專利名稱：一種檢測轉cry1Ac基因甘蔗的恒溫擴增方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物轉基因的檢測方法，具體涉及一種檢測轉基因甘蔗的恒溫擴增方法，屬生物技術領域。
背景技術：
甘蔗螟蟲，屬昆蟲綱鱗翅目，是危害甘蔗普遍而嚴重的一類鉆蛀性害蟲。螟蟲種類多，世界甘蔗螟蟲有65種，我國常見的有五種，即螟蛾科的條螟{ChiIo vmosatus)、二良螟{C. infuscatelIus)和白螟 i^cirpophaga excerpalis);卷葉蛾科的黃螟{Aryroploce■scAisteceafla);夜蛾科的大螟(5 inferens)。甘鹿原產于熱帶,經馴化后我國主要在廣西、云南、福建等地種植，其加工產品蔗糖約占我國食糖總產的92%，甘蔗生產又被譽為蔗糖生產的第一車間，因此，甘蔗生產關系我國食糖安全。長期以來，螟蟲是我國甘蔗生產上最重要和發(fā)生最普遍、危害最嚴重的蟲害，各種螟蟲每年可發(fā)生3-7代，世代重疊和多種螟蟲混合發(fā)生并存，還具有全生長季為害的特點。其中①萌芽期為害造成不出苗，缺株；②苗期或分蘗初期為害，幼蟲入侵為害生長點后，心葉枯死，形成枯心苗；③生長中期生長點受害，形成梢端枯萎，抽出側芽，使主莖受抑制而停止生長；④生長中后期受害，致蔗糖分降低可高達4個百分點，如遇大風，常在蟲口處折斷，形成風折莖，蟲傷還常引起甘蔗赤腐病菌侵人，使甘蔗產量和品質受損更大。目前，95%以上采用化學農藥進行防治，也在嘗試采用性誘劑和寄生蜂防治。目前，在全生長季兩次施藥的前提下，株蟲害率都超過85%，甚至高達98%。2008年3月和2011年7月的調研發(fā)現(xiàn)，中國廣西最大蔗區(qū)廣西崇左主栽品種R0C22和云南德宏蔗區(qū)主栽品種R0C20因螟蟲危害嚴重，導致宿根頭發(fā)株率低，宿根產量低，難以進行宿根栽培，大幅度增加了甘蔗生產成本，因為在正常情況下，第一次宿根蔗可比新植增產15-30%，且宿根畝投入成本還比新植低600元以上，此外，正常還可進行第二次宿根。好會30通過轉基因技術導入抗螟蟲基因，提高抗蟲性，實現(xiàn)螟蟲控制，是一種公 認的經濟、環(huán)境友好的策略，抗蟲棉等一系列抗蟲轉基因改良品種，已經在國內外生產上發(fā)揮巨大的作用。由于甘蔗是工業(yè)原料作物和無性繁殖作物，利用甘蔗生產蔗糖需要經過107°C高溫，國家轉基因安全委員會認定甘蔗屬于轉基因安全風險等級最低(I級)的作物，因此，轉基因甘蔗有很好的產業(yè)化應用前景。由于甘蔗缺乏抗螟蟲基因，利用CiTlAc基因導入甘蔗，提高甘蔗對螟蟲的抗性，是控制甘蔗螟蟲危害的經濟、有效的重要策略和技術途徑，優(yōu)良轉基因株系培育過程中，需要對轉基因群體進行鑒定篩選，后續(xù)轉基因產品產業(yè)化也需要基因成分鑒定技術，因此，急需建立一種快速、準確、靈敏、低成本的轉CiylAc基因甘鹿和CiylAc基因成分的檢測技術。對轉基因產品及其成分的檢測，目前主要從核酸水平和蛋白質水平兩方面著手。由于蛋白質易受外界環(huán)境影響而失活或分解，故ELISA等蛋白質水平的免疫學檢測具有局限性。相對而言，核酸的穩(wěn)定性要高于蛋白質，因此，針對核酸成分的檢測技術成為轉基因成分檢測的首選。而核酸水平的檢測方法主要有PCR法、Southern雜交及斑點印跡法等，其中，PCR法因其技術成熟、可快速擴增、特異性強、靈敏度高、對模板純度要求低等優(yōu)點而廣泛采用，也是目前我國農業(yè)部各轉基因檢測室首選技術，但常規(guī)PCR檢測方法在目標序列擴增環(huán)節(jié)需要昂貴的PCR擴增儀，擴增產物的檢測與判斷需要昂貴的凝膠掃描成像系統(tǒng)，對電泳圖片進行采集，而且，電泳檢測常用的嵌入顯色劑EB屬于致癌劑等，對于快速檢測和基層如試驗站實施檢測等存在一定的局限性。恒溫擴增技術是一種對目的核苷酸序列擴增可以替代常規(guī)基于PCR儀技術。其主要特征是在聚合酶的作用下，針對待檢測的靶標基因有關區(qū)域，通過設計了 4條特異引物，實現(xiàn)對目的片段的快速、簡便和精確擴增，且是在簡單的水浴恒溫條件下實現(xiàn)擴增，因此，該技術是一種快捷、準確的檢測技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測轉基因甘蔗的恒溫擴增方法，是針對轉cryIAc基因甘鹿和crylAc基因成分的檢測需求，以目的基因crylAc基因的核苷酸序列信 息為基礎，設計并篩選出特異序列引物，建立的一種檢測轉基因甘蔗的恒溫擴增方法。所述基因是從蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensis)中分離并經過偏愛密碼子修飾，該基因具有如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列(I 848 bp)。本發(fā)明的一種檢測轉crylAc基因甘蔗的恒溫擴增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒溫擴增體系的建立和恒溫擴增產物的鑒定，其特征在于
(I)恒溫擴增檢測引物所使用的檢測引物是抗螟蟲轉基因甘蔗的目的基因的特異檢測引物F3、B3、FIP和BIP
引物 F3 為 5’ -AGAGAGTGGGAAGCCGAT _3’ ；
引物 B3 為 5’ -CGAATCCCCACCTTTGCC-3’ ；
引物 FIP 為 5’ -AGGCGCTGTTCATGTCGITGACCTACTAACCCAGCTCTCCG-3’ ；
引物 BIP 為 5’ -TGTCCGTGTACGITCAAGCAGCCAAACACGCTAACGTCTCGA-3’。(2)恒溫擴增體系的建立在200 u L離心管中，先加入恒溫擴增反應液；所述恒溫擴增反應液的組成如下濃度為50 mmol/L MgSO4液I. 5 yL，濃度為10 mmol/L dNTPs液 3. 5 ii L，IOX 擴增緩沖液(ThermoPol Reaction Buffer，購買自 NEB 公司)2. 5 yL，濃度為10 ymol/L的引物FIP和BIP各2.0 yL，濃度為10 y mol/L的引物F3和B3各0. 5U L,0. 75 u L Bst DNA聚合酶，10. 75 y L高壓滅菌ddH20，再加入I. 0 U L甘蔗DNA模板，混勻后I 000 g,瞬時離心I s -2 s,開蓋并在管蓋上點上I. 0 y L濃度為1，000倍的突光染料SYBR Green I，閉蓋后置于水浴鍋中65° C恒溫水浴進行擴增，擴增時間為55 min-60 min。(3)恒溫擴增產物的鑒定擴增結束后，將管蓋上的染料SYBR Green I與擴增產物混合，待檢樣品呈明亮的綠色，判定為真實的轉基因甘蔗樣品。本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明針對抗螟蟲轉基因甘蔗的外源目的基因的堿基序列，設計了 4條特異性引物，在聚合酶作用下進行鏈置換擴增反應，特異性高。同時，擴增反應僅需水浴鍋與可完成瞬時離心的常溫低速離心機就能完成，因此，所需儀器設備簡單，比常規(guī)PCR技術需要昂貴的凝膠掃描系統(tǒng)和PCR儀(或real-time PCR)等要低很多。擴增成本相對較低且擴增時間短、效率高，目視法顏色反應看結果直觀方便。體系建立后，直接以提取的甘蔗基因組DNA作為模板，是一種適用于實驗室和田間篩選轉基因甘蔗以及進行基因成分檢測、跟蹤的低成本、快速、靈敏、簡單、準確的方法。


圖I為轉CirJAC基因甘蔗的恒溫擴增檢測結果。圖I中，I為水對照、2為受體甘蔗非轉基因陰性對照，I和2都呈現(xiàn)橘黃色；3為陽性質粒對照、4為待檢樣品，3和4都呈現(xiàn)為明亮的綠色，說明待檢樣品為轉基因甘蔗。圖2為轉cirJAc基因甘蔗的恒溫擴增檢測結果。圖2中，I為水對照、2為受體甘蔗非轉基因陰性對照，I和2都呈現(xiàn)橘黃色；3為陽性質粒對照、4為轉ciylAc基因甘蔗陽性對照(即采用real-time PCR和Southern Bloting確認為轉基因甘鹿代號為19a_l的樣品)、5為待檢樣品，3、4和5都呈現(xiàn)明亮的綠色；說明待檢樣品為轉基因甘蔗。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。實施例I :一種檢測轉基因甘蔗的恒溫擴增方法，包括以下步驟
I、甘蔗基因組DNA的提取
(1)將待檢測的轉基因甘蔗無性系16K-2(甘蔗基因型為新臺糖22號)的幼嫩葉片，用體積比為75%的乙醇擦拭消毒；
(2)將消毒后的葉片放入經消毒預冷的研缽，加入液氮并充分研磨成幼嫩葉粉末；
(3)取0.5g幼嫩葉粉末裝入2 mL離心管A中，加入800 U L 65° C預熱的CTAB提取液和100 U L無水乙醇,振蕩混勻,65° C溫育30 min,離心10 min ；
(4)取上清800u L于離心管B中，加入等體積的酚、氯仿和異戊醇溶液，混勻，離心5min,取上清700 U L于離心管C中,加入等體積的氯仿和異戍醇溶液,混勻,離心5 min,取上清500 UL于離心管D中，加入1/10體積在4° C冰箱中預冷的NaAc和等體積在-20° C冰箱中預冷的異丙醇，混勻；所述酚、氯仿和異戊醇溶液指體積比為酚氯仿異戊醇=25:24: I ;所述氯仿和異戊醇溶液指體積比為氯仿異戊醇=24:1 ;
(5)在-20°C放置30 min后，離心(12 000 g) 10 min，去上清，用體積比為75%乙醇洗滌沉淀物2次，再用無水乙醇洗滌I次，在超凈臺吹風干燥10 min后，加入100 y L高壓去離子無菌水，溶解并混勻，即為甘蔗基因組DNA樣品；
(6)甘蔗基因組DNA樣品測定濃度后稀釋到100ng/yL，作為恒溫擴增的模板；
2、恒溫擴增體系的建立
如圖I所示，設無菌水對照I、受體甘蔗非轉基因對照2、陽性質粒對照3、待檢樣品4，共4種模板，進行恒溫擴增；其中所述陽性質粒指帶有外源目的基因CciylAc基因)的表達載體質粒DNA;擴增體系包括24.0 U L的恒溫擴增反應液和I. 0 U L模板；所述恒溫擴增反應液組成為濃度為50 mmol/L MgSO4液I. 5 u L，濃度為10 mmol/L dNTPs液3. 5 u L，
2.5 u LlOX 擴增緩沖液(ThermoPol Reaction Buffer，購買自 NEB 公司)2. 5 u L，濃度為10 iimol/L的引物FIP和BIP各2. 0 U L，濃度為10 y mol/L的引物F3和B3各0. 5 u L,
0.75 V^L Bst DNA聚合酶，10. 75 U L高壓滅菌的ddH20。在裝有恒溫擴增反應液的200 u L離心管中，加入1.0 UL甘蔗DNA模板，用手輕彈混勻后瞬時離心(I 000 g, Is -2 S)，開蓋并在管蓋上點上I. 0 ii L濃度為1，000倍的熒光染料SYBR Green I，閉蓋后置于水浴鍋中65 ° C恒溫水浴進行擴增，擴增時間為60 min ；
3、恒溫擴增產物的鑒定
擴增結束后，將管蓋上的染料SYBR Green I與擴增產物混合結果如圖I所示，水對照和受體甘蔗非轉基因對照均呈現(xiàn)橘黃色，陽性質粒對照和待檢樣品均呈現(xiàn)明亮的綠色，說明待檢樣品為真實的轉基因甘蔗。實施例2 :—種檢測轉基因甘蔗的恒溫擴增方法，包括以下步驟
1、甘蔗基因組DNA的提取本實施例中選取轉基因甘蔗(甘蔗基因型為福農95-1702)中間試驗基地的轉基因甘蔗無性系a-2的幼嫩葉片，作為待檢測試樣，提取方法與步驟與實施例I相同；
2、恒溫擴增體系的建立如圖2所示，設無菌水對照I、受體甘蔗非轉基因對照2、陽性 質粒對照3、轉cryiXc基因甘鹿陽性對照4 (即采用real-time PCR和Southern Bloting確認為轉基因甘蔗代號為19a-l的樣品)、待檢樣品5，共5種模板，進行恒溫擴增；擴增體系包括24. 0 u L的恒溫擴增反應液和1.0 u L模板；在裝有恒溫擴增反應液的200 y L離心管中，加入1.0 UL甘蔗DNA模板，用手輕彈混勻后瞬時離心(I 000 g, Is -2 S)，開蓋并在管蓋上點上I. 0 ii L濃度為1，000倍的熒光染料SYBR Green I，閉蓋后置于水浴鍋中65° C恒溫水浴進行擴增，擴增時間為60 min ；
3、恒溫擴增產物的鑒定擴增結束后，采用離心或重用臂力將管蓋上的染料SYBRGreen I甩下，使管蓋上的染料SYBR Green I與擴增產物混合結果如圖2所示，水對照和受體甘鹿非轉基因對照均呈現(xiàn)橘黃色，陽性質粒對照、已確認的轉CiylAc基因甘鹿19a-l和待檢樣品均呈現(xiàn)明亮的綠色，說明待檢樣品為真實的轉基因甘蔗。本發(fā)明采用的主要試劑如下(除引物為PAG即聚丙烯酰胺凝膠級純化外，期于所有化學試劑均為分析純)
NaAc:濃度為 3. 0 mol/L, 121。C 滅菌 20 min。MgSO4 :濃度為 50 mmol /I,, 121 ° C 滅菌 20 min。酚氯仿異戊醇(體積比為25: 24: I):美國GENERAY BIOTECH公司產品。氯仿異戍醇(體積比為24: I):國藥集團化學試劑,用滅菌ddH20配制。異丙醇、無水乙醇、CTAB :國藥集團化學試劑有限公司產品。Bst 聚合酶和 10X 擴增緩沖液(ThermoPol Reaction Buffer):美國New EnglandBiolabs (NEB)公司產品。熒光染料SYBR Green I =BioTeke公司產品，用IXTAE稀釋到1000X。dNTPs 10 mmol/L，寶生物工程(大連)有限公司(Takara)產品。引物F3、B3、FIP和BIP均委托寶生物工程(大連)有限公司(Takara)合成。本發(fā)明所使用的儀器與耗材主要如下
5417C型常溫高速離心機德國Eppendorf公司；
Nanovne plus超微量紫外分光光度計美國GENE有限公司；
MP-13H恒溫水浴鍋上海一橫科學儀器有限公司，精度為±0. 1° C ；
Q2-866型渦旋振蕩儀和LX-300型迷你離心機海門貝爾儀器制造有限公司；
100-1000 u LU0-100 iiL、0.5-10 yL和 0.1-2.5 ii L移液槍德國 Eppendorf 公司； 200 iiL和10 UL濾芯槍頭美國AXYGEN公司產品，且經121° C滅菌20 min處理。
2 mL、l. 5 mL和200 ii L離心管美國AXYGEN公司產品，且經121° C滅菌20 min處理。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權利要求
1.本發(fā)明的一種檢測轉CrylAc基因甘蔗的恒溫擴增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒溫擴增體系的建立和恒溫擴增產物的鑒定，其特征在于 恒溫擴增檢測引物所使用的檢測引物是抗螟蟲轉基因甘蔗的目的基因的特異檢測引物F3、B3、FIP和BIP 引物 F3 為 5’ -AGAGAGTGGGAAGCCGAT _3’ ；引物 B3 為 5’ -CGAATCCCCACCTTTGCC-3’ ；引物 FIP 為 5’ -AGGCGCTGTTCATGTCGTTGACCTACTAACCCAGCTCTCCG-3’ ；引物 BIP 為 5’ -TGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCCAAACACGCTAACGTCTCGA-3’ ； (2)恒溫擴增擴增體系的建立在200μ L離心管中，先加入恒溫擴增反應液；所述恒溫擴增反應液的組成如下濃度為50 mmol/L MgSO4液I. 5 yL，濃度為10 mmol/L dNTPs 液3.5 μ L，IOX擴增緩沖液2. 5 μ L，濃度為10 ymol/L的引物FIP和BIP各2.0 μ L，濃度為10 “11101/1的引物？3和83各0.5 μ L,0. 75 μ L fciDNA聚合酶，10. 75 μ L高壓滅菌ddH20,再加入I. O μ L甘鹿模板DNA,混勻后I 000 g, Is -2 s離心,開蓋并在管蓋上點上I. O μ L濃度為1，000倍的熒光染料SYBR Green I，閉蓋后置于水浴鍋中65° C恒溫水浴進行擴增，擴增時間為55 min -60 min ； (3)恒溫擴增產物的鑒定擴增結束后，將管蓋上的染料SYBRGreen I與擴增產物混合，待檢樣品呈明亮的綠色，判定為真實的轉基因甘蔗樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測轉cry1Ac基因甘蔗的恒溫擴增方法，包括甘蔗模板DNA提取、恒溫擴增體系的建立和恒溫擴增產物的鑒定。轉cry1Ac基因甘蔗的恒溫擴增檢測方法針對抗螟蟲轉基因甘蔗的外源目的基因cry1Ac的堿基序列，設計了4條特異性引物，在Bst聚合酶作用下進行鏈置換擴增反應，特異性高。同時，擴增反應僅需水浴鍋與可完成瞬時離心的常溫低速離心機就能完成，因此，所需儀器設備簡單，比常規(guī)PCR技術需要昂貴的凝膠掃描系統(tǒng)和PCR儀(或real-timePCR)等，擴增成本相對較低且擴增時間短、效率高，目視法顏色反應看結果直觀方便。體系建立后，直接以提取的甘蔗基因組DNA作為模板，是一種適用于實驗室和田間篩選轉cry1Ac基因甘蔗以及進行cry1Ac基因成分檢測、跟蹤的低成本、快速、靈敏、簡單、準確的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102965436SQ20121046121
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者許莉萍, 郭晉隆, 周定港, 闕友雄, 林慶良, 陳如凱, 高世武 申請人:福建農林大學