專利名稱:一種云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明一種云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法,屬于生物工程和食藥用菌技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
云芝屬擔(dān)子菌綱多孔菌科云芝屬真菌,云芝是極具藥用價(jià)值的真菌之一。研究發(fā)現(xiàn)云芝含多糖類、糖肽類、留體類、三萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、葡糖醇類、蛋白質(zhì)類等29種化合物,還含胞外黏性物質(zhì)(ECMM)、胃蛋白酶抑制劑、真菌激發(fā)子、鐵黏合螯合劑、環(huán)肽、18種人體所需的氨基酸和維生素B1、B2、B6及銅、鐵、鉀、鋅等10多種人體所需的活性微量元素等其他類化合物。云芝具有清熱解毒、消炎抗癌、保肝等功效,常用于去濕、化痰、療肺疾,治療慢性支氣管炎、遷延性慢性肝炎等。云芝多糖和云芝三萜、氨基酸等活性成分,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗放射和抗化療、鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心及抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血脂、降血糖、平喘、保肝、抗缺氧和抗衰老等作用。云芝具有廣泛的藥理作用和極高的藥用價(jià)值,隨著國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)云芝更深入全面的藥理研究,云芝的藥用價(jià)值將得到更廣泛的挖掘和應(yīng)用。產(chǎn)量高、生物性狀優(yōu)異、生產(chǎn)性狀良好的云芝菌種是保障云芝生產(chǎn)和云芝產(chǎn)業(yè)良好發(fā)展的先決條件,從野外分離的云芝菌種大多產(chǎn)量不高,需要經(jīng)過人工馴化和不斷的選育,以提高云芝的產(chǎn)量和生產(chǎn)性狀,因此,菌種的選育方 面的研究就顯得尤為重要。自然選育的效率較低,而采取人工選育的方法效果較好,云芝作為一種大型真菌,有其自身的特點(diǎn),其新菌種的選育研究離不開食用菌育種方面的研究。而云芝抗病品種室內(nèi)篩選的新方法為食用菌誘變育種、雜交育種和原生質(zhì)體融合育種,提供抗病出發(fā)菌株,為云芝抗病高產(chǎn)新菌株的篩選提供了抗病出發(fā)菌株。同時(shí)云芝抗病菌株的篩選,為云芝的生產(chǎn)提供了有力的保障,提高了生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)效益。目前食用菌室內(nèi)抗病篩選方法并不是很多,通常食用菌抗病品種室內(nèi)篩選的方法,主要通過拮抗試驗(yàn)來確定,看菌絲拮抗線處食用菌菌絲的生長(zhǎng)強(qiáng)弱和對(duì)病原菌菌絲的覆蓋情況來判斷,這種方法沒有一定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),完全是通過人為的感官分析,通常會(huì)出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)速度快抗病率就強(qiáng)的錯(cuò)誤觀點(diǎn),最后還是要通過復(fù)雜的出菇試驗(yàn),通過室外建立病原菌感染食用菌子實(shí)體模式來鑒定,一是工作量大,同時(shí)受環(huán)境因素的影響;目前有關(guān)通過食用菌液體發(fā)酵過程中接入病原細(xì)菌,最后看食用菌菌絲的得率與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比得出抗病率,有一定的科學(xué)性,而霉菌病害是真菌,真菌菌絲和食用菌菌絲混在一起就沒有辦法清除,此種方法就不適用;也有研究報(bào)道運(yùn)用病原菌的發(fā)酵液直接涂布平板,或者經(jīng)過一定的溫度滅活用多層紗布過濾后涂布平板試驗(yàn),看食用菌品種的抗病率。病原菌未完全清除,平板試驗(yàn)無法判斷,或者是病菌毒素被高溫破壞,試驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確,有很多的缺陷,而且沒有建立完全科學(xué)的評(píng)價(jià)體系,實(shí)驗(yàn)的偶然性很大。目前有關(guān)食用菌抗病品種室內(nèi)篩選的方法還在不斷的研究試驗(yàn)當(dāng)中。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種云芝抗病高產(chǎn)新菌株的室內(nèi)篩選方法,獲得抗病出發(fā)菌株。本發(fā)明的技術(shù)方案:一種云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法:
確定兩種主要病原菌(細(xì)菌、青霉菌),以云芝進(jìn)行抗病品種篩選;
通過引進(jìn)市售的8種不同的云芝菌株進(jìn)行抗病能力測(cè)定,這8種云芝菌株分別命名為:SYZ USYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8 ;
通過對(duì)病原菌的液體發(fā)酵培養(yǎng),病原菌的發(fā)酵產(chǎn)物離心得到上清液,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾得到無菌濾液,得到的無菌濾液再進(jìn)行云芝菌株的平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),利用打孔接種,通過PDA平板培養(yǎng),利用云芝菌株菌圈生長(zhǎng)的大小與未涂布病原菌發(fā)酵產(chǎn)物濾液的PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)照菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性;
通過對(duì)不同云芝的生長(zhǎng)速度測(cè)定,根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、對(duì)青霉菌的平均抗性,建立綜合評(píng)分體系,以確定不同云芝菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株;篩選步驟為:
(O實(shí)驗(yàn)方法的建立:細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物通過離心得到上清液,在45°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,以確保發(fā)酵產(chǎn)物的生理活性不被破壞,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾,得到的無菌濾液再進(jìn)行云芝菌株的平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),要求PDA平板倒好后放置3天或者用無菌風(fēng)吹干,以便濾液能被平板吸收及均勻的涂布平板;
(2)確定試驗(yàn)的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度:利用兩種云芝菌株對(duì)不同濃度的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液進(jìn)行抗病抑制試驗(yàn),通過試驗(yàn)效果以確定最佳試驗(yàn)的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度;
(3)確定發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的涂布量:在確定病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度的基礎(chǔ)上,再通過平板涂布濾液量的大小對(duì)兩種云芝菌株所產(chǎn)生的抑制試驗(yàn)效果,確定發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的涂布量;
(4)確定平均抗性:8種不同的云芝菌株在確定的細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液濃度、確定的平板涂布量的條件下,利用打孔接種,通過PDA平板培養(yǎng),利用云芝菌圈生長(zhǎng)的大小與對(duì)照(沒有涂布發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的PDA平板試驗(yàn))菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性:
抗性水平=(試驗(yàn)菌圈直徑/對(duì)照菌圈直徑)X 100% ;
(5)抗病性聚類分析:對(duì)不同云芝菌株的抗性水平進(jìn)行方差分析,再進(jìn)行不同云芝菌株的抗病性聚類分析得出高抗菌株;
(6)生長(zhǎng)速度聚類分析:通過PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)8種不同云芝菌株的生長(zhǎng)速度進(jìn)行測(cè)定。通過8種不同云芝菌株的生長(zhǎng)速度的聚類分析得出生長(zhǎng)速度快的云芝菌株。(7)綜合評(píng)分:根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、對(duì)青霉菌的平均抗性,建立綜合評(píng)分體系,以確定不同云芝菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株。(8)通過云芝菌株的栽培試驗(yàn)以最終確定篩選出的云芝菌株的抗病能力。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明是一種綜合的評(píng)價(jià)體系,本體系的建立主要來自于我們常用的細(xì)菌、霉菌等病原菌抗藥性篩選,篩選最佳抗病藥物的方法而得來的,具有科學(xué)性、適用性、方法的簡(jiǎn)便性。
云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法與目前一些食用菌抗病品種室內(nèi)篩選方法相比的優(yōu)點(diǎn)在于:①通常食用菌抗病品種室內(nèi)篩選的方法,主要通過拮抗試驗(yàn)來確定,一般室內(nèi)采用病原菌的菌絲和食用菌菌絲的拮抗反應(yīng),看菌絲拮抗線處食用菌菌絲的生長(zhǎng)強(qiáng)弱和對(duì)病原菌菌絲的覆蓋情況來判斷,這種方法沒有一定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),完全是通過人為的感官分析,通常會(huì)出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)速度快抗病率就強(qiáng)的錯(cuò)誤觀點(diǎn),最后還是要通過復(fù)雜的出菇試驗(yàn),通過室外建立病原菌感染食用菌子實(shí)體模式來鑒定,一是工作量大,同時(shí)受環(huán)境因素的影響,業(yè)內(nèi)都知道這不是一種很可靠的方法,但也沒有最佳的室內(nèi)篩選方法。而云芝抗病品種室內(nèi)篩選的新方法,根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、青霉菌的平均抗性,建立評(píng)分體系,以確定不同云芝菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株。所建立評(píng)價(jià)體系是一個(gè)綜合的評(píng)價(jià)體系,具有科學(xué)性和實(shí)用性以及方法簡(jiǎn)便。②現(xiàn)在出現(xiàn)一種室內(nèi)篩選抗病品種新方法通過食用菌液體發(fā)酵過程中接入病原菌,最后看食用菌菌絲的得率與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比得出抗病率,有一定的科學(xué)性,但病原菌的發(fā)酵菌體不能完全清除,對(duì)于細(xì)菌可以用水沖洗掉,而霉菌病害也是真菌,菌絲和食用菌菌絲混在一起就沒有辦法清除,此種方法就不適用。而云芝抗病品種室內(nèi)篩選的新方法利用發(fā)酵產(chǎn)物(發(fā)酵濾液)對(duì)食用菌菌絲的抑制情況來判斷,適用性很廣。③最近還有一種室內(nèi)抗病性篩選方法,運(yùn)用病原菌的發(fā)酵液直接涂布平板,或者經(jīng)過一定的溫度滅活用多層紗布過濾后涂布,看食用菌品種的抗病率,這種方法和本發(fā)明的云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法原理差不多,但有很多的缺陷,一是病原菌沒有完全清除,涂布一到二天后病原菌以長(zhǎng)滿平板使實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行下去,或者發(fā)酵液經(jīng)過滅活或滅菌病原菌發(fā)酵產(chǎn)物的活性成分受到破壞,而且沒有建立完全科學(xué)的評(píng)價(jià)體系,實(shí)驗(yàn)的偶然性很大。而本發(fā)明建立的云芝抗病 品種室內(nèi)篩選的方法通過細(xì)菌濾膜清除病原菌,病原菌發(fā)酵濾液在低溫濃縮然后進(jìn)行平板涂布實(shí)驗(yàn),完全克服了上述缺點(diǎn),具有科學(xué)性。通過對(duì)病原菌的液體發(fā)酵培養(yǎng),病原菌(細(xì)菌、青霉菌)的發(fā)酵產(chǎn)物通過離心得到上清液,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾,得到的無菌濾液再進(jìn)行云芝菌株的平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),利用打孔接種,通過PDA平板培養(yǎng),利用云芝菌株菌圈生長(zhǎng)的大小與對(duì)照(沒有涂布發(fā)酵產(chǎn)物濾液的PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn))菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性,抗性水平=(試驗(yàn)菌圈直徑/對(duì)照菌圈直徑)x 100%,通過對(duì)不同云芝的生長(zhǎng)速度測(cè)定,最后根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、對(duì)青霉菌的平均抗性,建立綜合評(píng)分體系,以確定不同菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株。本發(fā)明是一種綜合的評(píng)價(jià)體系,本體系的建立主要來自于我們常用的細(xì)菌、霉菌等病原菌抗藥性篩選,篩選最佳抗病藥物的方法而得來的,具有科學(xué)性、適用性、方法的簡(jiǎn)便性。本發(fā)明建立的云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法通過細(xì)菌濾膜清除病原菌,病原菌發(fā)酵濾液在低溫濃縮后進(jìn)行平板涂布實(shí)驗(yàn),完全克服了上述缺點(diǎn),具有科學(xué)性;目前尚未見到有關(guān)云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法的任何報(bào)道。
圖18種不同云芝品種對(duì)細(xì)菌的抗性聚類分析圖。圖28種不同云芝品種對(duì)青霉菌抗性聚類分析圖。圖38種不同云芝品種生長(zhǎng)速度聚類分析圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:下述實(shí)施例是說明性的,不是限定性的,不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法,其步驟是:
1、云芝代表病原菌進(jìn)行篩選,確定兩種主要病原菌(細(xì)菌、青霉菌)。從江蘇安惠生物科技有限公司及東北、安徽等云芝生產(chǎn)基地進(jìn)行病原菌的采集,然后進(jìn)行病原菌的實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)分析試驗(yàn),再進(jìn)行云芝生產(chǎn)基地的病原菌回接確認(rèn)試驗(yàn),最后確定兩種主要病原菌為細(xì)菌(革蘭氏陽性菌)、霉菌(青霉菌)。2、通過引進(jìn)8種不同的云芝菌株進(jìn)行抗病能力測(cè)定。(I)從國(guó)內(nèi)各省云芝主產(chǎn)區(qū)引進(jìn)市售的不同品種的云芝菌種8株。接種于PDA斜面培養(yǎng)基上,28°C避光培養(yǎng)7天進(jìn)行活化。8種云芝菌株分別為:SYZ USYZ 2,SYZ 3、SYZ
4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8。(2)病原菌的培養(yǎng)。細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基,170轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)式搖床30°C避光培養(yǎng)4天;青霉菌用H)液體培養(yǎng)基,140轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)式搖床28°C避光培養(yǎng)5天,發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘去除菌體,離心后的菌液備用。(3)細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物,通過離心得到上清液,利用45°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾得到濾液,利用兩種云芝菌株對(duì)不同濃度濾液進(jìn)行抗病抑制試驗(yàn),通過試驗(yàn)效果以確定最佳試驗(yàn)的發(fā)酵產(chǎn)物濾液的濃度。①細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾得到濾液分3種處理方式:發(fā)酵濾液不濃縮、濃縮至50%、及濃縮至25%。分別以0.1 mL涂布PDA平板,每種處理涂布3塊PDA平板。②從8種云芝菌株挑選2株菌株SYZ 3、SYZ 8,利用打孔接種,通過PDA平板26°C恒溫培養(yǎng),利用菌圈生長(zhǎng)的大小與對(duì)照(沒有涂布發(fā)酵產(chǎn)物濾液的PDA平板試驗(yàn))菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性:抗性水平=(試驗(yàn)菌圈直徑/對(duì)照菌圈直徑)X 100%,試驗(yàn)結(jié)果:濃縮至25%的細(xì)菌有抑制云芝菌絲生長(zhǎng)效果,而青霉菌發(fā)酵產(chǎn)物濾液抑制云芝菌絲生長(zhǎng)效果不明顯,特別是SYZ 8幾乎沒變化。細(xì)菌、青霉菌發(fā)酵產(chǎn)物濾液不同濃度抑制情況表
權(quán)利要求
1.一種云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法,其特征在于: 以細(xì)菌、青霉菌為病原菌,對(duì)云芝進(jìn)行抗病品種篩選; 通過引進(jìn)市售的8種不同的云芝菌株進(jìn)行抗病能力測(cè)定,這8種云芝菌株分別命名為:SYZ USYZ 2、SYZ 3、SYZ 4、SYZ 5、SYZ 6、SYZ 7、SYZ 8 ; 通過對(duì)病原菌的液體發(fā)酵培養(yǎng),病原菌的發(fā)酵產(chǎn)物離心得到上清液,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾得到無菌濾液,得到的無菌濾液再進(jìn)行云芝菌株的平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),利用打孔接種,通過PDA平板培養(yǎng),利用云芝菌株菌圈生長(zhǎng)的大小與未涂布病原菌發(fā)酵產(chǎn)物濾液的PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)照菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性; 通過對(duì)不同云芝的生長(zhǎng)速度測(cè)定,根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、對(duì)青霉菌的平均抗性,建立綜合評(píng)分體系,以確定不同云芝菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株;篩選步驟為: (1)實(shí)驗(yàn)方法的建立:細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物通過離心得到上清液,在45°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,以確保發(fā)酵產(chǎn)物的生理活性不被破壞,然后利用細(xì)菌濾膜進(jìn)行過濾,得到的無菌濾液再進(jìn)行云芝菌株的平板涂布培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),要求PDA平板倒好后放置3天或者用無菌風(fēng)吹干,以便濾液能被平板吸收及均勻的涂布平板; (2)確定試驗(yàn)的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度:利用兩種云芝菌株對(duì)不同濃度的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液進(jìn)行抗病抑制試驗(yàn),通過試驗(yàn)效果以確定最佳試驗(yàn)的病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度; (3)確定發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的涂布量:在確定病原菌發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的濃度的基礎(chǔ)上,再通過平板涂布濾液量的大小對(duì)兩種云芝菌株所產(chǎn)生的抑制試驗(yàn)效果,確定發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的涂布量; (4)確定平均抗性:8種不同 的云芝菌株在確定的細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液濃度、確定的平板涂布量的條件下,利用打孔接種,通過PDA平板培養(yǎng),利用云芝菌株菌圈生長(zhǎng)的大小與未涂布發(fā)酵產(chǎn)物無菌濾液的PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)照菌株菌圈生長(zhǎng)的大小進(jìn)行比較,得出平均抗性: 抗性水平=(試驗(yàn)菌圈直徑/對(duì)照菌圈直徑)X 100% ; (5)抗病性聚類分析:對(duì)不同云芝菌株的抗性水平進(jìn)行方差分析,再進(jìn)行不同云芝菌株的抗病性聚類分析得出高抗菌株; (6)生長(zhǎng)速度聚類分析:通過PDA平板培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)8種不同云芝菌株的生長(zhǎng)速度進(jìn)行測(cè)定:通過8種不同云芝菌株的生長(zhǎng)速度的聚類分析得出生長(zhǎng)速度快的云芝菌株; (7)綜合評(píng)分:根據(jù)不同云芝的生長(zhǎng)速度、對(duì)細(xì)菌的平均抗性、對(duì)青霉菌的平均抗性,建立綜合評(píng)分體系,以確定不同云芝菌株的抗病能力,篩選出最佳抗病云芝菌株; (8)通過云芝菌株的栽培試驗(yàn)以最終確定篩選出的云芝菌株的抗病能力。
全文摘要
一種云芝抗病品種室內(nèi)篩選的方法,屬于生物工程和食藥用菌技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先對(duì)云芝確定兩種主要病原菌細(xì)菌、青霉菌,引進(jìn)不同的云芝菌株,對(duì)細(xì)菌、青霉菌抗病能力進(jìn)行篩選,建立云芝抗病能力篩選的模式;由于食用菌的細(xì)菌及霉菌性病害主要通過病原菌分泌的毒素來抑制食用菌菌絲生長(zhǎng),造成食用菌產(chǎn)生各種病害;還有就是食用菌菌絲的生長(zhǎng)與病原菌菌絲的生長(zhǎng)強(qiáng)弱之間的競(jìng)爭(zhēng)來確定食用菌抑制病原菌的能力。因此,通過PDA平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),利用細(xì)菌、青霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)不同云芝生長(zhǎng)的抑制能力與對(duì)照菌株進(jìn)行對(duì)比,得出不同云芝菌株的平均抗性,以及不同的云芝菌株生長(zhǎng)速度,建立評(píng)分體系,經(jīng)過綜合評(píng)判,室內(nèi)篩選出抗病能力強(qiáng)的菌株,最后經(jīng)云芝實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK103114125SQ20121058190
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者鄭惠華, 汪潔, 劉廣建, 全衛(wèi)豐, 蔣益, 季宏更, 薛璟 申請(qǐng)人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司, 江蘇安惠生物科技有限公司