專利名稱：一種重組豬白細(xì)胞介素2及其編碼基因和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組豬白細(xì)胞介素2及其編碼基因，以及其表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素2 (Interleukin-2，簡稱IL-2)是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子，能激活T細(xì)胞和促進(jìn)B細(xì)胞分化和分泌抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)單核細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞(natural killer c ell,簡稱NK)的殺傷活性,在機(jī)體的免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用，是一類天然的免疫增強(qiáng)劑。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域商品化的重組人白細(xì)胞介素2已經(jīng)用于腫瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的治療。在動物醫(yī)療中，由于白細(xì)胞介素2能提高疫苗的免疫應(yīng)答和減少疾病的發(fā)生，從而也展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。目前，對雞、牛白細(xì)胞介素2基因的研究較多，均已在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中雞的重組白細(xì)胞介素2能與多種病原疫苗一起使用，可顯著提高免疫水平，減少應(yīng)激，緩解疫苗的副反應(yīng)，并有很強(qiáng)的治療作用。但對于豬白細(xì)胞介素2基因的研究則較少，更沒有豬白細(xì)胞介素2在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)、純化等方面的研究。而我國是世界上養(yǎng)豬大國，豬的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發(fā)病率和死亡率最高，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，提供一種生產(chǎn)量高適于產(chǎn)業(yè)化且對這些病毒性疾病的治療和預(yù)防有效且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的產(chǎn)品成為養(yǎng)豬業(yè)的首要任務(wù)。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，原核表達(dá)系統(tǒng)是最早被采用進(jìn)行研究的，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)例如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)等，更重要的是原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，目的蛋白常以生物活性較低的包涵體形式表達(dá)。而包涵體的復(fù)性是一個復(fù)雜的過程，針對不同蛋白的個體差異性較大。如果復(fù)性條件應(yīng)用的不適宜將導(dǎo)致分子內(nèi)二硫鍵錯配，分子間共價結(jié)合或疏水結(jié)合形成聚合體，不僅降低重組蛋白的比活率，造成產(chǎn)品質(zhì)量不合格，同時又易產(chǎn)生沉淀析出，影響得率。因此，本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是采用合適的方法將大腸桿菌表達(dá)的重組豬白細(xì)胞介素2包涵體進(jìn)行復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，通過密碼子優(yōu)化的方式，提供一種可在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)重組豬白細(xì)胞介素2以及其基因和表達(dá)、純化、復(fù)性方法。本發(fā)明提供了一種重組豬白細(xì)胞介素2，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明提供了編碼上述所述重組豬白細(xì)胞介素2的基因，其堿基序列如SEQ IDNO :1所示。該序列是專為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達(dá)效率。本發(fā)明還提供了包含了上述所述編碼重組豬白細(xì)胞介素2的基因的載體，所述的載體優(yōu)選為原核表達(dá)質(zhì)粒，最優(yōu)選為pET21b。本發(fā)明還提供了包含有上述所述載體的大腸桿菌菌株，優(yōu)選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。本發(fā)明還提供了重組豬白細(xì)胞介素2在大腸桿菌表達(dá)方法，包括如下步驟該方法的步驟為1.挑取一個含有上述所述重組豬白細(xì)胞介素2的大腸桿菌菌落，接入50mL的LB培養(yǎng)液，在250mL搖瓶中于37 °C培養(yǎng)過夜；2.取5mL過夜培養(yǎng)物接入于500mL的LB培養(yǎng)液中，在2L搖瓶中于37°C震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(A6qq=L O);3.在培養(yǎng)物中加入IPTG至lmmol/L，于37°C，誘導(dǎo)表達(dá)4h后，于4°C以5000rpm/min，離心處理15min收集含有重組豬白細(xì)胞介素2的大腸桿菌菌體沉淀。所述LB培養(yǎng)液中均含有氨芐青霉素50-100 μ g/mL。本發(fā)明還提供了重組豬白細(xì)胞介素2的包涵體純化方法，包括如下步驟1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸，并于4°C高速離心處理；重復(fù)一次。2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液BufTerA3-10mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(菌體濕重)菌體加入3-10 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為lOOmg/mL的溶菌酶，于冰上攪動。4.破碎菌體，樣品置于冰上，超聲，并于4°C高速離心處理，棄上清。5.沉淀用洗滌緩沖液Buffer B洗滌，并于4°C高速離心處理，沉淀包涵體，重復(fù)一次。6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30_60min。7.充分混勻后室溫高速離心處理，棄沉淀，取上清，即得到重組豬白細(xì)胞介素2變性溶液。該純化方法優(yōu)選步驟如下1.將收集得到的上述含有誘導(dǎo)重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的PBS重懸,于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min ;重復(fù)一次。2.吸去上清，稱菌體沉淀重量，每克(菌體濕重)加入裂解緩沖液Buffer A5mL,用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(菌體濕重)菌體加入5 μ L濃度為100mmol/L的PMSF, 5 μ L濃度為IOOmg/HiL的溶菌酶，冰上攪動20min。4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置于冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環(huán)三次，每次循環(huán)至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min,棄上清。5.沉淀用洗漆緩沖液Buffer B洗漆,于4°C,以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min,沉淀包涵體，重復(fù)一次。6.包涵體沉淀用變性緩沖液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min。7.充分混勻后室溫下以12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心15min,棄沉淀,取上清，即得到重組豬白細(xì)胞介素2變性溶液。本發(fā)明還提供了優(yōu)化后的重組豬白細(xì)胞介素2的包涵體復(fù)性方法，包括如下步驟取適量用變性緩沖液Buffer C溶解的上述所述的重組豬白細(xì)胞介素2變性溶液，測其濃度，然后用變性緩沖液Buffer C將蛋白濃度稀釋到O. 2mg/mL，注入截留分子量IOKDa的透析卡中，4°C透析復(fù)性，每隔6h換一次復(fù)性緩沖液Buffer D。復(fù)性至24h時，將復(fù)性后重組蛋白溶液用O. 45 μ m濾膜過濾，即得到低濃度的重組豬白細(xì)胞介素2復(fù)性溶液。并可進(jìn)一步用截留分子量IOKDa的超濾脫鹽、濃縮，于真空冷凍干燥機(jī)低溫真空干燥，即獲得重組豬白細(xì)胞介素2粉末。 本發(fā)明的上述所述表達(dá)、純化、復(fù)性方法是經(jīng)過發(fā)明人反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)摸索和驗(yàn)證得到的用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組豬白細(xì)胞介素2的最為有效的方法，該方法的表達(dá)量高，且表達(dá)得到包涵體復(fù)性后活性更高。本發(fā)明還提供了重組豬白細(xì)胞介素2在制備治療和預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征、豬流感以及豬藍(lán)耳病疾病的藥物中的用途。在動物醫(yī)療中，由于白細(xì)胞介素2能提高疫苗的免疫應(yīng)答和減少疾病的發(fā)生率，重組豬白細(xì)胞介素2與多種病原疫苗聯(lián)合使用，可顯著提高免疫水平，減少應(yīng)激，緩解疫苗的副反應(yīng)，并有很強(qiáng)的治療作用。重組豬白細(xì)胞介素2也可作為新型免疫佐劑使用，這不僅能避免常規(guī)佐劑的不良反應(yīng)，顯著增強(qiáng)病毒、細(xì)菌和寄生蟲疫苗的免疫效力，提高抗體整齊度和延長抗體持續(xù)時間，并且還可以降低某些疫苗的副作用。本發(fā)明的經(jīng)優(yōu)化過的重組豬白細(xì)胞介素2的基因序列，更適于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)，所表達(dá)的重組豬白細(xì)胞介素2遠(yuǎn)高于豬白細(xì)胞介素2天然基因序列在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量。


圖1表示豬白細(xì)胞介素2密碼子優(yōu)化前后核苷酸序列比較其中，奇數(shù)行(即“原始序列”對應(yīng)的行)為豬白細(xì)胞介素2天然基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化前的序列；偶數(shù)行(即“優(yōu)化序列”對應(yīng)的行)為本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2的基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化后的序列。圖2-a、圖2-b為豬白細(xì)胞介素2密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)。其中，圖2-a表示豬白細(xì)胞介素2天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計(jì)算為O. 61 ;圖2-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中CAI指數(shù)經(jīng)過程序計(jì)算為O. 86。圖3-a、圖3-b為豬白細(xì)胞介素2密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖。其中，圖3_a表示豬白細(xì)胞介素2天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，從圖中可以看出豬白細(xì)胞介素2天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為13%;圖3-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2密碼子序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為O。圖4-a、圖4-b為豬白細(xì)胞介素2密碼子優(yōu)化前后在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量分布區(qū)域圖。其中，圖4_a表示豬白細(xì)胞介素2天然基因核苷酸序列在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為38. 97 %;圖4-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2密碼子在大腸桿菌表達(dá)宿主中平均GC堿基含量為48. 14%。圖5-a、圖5-b為豬白細(xì)胞介素2密碼子優(yōu)化前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。
圖5-a豬白細(xì)胞介素2天然基因mRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖，圖5_b為密碼子優(yōu)化后的本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2mRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。圖6為重組豬白細(xì)胞介素2表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程圖。圖7為重組豬白細(xì)胞介素2基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為500bp DNA Ladder ;泳道2為NdeI和XhoI酶切pET21b載體；泳道3為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的重組豬白細(xì)胞介素2基因PCR產(chǎn)物。圖8-a、圖8-b為重組豬白細(xì)胞介素2的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應(yīng)的免疫印跡圖。圖8-a為重組豬白細(xì)胞介素2SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10-230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液。圖8-b為重組豬白細(xì)胞介素2免疫印跡圖。其中，泳道l(10_230KDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker，泳道2為未加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液泳道3為加入IPTG誘導(dǎo)的重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液圖9重組豬白細(xì)胞介素2高效表達(dá)誘導(dǎo)條件優(yōu)化的SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為O. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)Ih的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道3為O. 5mmol/LIPTG誘導(dǎo)2h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道4為O. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道5為O. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道6為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)Ih的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道7為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道8為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道9為lmmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道10為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)Ih的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道11為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)2h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道12為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)3h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液；泳道13為1. 5mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h的含重組豬白細(xì)胞介素2大腸桿菌裂解液。
圖10重組豬白細(xì)胞介素2包涵體透析復(fù)性法和稀釋復(fù)性法對NK92細(xì)胞增殖影響曲線圖。在不同劑量濃度的重組豬白細(xì)胞介素2作用下，透析復(fù)性法所得重組豬白細(xì)胞介素2與稀釋復(fù)性法所得重組豬白細(xì)胞介素2對NK2細(xì)胞增殖率影響的曲線可知，前者對重組豬白細(xì)胞介素2包涵體的復(fù)性效果較好，所得重組蛋白生物活性較高。圖11為復(fù)性后的重組豬白細(xì)胞介素2包涵體SDS-PAGE電泳圖其中，泳道I為(10_230kDa)寬范圍的預(yù)染的蛋白上樣Marker ;泳道2為用BufferB第一次清洗后重組豬白細(xì)胞介素2 包涵體沉淀；泳道3為Buffer B第二次清洗后重組豬白細(xì)胞介素2包涵體沉淀；泳道4為透析法復(fù)性后的重組豬白細(xì)胞介素2。圖12為重組豬白細(xì)胞介素2活力測定曲線。圖12-a表示陽性對照人白細(xì)胞介素2對NK92細(xì)胞增殖率的影響，圖12_b表示陽性對照豬白細(xì)胞介素2對NK92細(xì)胞增殖率的影響，圖12-c表示與陰性對照相比，本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2對NK92細(xì)胞增殖率的影響。其中，由圖12-a、12-b、12_c可以看出，本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2和陽性標(biāo)準(zhǔn)品對照一樣，對NK92細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用；由12-c可以看出，與不用白細(xì)胞介素2處理的NK92細(xì)胞相比，在濃度為100ng/mL重組豬白細(xì)胞介素2樣品作用下，NK92細(xì)胞增殖了約5倍。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1重組豬白細(xì)胞介素2基因優(yōu)化設(shè)計(jì)1.密碼子優(yōu)化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons)。實(shí)際上,常用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達(dá)效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達(dá)效率。因此，在異源表達(dá)系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達(dá)。利用偏愛密碼子(preferred codons)并避免利用稀有的密碼子進(jìn)行基因合成，這種基因的重新設(shè)計(jì)叫密碼子優(yōu)化。優(yōu)化過程充分考慮到蛋白表達(dá)不同階段可能遇到的多種復(fù)雜因素，如密碼子適應(yīng)性、mRNA結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中不同的順式元件。因此，本發(fā)明對豬白細(xì)胞介素2的基因設(shè)計(jì)不僅包括密碼子優(yōu)化，還包括mRNA結(jié)構(gòu)修正、翻譯起始位點(diǎn)的優(yōu)化等。2.密碼子偏愛性優(yōu)化密碼子偏愛性在原核基因表達(dá)中已經(jīng)被證實(shí)是一個很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之間，蛋白的表達(dá)水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細(xì)胞內(nèi)可用的tRNAs量的差異。因此優(yōu)化翻譯系統(tǒng)最佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。在大腸桿菌中表達(dá)哺乳動物基因是不可預(yù)測和具有挑戰(zhàn)的，如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應(yīng)的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會影響基因的表達(dá)。3.將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子通?；蛑邪拿艽a子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達(dá)量也就越少，甚至當(dāng)這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時候表達(dá)量會更少。在不改變氨基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達(dá)水平。任何來源的密碼子如果在宿主生物體內(nèi)的利用率低于5%到10%時，就會出現(xiàn)表達(dá)抑制，當(dāng)這些低利用率密碼子臨近或相連時，對蛋白表達(dá)的影響更大。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運(yùn)動，這是基因不能以合適水平表達(dá)的一個明顯機(jī)制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使(含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子)時的運(yùn)動速
度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位于3’端，信使最后也會被核糖體“擁擠”而損害，核糖體又回到5’端。3’端低利用率密碼子簇的抑制效應(yīng)可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應(yīng)一樣大。如果低利用率密碼子簇位于5’端，其效應(yīng)是起始核糖體數(shù)目的全面減少，導(dǎo)致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子能夠防止低表達(dá)或者不表達(dá)。4.表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動子雖然密碼子偏愛在基因表達(dá)中起著重要的作用，但表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達(dá)對于低利用率密碼子和接近起始位點(diǎn)的密碼子AUG非常敏感。翻譯與mRNA的穩(wěn)定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會使mRNA由于缺少了核糖體的保護(hù)而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。其他因素也可以影響蛋白表達(dá)，包括使mRNA去穩(wěn)定的序列。穩(wěn)定mRNA 二級結(jié)構(gòu)和接近5'端的分子也對基因表達(dá)有重要的影響。利用翻譯時目的基因上游的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達(dá)效率。發(fā)明人根據(jù)GenBank已公開的豬白細(xì)胞介素2 (Sus scrofa interleukin2)的cDNA序列(GenBank登錄號NM_213861.1)，對該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2基因，如SEQ ID No:l所示。下面是對重組豬白細(xì)胞介素2進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化前后各參數(shù)對比如下1.密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)由圖2_a可知，密碼子沒有優(yōu)化前，豬白細(xì)胞介素2天然基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0. 61。由圖2-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，使得本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2基因在大腸桿菌中CAI指數(shù)為0. 86。通常CAI=I時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差，因此可以看出經(jīng)過了密碼子優(yōu)化后得到的基因序列可以提高重組豬白細(xì)胞介素2基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。2.最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons, FOP) 由圖3-a可知，基于大腸桿菌表達(dá)載體，密碼子沒有優(yōu)化前，豬白細(xì)胞介素2天然基因序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為13%。這條未進(jìn)行優(yōu)化的基因含有串聯(lián)稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，本發(fā)明的重組豬白細(xì)胞介素2基因在大腸桿菌系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率為O。3. GC 喊基含量(GC curve)GC含量理想分布區(qū)域?yàn)?0% -70%，在這個區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬白細(xì)胞介素2基因的GC堿基平均含量分布區(qū)域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬白細(xì)胞介素2天然基因中在優(yōu)化前GC堿基平均含量為38. 97%，由圖4-b中顯示出優(yōu)化后的序列消除了 GC含量在30% -70%區(qū)域外的60個堿基，最終得到優(yōu)化后重組豬白細(xì)胞介素2的GC堿基平均含量為48. 14%。3.優(yōu)化前后順式作用元件情況如下
權(quán)利要求
1.一種重組豬白細(xì)胞介素2，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—種編碼權(quán)利要求1中所述的重組豬白細(xì)胞介素2的基因，其堿基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.一種載體，所述載體具有權(quán)利要求2的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，所述載體為pET21b。
5.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權(quán)利要求3的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
7.—種重組豬白細(xì)胞介素2在大腸桿菌中的表達(dá)方法，包括如下步驟(O在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育權(quán)利要求5或6中所述的大腸桿菌；(2)從大腸桿菌和/或培養(yǎng)基中分離重組豬白細(xì)胞介素2。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)方法，包括如下步驟(1)挑取一個含有權(quán)利要求5或6中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養(yǎng)液， 培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入于含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期A = I O ·n600 丄· U，(3)在培養(yǎng)物中加入濃度為Immo I/L的IPTG，37°C，誘導(dǎo)表達(dá)4小時后，離心處理收集含有重組豬白細(xì)胞介素2的大腸桿菌菌體沉淀。
9.一種重組豬白細(xì)胞介素2的純化和復(fù)性方法，其特征在于，包含如下步驟(1)將權(quán)利要求8中所述的含有重組豬白細(xì)胞介素2的大腸桿菌菌體沉淀，用預(yù)冷的 PBS 重懸，于 4°C,以 12000rpm/min 離心 15min,重復(fù)一次；(2)吸去上清，按每克(菌體濕重)加入3-10mL裂解緩沖液BufferA，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起；(3)每克(菌體濕重)菌體加入3-10μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3-100 μ L濃度為 100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min ；(4)破碎菌體細(xì)胞，4°C，12000rpm/min離心，棄上清。(5)包涵體沉淀用洗漆緩沖液BufferB洗滌，4V，12000rpm/min離心15min,棄上清。 包涵體沉淀重復(fù)本步驟一次；(6)包涵體沉淀用變性緩沖液BufferC溶解，室溫?cái)嚢?0_60min ；(7)充分混勻后室溫條件下12000rpm/min離心15min,棄沉淀,取上清，即得到重組豬白細(xì)胞介素2變性溶液；(8)用變性緩沖液BufferC將重組豬白細(xì)胞介素2變性溶液的濃度稀釋至0. 2mg/mL, 4°C透析復(fù)性24小時，期間每6小時更換一次緩沖液Buffer D，重組豬白細(xì)胞介素2復(fù)性溶液經(jīng)濾膜過濾后，即得到重組豬白細(xì)胞介素2復(fù)性溶液。
10.如權(quán)利要求9所述的純化和復(fù)性方法，其特征在于，所述重組豬白細(xì)胞介素2復(fù)性溶液可進(jìn)一步用截留分子量IOKDa的超濾濃縮、脫鹽至最小體積，低溫真空干燥，即獲得重組豬白細(xì)胞介素2粉末。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組豬白細(xì)胞介素2及其編碼基因、表達(dá)、純化和包涵體復(fù)性方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。白細(xì)胞介素2在疾病發(fā)生過程中起到十分重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在動物疾病治療中應(yīng)用廣泛。為獲取大量的豬白細(xì)胞介素2，本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對密碼子優(yōu)化后的重組豬白細(xì)胞介素2基因進(jìn)行異源表達(dá)。此外，由于原核表達(dá)體系中的豬白細(xì)胞介素2多以包涵體的形式表達(dá)，本發(fā)明還提供了重組白細(xì)胞介素2包涵體純化方法，并對該包涵體的復(fù)性方法進(jìn)行了篩選。最終本發(fā)明所得重組白細(xì)胞介素2活力為1.05x107IU/ml，是國際公認(rèn)的豬白細(xì)胞介素2標(biāo)準(zhǔn)品活力的1.05倍，完全達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號C12N15/26GK103012578SQ20121058491
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司, 常州京森生物醫(yī)藥研究所有限公司