一個確定的標記，如一個量子點或熒光標簽，從而可以使用，例如非限制性的，流式細胞儀對珠進行單獨確認。一個實施方案中，在目前所描述的范圍中，陣列可以是包括兩個或多個反應腔室，其帶有擴增DNA以鑒定SNPs的引物或結(jié)合特定序列的探針。從而，試劑，如探針和引物可以結(jié)合或沉積于陣列的特定位置。試劑可以為任何合適的形式，包括，非限制性的溶液，干燥，凍干或玻璃化。有用的陣列技術(shù)包括,例如并且非限制性的，Affymetrix Ge neChip^ Array,
例如，GeneChip^ CustomSeq垃 ResequencingArrays (可從 California, SantaClara,Affymetrix Inc.商業(yè)獲得)和相似技術(shù)。從病人樣本獲得的數(shù)據(jù)中分析陣列數(shù)據(jù)和/或鑒定遺傳危險性因子的信息和/或統(tǒng)計軟件或其他計算機-執(zhí)行程序在本領域中是已知的。這里使用的，”鑒定主體核酸樣本中發(fā)生等位基因變異的試劑”，其中該等位基因特被異地鑒定或在基因或位點中被鑒定，指通過任何合適的方法，例如非限制性的，通過PCR,再測序5’外切核酸酶(TaqMan)方法和/或陣列或高-通量方法，鑒定特定等位基因變異的試劑。這些試劑的非-限制性實施例包括在任何有用的方法系統(tǒng)中使用的序列-特異引物，引物對和探針。引物和探針可以為任何有用的形式，但是典型地為核酸，但可以為核酸類似物，如，非限制的為硫代磷酸化物。 實施例1中，使用高密度SNP板在lq31和10q26的兩個交聯(lián)區(qū)域進行基于家族的交聯(lián)研究和疾病-對照相關的研究。染色體lq31的SNP交聯(lián)和相關的結(jié)果證實交聯(lián)峰和ARM最強關聯(lián)位于CFH基因上。分析染色體10q26的家族和疾病-對照數(shù)據(jù)以鑒定下一個主要ARM易感-相關基因。實施例2描述的以下研究中，對心血管研究(CHS)恢復的主體，一種不將年齡-相關黃斑變性(ARM)情況作為研究因素的群體-基礎的隊列，和年齡-相關眼疾病研究(AREDS)，一種將ARM情況作為研究因素的群體-基礎的隊列進行嵌套式疾病_對照設計。這些隊列以不同研究策略被用于研究兩個隊列中ARM易感性中的CFH，PLEKHA1，L0C387715和EL0VL4基因。此外，這兩個隊列在0C387715的meta-分析中分別包括了額外增加I和4個疾病-對照研究。兩個隊列中Cm與ARM情況顯著相關(p < 0. 00001)并且meta-分析證實了雜合和純合情況下(0R，2. 4和6. 2 ；95% Cl (置信區(qū)間)，分別為2. 2-2. 7和5. 4-7. 2)危險等位基因提供了該易感性。兩個隊列中L0C387715與ARM情況顯著相關(p < 0. 00001)并且meta-分析證實了雜合和純合情況下(0R，2. 5和7. 3 ;95 % Cl，分別為2. 2-2. 9和
5.7-9. 4)危險等位基因提供了該易感性。PLEKHA1，其與L0C387715緊密相關，在AREDS隊列而非CHS隊列中與ARM情況明顯相關，而EL0VL4在兩個隊列中都與ARM顯著不相關。通過對具有ARM情況不同研究策略的陣列進行評估以及meta-分析的進一步支持，該研究提供了 CFH和L0C387715基因在ARM易感性中的進一步支持。實施例1材料和方法家族和疾病-對照陣列共612個AMD家族和184的非相關對照送至遺傳疾病研究中心(CIDR)鑒定基因型。由于人種基礎的可能性，我們的數(shù)據(jù)僅限制于對高加索組進行分析。高加索組具有594個AMD家族，包括1443個基因型個體，和179個非相關對照。高加索家族包括430個基因型相關的血緣對，38個基因型相關的伯父對，和52個基因型相關的第一代堂兄妹對。共323個高加索家族，117峰非相關對照，和196個非相關疾病也對額外SNPs進行部分基因型鑒定。部分組包括824個基因型個體，298個基因型相關的血緣伯父對，23個基因型相關的伯父對和38個基因型相關的第一代堂兄妹對。Merlin package中的PdeStats (Abecasis等,2000)可方便地用于概要計算家族數(shù)據(jù)。疾病情況模型三個經(jīng)典的模型(A，B和C)用于定義ARM情況的嚴重性(Weeks等，2004)。最簡化的情況下，僅限于關注最嚴重的和最保守診斷的”類型A”疾病。僅使用在所有三種診斷模型中都未受影響的非相關對照。未受影響是那些眼睛護理紀錄和/或眼底照相顯示無任何黃斑變化(包括玻璃膜疣)或少量(少于10)硬玻璃膜疣(50微米直徑或更小)而無任何其他RPE變化的個體。當具有可用信息時，帶有大量黃斑外玻璃膜疣的個體不屬于未受影響。為解釋特異ARM亞-型，只有那些疾病末階段的，任一眼中被證明具有脈絡膜新生血管膜(CNV)的，或任一眼中具有地區(qū)萎縮(GA)的情況被選擇關注。具報道大量個體皆具有地區(qū)萎縮和CNV，然而由于這些情況中難以獲知地區(qū)萎縮是繼發(fā)于CNV的損害或來自于限制CNV生長的治療(例如，激光，手術(shù)，或光力學治療)，其將是問題化的。由于難以在照片或紀錄中辨別病人眼GA是否先于CNV的發(fā)生，CNV組中包括了皆具兩種疾病的病人。然而，在地區(qū)萎縮組中僅包括該交疊組中的亞組，特別是具報道一個眼睛中具有地區(qū)萎縮而無CNV證據(jù)的情況。表I顯示三種情況組中個體的數(shù)量。這些研究可能排除了地區(qū)萎縮組中的小部分個體，其在相同眼中在CNV發(fā)生之前就具有不對稱地區(qū)萎縮或在兩眼中都發(fā)生CNV時已經(jīng)具有對稱地區(qū)萎縮。表I高度ARM病人的亞型分布。括號中的數(shù)字指皆具CNV和GA并且包括在GA組 中(見選擇標準)用于幾率和歸因危險性評估和相關試驗的個體。
I_____
CIDR家族情況局部家族情況局部非相關情況
GA無 GA GA無 GA GA無 GA
CNV 220( 76 ) 187130(45 ) 10671 ( 17) 59
無 CNV 1086257284026系譜和分型錯誤和數(shù)據(jù)處理PedCheck程序(O’Connell和Weeks 1998 PedCheck :在交聯(lián)分析中分析基因型不相容的程序。Am J Hum Genet 63 :259-266)用于驗證Mendelian矛盾。在小家族中確定哪個基因型是錯誤的是非常困難的(Mukhopadhyay 等，2004 Comparative studyof multipointmethods for genotype error decetion. Hum-Hered 58 :175-189),在含有 Mendelian 矛盾的家族中的每個缺失問題標記中設定所有基因型。Mega2 (Mukhopadhyay等，http://watson. hRen. pitt. edu/reRister)用于建立文件進行交聯(lián)分析以及通過基因-計數(shù)評估等位基因頻率。等位基因頻率和Hardy Weinberg平衡從非相關和非影響對照中，通過直接計數(shù)，評估交聯(lián)分析中的等位基因頻率。所有對照在所有三個疾病情況模型中都是未受影響的。未有小孩的基因型配偶，或其小孩非本研究的一部分，合并入本研究的對照。精確的Hardy Weinberg平衡，按Mega2執(zhí)行(Mukhopadlyay等 2005 Mega2 :data_handling for facilitati ng genetic linkage andassociation analyses. Bioinformatics)，用于我們的 SNPs。Mendel version 5(Lange 等，2001 MENDEL Version 4. 0 A complete packagefor the exact genetic analysis of discrete traits in pedigree and populationdata sets. Am J of Hum Genet 69 (Supplement) A 1886)也直接用于評估家族數(shù)據(jù)的等位基因頻率，Mendel在評估等位基因頻率時完全地說明主體的相關性。因為基因型家族成員大多數(shù)是患病的，這些評估值與使用非相關疾病獲得的評估值相當接近。遺傳圖譜Rutgers 聯(lián)合交聯(lián)-物理圖譜(2. 0 版本)(Kong 等，2004A combinedlinkage-physical map of the human genome. AmJ Hum Genet 75 :1143-1148)被用于予頁測在Rutger圖譜中還未出現(xiàn)的SNPs遺傳位點。因為我們的SNPs在期望區(qū)域的分布非常密集，故幾個SNPs之間的評估重組為零；這些情況下重組設定為0. 000001。獲得來源于NCBIdbSNP數(shù)據(jù)庫(人類構(gòu)造35)的我們的所有SNPs物理位點。交聯(lián)不平衡結(jié)構(gòu)進行交聯(lián)分析時忽視SNPs之間的高交聯(lián)不平衡(LD)可以導致假陽性結(jié)果(Schaid 等，2002Caution on pedigree haploty pe inference with sftware thatassumes linkage equil ibrium. Am J Hum Genet 71 :992-995 ;Huang等 2004 Ignoringlinkage disequilibrium among tightly linked markers induces false-positiveevidence of linkage for affected sib pair analysis. Am JHum Genet 75:1106-1112)。考慮高SNP-SNP LD的努力包括1.運用H-cluster方法研究非相關對照中的LD結(jié)構(gòu)(Rinaldo等,2005Characterization of multilocus linkage disequilibrium. Genetic Epidemiology28 193-206),其以 R 進行操作(RDevelopment Core Team 2004R A language andenvironment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing,Vienna, Austria.1SBN 3-900051-07-0, R statistical software website, http://www.r-ro ject. or只/)。目的是測定交聯(lián)分析中的單模標本-標記的SNPs (htSNPs)。方法使用分層聚類來匯集高相關SNPs。聚類后，H-clust方法在每個聚類中選擇htSNP ；htSNP是聚類中與其他所有SNPs最具相關性的SNP。對SNPs進行選擇從而使得每個SNP至少與一個htSNP的相關系數(shù)(r 2)大于0. 5 ；2.程序 Haplo View (Barrett 等 2005 Haploview analysisand visualizationof LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263-265.)被用于獲得染色體 I 和 10上的SNP-SNP LD圖形顯示；以及3.使用兩個和三個-SNP移動窗進行單倍型-基礎的相關性分析(見如下)。交聯(lián)分析
1.單一點分析。如我們先前的研究(Weeks等，2004)，LOD分值在單一(疾病等位基因頻率=0.0001并且外顯率矢量=
)。由于ARM顯性雜性和晚發(fā)性，僅使用兩種疾病顯性”模型A中收影響的”和”未知”。在異質(zhì)性下計算參變量LOD數(shù)值(HLOD)，而運用線性Sall統(tǒng)計學計算模型-自由LOD數(shù)值。兩種數(shù)值都用Allegro計算(Gudb jartsson 等，2000A Ilegro, a new computer program for multipoint linkageanalysis. NatGenet 25 :12-13.)。2.忽略交聯(lián)不平衡的多點分析。既然內(nèi)部-標記距離通常是非常小的，SNPs之間的LD可以非常高并且違背許多交聯(lián)分析程序獲得的無LD的假設。運用Allegro進行忽略LD的多點分析(Gudbjartsson等,2000)。HLODs和Sall統(tǒng)計都被計算。3.運用htSNPs的多點分析。當僅使用htSNPs計算LOD數(shù)值時，染色體I和染色體10上的SNPs數(shù)量減少至533和159個。如上進行多點LOD分析(Weeks等，2004)。忽略的SNPs很好地符合Haplo View評估的SNP-SNP LD結(jié)構(gòu)(Barrett等，2005)。相關性分析為了使家族中的所有病例都能被使用，新的CCREL程序(Biwnig等，2005Case-Control single-marker and haplotypicassociation analysis of pedigreedate. Genet epidomiol 28 :110-122)被運用，其通過同時使用相關病例和非相關對照以測試相關性。CCREL被用于在染色體I和10的交聯(lián)峰分析SNPs以測定相關性。CCREL試驗通過計算病例和對照的有效數(shù)量而關注于生物-相關的主體。對于這些分析，非相關對照被給予”正?！北硇?，而 未受”類型A” ARM影響的家族成員被給予”未知”表型(CCREL方法還未能夠同時使用相關病例和相關對照)。用于相關性試驗的每個SNP的對照的有效數(shù)量是對該SNP進行基因型定義的對照的數(shù)量。一個等位基因試驗，一個使用兩個SNP滑動窗口的單模標本試驗，使用三個SNP滑動窗口的單模標本試驗和一個基因型試驗被執(zhí)行。根據(jù)作者所提供的使用CCREL R包進行分析(Browning等，2005)。GIST 分析為了研究對于交聯(lián)信號最關鍵的等位基因/SNP，使用來源于CCREL試驗的局部基因型SNPs和重要SNPs，在染色體I和10交聯(lián)峰之間進行基因型-1BD共享試驗(GIST)。GIST試驗測定一個等位基因或LD等位基因是否部分為觀察到的交聯(lián)信號(Li等，2004)。計算三種不同疾病模型(隱性，顯性，附加)下每個受影響親緣關系的重量-在無疾病-標記相關性的零假設下這些重量是非偏差的。試驗統(tǒng)計的基礎是家族重量變數(shù)和非參數(shù)聯(lián)結(jié)(NPL)值間的相關性。因為GIST試驗目前僅應用于受影響的親緣對家族成員，故在計算NPL值之前將家族成員劃分入其成員核心家系。因為以下的疾病模型是未知的，我們在三種不同疾病模型下(隱性，顯性，附加)進行測定，對三種模型運用適合于多重試驗的P-值，并取混合值。三重分析以三步連續(xù)步驟進行分析。首先，分析已經(jīng)以CIDR進行基因分型的一套數(shù)據(jù)。第
二，在染色體10PLEKHA1/L0C387715/PRSS11區(qū)域?qū)?個附加SNPs進行局部基因分型，分析局部-基因型數(shù)據(jù)組。注意應使所有PRSSll區(qū)域上的PLEKHA1中所有已知非-同義SNPs都被研究。這兩組數(shù)據(jù)在大小和成分上都不同，易于分離地對其進行分析(表2)。按上述對這些(重疊)數(shù)據(jù)組進行等位基因頻率評估，CCREL相關性試驗，和GIST試驗。第三，我們測試染色體I和染色體10區(qū)域的交互作用，并測定危險性的不同是否為地圖狀萎縮或脈絡膜新生血管膜的因素。表2每部分統(tǒng)計分析和樣 本大小概要
權(quán)利要求
1.一種體外檢測包括與年齡-相關黃斑病變易感性有關的多態(tài)性的核酸樣品的方法，該方法包括在樣品中檢測SEQ ID N0:20(rsl0490924)的第270堿基處是否存在胸腺嘧啶或者鳥嘌呤，其中，在一個或者兩個等位基因上存在胸腺嘧啶說明該核酸樣品包括一種多態(tài)性，這種多態(tài)性顯示增加的年齡-相關黃斑病斑易感性，并且，在兩個等位基因處存在鳥嘌呤說明該核酸樣品包括一種多態(tài)性，這種多態(tài)性顯示減少的年齡-相關黃斑病斑易感性。
2.—種體外檢測包括與年齡-相關黃斑病變易感性有關的多態(tài)性的核酸樣品的方法，該方法包括檢驗PLEKHA1、PRSS11、L0C387715中一個或者一個以上的等位基因變體從而檢測主體基因組SEQ ID NO 20(rsl0490924)的第270堿基處的多態(tài)性，其中，在SEQ ID NO:20 (rsl0490924)的第270堿基處存在胸腺嘧啶顯示增加的年齡-相關黃斑病斑易感性，并且在SEQ ID NO 20(rsl0490924)的第270堿基處存在鳥嘌呤顯示減少的年齡-相關黃斑病斑易感性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其中所述年齡-相關黃斑病斑是嚴重的年齡-相關黃斑病斑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟包括在樣品的染色體10q26的PLEKHAI/LOC387715/PRSS11位點上檢測等位基因變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，包括檢測LOC387715的rsl0490924上的胸腺嘧啶或者鳥嘌呤。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括檢測單核苷酸多態(tài)性rs4146894上的堿基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括檢測單核苷酸多態(tài)性rsl045216上的堿基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括檢測單核苷酸多態(tài)性rsl882907上的堿基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括檢測單核苷酸多態(tài)性rs760336上的堿基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括檢測單核苷酸多態(tài)性rs763720上的堿基。
11.權(quán)利要求1或2所述的方法進一步包括檢測樣品中補體因子H相對于單核苷酸多態(tài)性rs800292的多態(tài)性。
12.權(quán)利要求1或2所述的方法進一步包括檢測樣品中補體因子H相對于單核苷酸多態(tài)性rs 1853883的多態(tài)性。
13.權(quán)利要求1或2所述的方法進一步包括檢測樣品中補體因子H相對于單核苷酸多態(tài)性rsl061170的多態(tài)性。
14.權(quán)利要求1或2所述的方法包括檢測LOC387715中的等位基因變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，等位基因變體是產(chǎn)生一種非-功能基因產(chǎn)物并改變基因產(chǎn)物表達的突變體。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，等位基因變體是一個或一個以上移碼突變，啟動子突變和剪切突變。
17.權(quán)利要求1或2所述的方法進一步包括識別所述樣品中顯示增加或者減少的年齡-相關黃斑病斑易感性的補體因子H多態(tài)性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中識別的多態(tài)性對應于單核苷酸多態(tài)性rs800292、rsl061170 和 rsl853883 中的一個。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，包括使用核酸擴增方法定義檢測多態(tài)性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，核酸擴增方法包括PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，等溫擴增，基于核酸序列擴增(NASBA)，5’熒光核酸方法，核酸信標方法和滾環(huán)擴增中的一種。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，包括使用陣列檢測多態(tài)性。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法,其中陣列包括一種或一種以上的試劑,用于在核酸樣本中鑒定相應于一種或一種以上單核甘酸多態(tài)性rs4146894，rsl045216, rs4405249,rsl882907, rsl0490923, rs760336、rs763720，和 rsl803403 的等位基因變體的存在。
23.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，在一個或者兩個等位基因上存在胸腺嘧啶顯示了增加的末階段年齡相關黃斑病變的易感性，并且在兩個等位基因上存在鳥嘌呤顯示了減少的末階段年齡相關黃斑病變的易感性。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，在一個或者兩個等位基因上存在胸腺嘧啶顯示了增加的地圖狀萎縮或脈絡膜新生血管膜的一個或者兩個的易感性，并且在兩個等位基因上存在鳥嘌呤顯示了減少的地圖狀萎縮或脈絡膜新生血管膜的一個或者兩個的易感性。
25.—種體外檢測包括與年齡-相關黃斑病變易感性有關的蛋白樣品的方法，包括從LOC387715的基因產(chǎn)物中識別等位基因變異同型體，其中所述同型體在其69位點上包括絲氨酸表示增加的年齡-相關黃斑病變的易感性，在其69位點上包括丙氨酸表示減少的年齡-相關黃斑病變的易感性。
全文摘要
基因PLEKHAL和LOC387715中的等位基因變異在這里作為年齡相關黃斑變性(ARM)危險因子被識別。因而提供了一種方法用于識別個體中發(fā)生ARM的危險性，包括識別PLEKHAL和/或LOC387715中含有等位基因變異體。相關的設備，如陣列，經(jīng)鑒定可用于實施這些方法。
文檔編號C12Q1/68GK103060449SQ201210585809
公開日2013年4月24日 申請日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月8日
發(fā)明者邁克爾·B·高瑞, 丹尼爾·E·威克斯, 耶維特·P·孔利, 羅伯特·費瑞爾, 約翰納·加科伯斯多緹爾, 特瑪麥·S·馬何-費瑞瑟 申請人:匹茲堡大學