專利名稱：一種鑒別安徽霍山產(chǎn)金線蓮及其相似種的分子標(biāo)記指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金線蓮的指紋圖譜，尤其是涉及金線蓮種質(zhì)鑒定指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)有23種左右，為多年生草本植物，通稱金線蓮或金線蘭，素有“藥王”、“金草”、“神藥”、“鳥人參”等美稱。在我國(guó)主要分布于亞熱帶地區(qū)即福建、廣東、廣西、浙江、江西、海南、云南、四川、貴州以及西藏南部等省區(qū)，其中以閩、浙、贛和臺(tái)灣為主產(chǎn)地。金線蓮是我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥材，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛之功效，對(duì)無名腫痛、發(fā)燒、止瀉、蛇傷均有顯著療效，且使用安全、無毒副作用[3]。經(jīng)有關(guān)部門測(cè)定發(fā)現(xiàn)，金絲蓮中氨基酸組成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于國(guó)產(chǎn)和野生西洋參。幾百年來作為民間常用草藥。經(jīng)閩臺(tái)各大醫(yī)院臨床應(yīng)用，金線蓮具有肝保護(hù)、抗HBV、抗氧化、抗腫瘤活性、降高血糖、降高血脂、降高血壓、降高尿酸、小兒哮喘、小兒抽動(dòng)-穢語、抗炎、利尿、鎮(zhèn)靜、止痛等多種治療功效。同時(shí)，金線蓮株型小巧、葉型優(yōu)美、葉脈金黃色呈網(wǎng)狀排列是觀賞價(jià)值極高的室內(nèi)觀葉珍品。由于金線蓮的優(yōu)良品質(zhì)，其日益受到世人青睞，但金線蓮的分類和不同種間的藥效差別一直沒有定論，在民間，藥商將花葉開唇蘭屬中帶黃色或白色葉脈的種類以及斑葉蘭屬(Goodyera)中外形近似種均當(dāng)作金線蓮收購。在 人工栽培中也是將花葉開唇蘭屬與斑葉蘭屬中很多種都當(dāng)作金線蓮，還有血葉蘭也叫金線蓮，造成金線蓮種源混雜。這與中藥材規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化要求相去甚遠(yuǎn)，也會(huì)給規(guī)?；a(chǎn)帶來風(fēng)險(xiǎn)，所以急需開展金線蓮優(yōu)良種源篩選和鑒定研究，以期篩選和保護(hù)農(nóng)藝性狀優(yōu)良、藥用成分含量高的優(yōu)良品種資源，為其進(jìn)一步大規(guī)模開發(fā)利用和科學(xué)研究提供參考和借鑒。安徽霍山是已知蘭科植物一金線蓮地理分布的最北端，其特殊的地理環(huán)境和生態(tài)環(huán)境使霍山產(chǎn)金線蓮的品質(zhì)與眾不同，為保護(hù)和開發(fā)利用這一優(yōu)異品種，大別山瀕危蘭科植物保育科學(xué)研究中心聯(lián)合安徽六市同濟(jì)生生物科技有限責(zé)任公司開展了種質(zhì)資源鑒定研究。1994年，加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等首次發(fā)明了串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)間片段多態(tài)性標(biāo)記(ISSR, Inter simple sequence repeat, ISSR)技術(shù),之后ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在全世界不斷得到推廣和應(yīng)用。由于SSR序列在基因組中廣泛分布(Roderetal.，1998)，且等位變異特別豐富，因此ISSR與其它多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)RFLP、AFLP和RAPD相比，可以檢測(cè)到更高的多態(tài)性，同時(shí)錨定堿基使基因組上只有那些與錨定堿基匹配的位點(diǎn)才能被靶定，避免了 SSR在基因組上的滑動(dòng)，大大提高了 PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，因而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)非常適合于種間和種下關(guān)系的分析。本文利用ISSR-PCR技術(shù)對(duì)安徽、湖北、廣東、福建和臺(tái)灣等5省10地用于藥用的優(yōu)質(zhì)金線蓮品種進(jìn)行了居群間的種下鑒別，旨在建立一個(gè)較為完整可靠的金線蓮ISSR — PCR反應(yīng)系統(tǒng)，為今后研究金線蓮地理種源的群體遺傳多態(tài)性和廣泛的良種選育與雜交提供分子水平上的參考和借鑒。雖然通過保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，依據(jù)核苷酸序列來鑒定藥用植物的方法具有科學(xué)性和可靠性，但存在成本高、程序復(fù)雜和耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。本發(fā)明研究利用ISSR分子標(biāo)記方法來鑒定金線蓮及其相似種，通過對(duì)金線蓮及其相似種植物的ISSR分子標(biāo)記指紋圖譜研究，具有多態(tài)性豐富，差異穩(wěn)定，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)鑒定藥用植物的方法成本高、程序復(fù)雜和耗時(shí)長(zhǎng)的問題，本發(fā)明提供一種鑒定操作簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、分辨率高的金線蓮及其相似種的分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建金線蓮的分子標(biāo)記指紋圖譜，并利用所構(gòu)建的指紋圖譜實(shí)現(xiàn)安徽霍山紅葉金線蓮及其相似種的鑒定。本發(fā)明的具體操作，包括以下步驟( I)新鮮金線蓮樣品預(yù)處理將新鮮金線蓮樣品避光6個(gè)小時(shí)以上消耗淀粉，取新鮮的金線蓮葉片10克，用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，擦干；(2)樣品基因組DNA的提取采用改進(jìn)的CTAB法提取金線蓮葉片基因組DNA，操作如下I)將預(yù)處理后的葉片放入冰凍過的陶瓷研缽中，并加入適量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末狀，用藥匙將葉片粉末迅速轉(zhuǎn)移到IOml預(yù)冷Eppendorf離心管中，粉末的高度達(dá)到離心管 的1/3處，停止加入粉末；2)在離心管中加入4ml 65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[2%(v/w)CTAB，1. 4M NaCl,20mM EDTA，IOOmM Tris-HCl (ΡΗ=8· O)，2%巰基乙醇]；3)65°C溫浴2h，中間每IOmin反轉(zhuǎn)I 2次；4) 15000rpm離心8min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；5)冷卻至室溫后，輕柔加入等體積的氯仿和異戊醇溶液，其中氯仿和異戊醇的體積比為24 1，輕緩顛倒40min;6) 15000rpm室溫離心IOmin,去沉淀,將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；7)在上清液加入2/3體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20°C放置1. 5h以上；8) 15000rpm 離心 IOmin,去上清液；9)用2ml 75%乙醇洗兩次以去除鹽，再用無水乙醇洗一次；10)倒去乙醇，37°〇干燥201^11，溶于60(^1^緩沖液，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中；11)加入 5 μ L 終濃度為 50 μ L/mL RnaseA, 37°C溫浴 Ih ；12)用等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液對(duì)上述步驟(11)產(chǎn)生的溶液抽提2次，按體積比，酚氯仿異戊醇=25 :24:1;13) 15000rpm 離心 IOmin,取上清液；14)加入2倍體積的無水乙醇，_20°C保溫lh，每20min翻轉(zhuǎn)一次；15) 15000rpm離心，先用_20°C預(yù)冷的75%乙醇溶液洗滌沉淀2_3次，再用無水乙
醇洗滌一次。
16) 37°C溫浴干燥DNA，加入100 μ LTE緩沖液溶解備用，4°C保存?zhèn)溆茫?3) ISSR-PCR 擴(kuò)增利用所提取的樣品基因組DNA作為模板，在德國(guó)Eppendorf 5331梯度PCR儀上進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系特征為模板濃度25 ng/L，引物濃度O. 5 μ mol · L-1，Mg2+濃度 2. Ommol · L_S dNTP 濃度 200 μ mol · L—1，Taq 聚合酶濃度 1U/20 μ I ；PCR擴(kuò)增程序條件為94°C預(yù)變性8分鐘，94°C變性45秒，58_62°C退火45秒，72°C延伸2分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后于72°C終延伸10分鐘；ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到不同金線蓮樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物貯存在一20°C冰箱中；(4 )瓊脂糖凝膠電泳以4省10地金線蓮的基因組DNA為模板，以其中兩種引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L-15 μ L在1. 5 %的瓊脂糖凝膠上于3V/cm的電壓下電泳2. 5h，經(jīng)EB顯色，并用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果；(5)各供試樣品的ISSR-PCR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建把ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到不同新鮮金線蓮樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳，根據(jù)呈現(xiàn)的條帶建立圖譜以金線蓮品系編號(hào)為橫坐標(biāo)，以條帶存在的位點(diǎn)編號(hào)為縱坐標(biāo)，在每一縱橫坐標(biāo)交結(jié)處，有擴(kuò)增帶用表示，沒有擴(kuò)增帶不作標(biāo)記，“有”帶或“無”帶以總亮度值作為選擇依據(jù)，采用Bandscan軟件，選取亮度值在> O. 2為有擴(kuò)增帶，< O. 2的為沒有擴(kuò)增帶；(6)將構(gòu)建的ISSR-PCR分子標(biāo)記指紋圖譜保存，用于鑒定金線蓮把未知樣品在上述條件下所建立的指紋圖譜與已得的金線蓮指紋圖譜相比較，圖譜相同即為安徽霍山產(chǎn)金線蓮，否則不是安徽霍山產(chǎn)金線蓮。所述的SSR-PCR擴(kuò)增引物為下表中所列單引物中的I條引物或I條以上的引物的組合，經(jīng)過一百條多條引物的試驗(yàn)比較，所選引物如下
權(quán)利要求
1.一種鑒別安徽霍山產(chǎn)金線蓮及其相似種的分子標(biāo)記指紋圖譜，其特征存在于包括以下步驟 (1)新鮮金線蓮樣品預(yù)處理 將新鮮金線蓮樣品避光6個(gè)小時(shí)以上消耗淀粉，取新鮮的金線蓮葉片10克，用50克以上無水乙醇浸泡二次，每次10分鐘，擦干； (2)樣品基因組DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法提取金線蓮葉片基因組DNA，操作如下 1)將預(yù)處理后的葉片放入冰凍過的陶瓷研缽中，并加入適量石英沙，然后多次加入液氮充分研磨至粉末狀，用藥匙將葉片粉末迅速轉(zhuǎn)移到IOml預(yù)冷Eppendorf離心管中，粉末的高度達(dá)到離心管的1/3處，停止加入粉末； 2)在離心管中加入4ml65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液[2%(v/w) CTAB，1. 4M NaCl, 20mMEDTA，IOOmM Tris-HCl (ΡΗ=8· O)，2%巰基乙醇]； 3)65°C溫浴2h，中間每IOmin反轉(zhuǎn)I 2次； 4)15000rpm離心8min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； 5)冷卻至室溫后，輕柔加入等體積的氯仿和異戊醇溶液，其中氯仿和異戊醇的體積比為24 :1,輕緩顛倒40min; 6)15000rpm室溫離心IOmin,去沉淀,將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； 7)在上清液加入2/3體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，-20°C放置1.5h以上； 8)15000rpm離心IOmin,去上清液； 9)用2ml75%乙醇洗兩次以去除鹽，再用無水乙醇洗一次； 10)倒去乙醇，37°C干燥20min，溶于600μ L緩沖液，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中； 11)加入5 μ L 終濃度為 50 μ L/mL RnaseA，37°C溫浴 Ih ； 12)用等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液對(duì)上述步驟(11)產(chǎn)生的溶液抽提2次，按體積比，酌·:氯仿異戍醇=25 241； 13)15000rpm離心IOmin,取上清液； 14)加入2倍體積的無水乙醇，-20°C保溫lh，每20min翻轉(zhuǎn)一次； 15)15000rpm離心，先用-20°C預(yù)冷的75%乙醇溶液洗滌沉淀2-3次，再用無水乙醇洗漆一次。
16)37°C溫浴干燥DNA，加入100 μ LTE緩沖液溶解備用，4°C保存?zhèn)溆茫?3)ISSR-PCR 擴(kuò)增 利用所提取的樣品基因組DNA作為模板，在德國(guó)Eppendorf 5331梯度PCR儀上進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系特征為模板濃度25 ng/L，引物濃度O. 5 μ mo I · L-1，Mg2+濃度 2. Ommol · L—1，dNTP 濃度 200 μ mol · L—1，Taq 聚合酶濃度 I U/20 μ I ； PCR擴(kuò)增程序條件為94°C預(yù)變性8分鐘，94°C變性45秒，58-62 °C退火45秒，72 °C延伸2分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后于72°C終延伸10分鐘； ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到不同金線蓮樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物貯存在一20°C冰箱中； (4)瓊脂糖凝膠電泳 以4省10地金線蓮的基因組DNA為模板，以其中兩種引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L-15 μ L在1. 5%的瓊脂糖凝膠上于3V/cm的電壓下電泳2. 5h，經(jīng)EB顯色，并用凝膠成像儀記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果； (5)各供試樣品的ISSR-PCR分子標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建 把ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到不同新鮮金線蓮樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳，根據(jù)呈現(xiàn)的條帶建立圖譜以金線蓮品系編號(hào)為橫坐標(biāo)，以條帶存在的位點(diǎn)編號(hào)為縱坐標(biāo)，在每一縱橫坐標(biāo)交結(jié)處，有擴(kuò)增帶用“一”表示，沒有擴(kuò)增帶不作標(biāo)記，“有”帶或“無”帶以總亮度值作為選擇依據(jù)，采用Bandscan軟件，選取亮度值在> O. 2為有擴(kuò)增帶，< O. 2的為沒有擴(kuò)增帶； (6)將構(gòu)建的ISSR-PCR分子標(biāo)記指紋圖譜保存，用于鑒定金線蓮 把未知樣品在上述條件下所建立的指紋圖譜與已得的金線蓮指紋圖譜相比較，圖譜相同即為安徽霍山產(chǎn)金線蓮，否則不是安徽霍山產(chǎn)金線蓮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別安徽霍山產(chǎn)金線蓮及其相似種的分子標(biāo)記指紋圖譜，其特征存在于，所述的SSR-PCR擴(kuò)增引物為下表中所列單引物中的I條引物或I條以上的引物的組合，經(jīng)過一百條多條引物的試驗(yàn)比較，所選引物如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別安徽霍山產(chǎn)金線蓮及其相似種的分子標(biāo)記指紋圖譜。包金線蓮樣品的預(yù)處理、各樣品基因組DNA的提取、ISSR-PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、構(gòu)建各供試樣品的ISSR分子標(biāo)記指紋圖譜和將構(gòu)建的ISSR分子標(biāo)記指紋圖譜用于金線蓮種質(zhì)的鑒定。本發(fā)明方法節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，通過對(duì)金線蓮屬植物的DNA的提取，ISSR-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳就能得到準(zhǔn)確可靠的鑒別圖譜，該方法對(duì)外形上容易混淆的品種從遺傳本質(zhì)上鑒定，具有簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，而且在幼苗期即可進(jìn)行鑒定，對(duì)于保證霍山產(chǎn)金線蓮藥材基源的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性具有重要的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060438SQ20121047248
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者鄧輝, 余茂耘, 胡言龍 申請(qǐng)人:六安同濟(jì)生生物科技有限公司