專(zhuān)利名稱(chēng)：發(fā)酵制備中純度賴(lài)氨酸硫酸鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵制備含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括創(chuàng)新地向產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)通常被認(rèn)為與賴(lài)氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品和應(yīng)用等。
背景技術(shù)：
L-賴(lài)氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中，尤其是含有雜質(zhì)的賴(lài)氨酸鹽(如，硫酸鹽、鹽酸鹽)，一般可以直接作為飼料添加劑使用。當(dāng)前，L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)主要是通過(guò)微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。 在賴(lài)氨酸鹽的各類(lèi)產(chǎn)品中，尤其是賴(lài)氨酸硫酸鹽，具有非常大的缺點(diǎn)，即具有較大的吸濕性，由此使得其中的含水量過(guò)高(如，大于3% )，這樣過(guò)高的產(chǎn)品濕度容易導(dǎo)致產(chǎn)品結(jié)塊，不易保存，尤其長(zhǎng)期保存時(shí)容易發(fā)霉，這即使在作為安全要求較低的飼料使用時(shí)，也是不容許的。尤其是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，我國(guó)廣大農(nóng)戶(hù)，牲畜飼養(yǎng)規(guī)模不大，賴(lài)氨酸鹽作為飼料添加劑用量不大，因此整包購(gòu)進(jìn)(往往單價(jià)更為便宜)的賴(lài)氨酸鹽產(chǎn)品，因此會(huì)有較多留存，長(zhǎng)期保存時(shí)產(chǎn)品的吸濕性對(duì)他們的影響更大。為此，日本味之素公司采用調(diào)節(jié)酸根陰離子與賴(lài)氨酸的當(dāng)量比來(lái)克服這一缺陷，將酸根陰離子與賴(lài)氨酸的當(dāng)量比調(diào)節(jié)為O. 68 O. 95之間，即酸根陰離子的當(dāng)量小于賴(lài)氨酸的當(dāng)量，這樣可以在一定程度上降低產(chǎn)品的平衡濕度(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利第03120099號(hào))。上述方法對(duì)于賴(lài)氨酸鹽酸鹽來(lái)說(shuō)，會(huì)帶來(lái)比較良好的抗吸濕性，在相對(duì)濕度為33 58%的常規(guī)保存環(huán)境下，基本能使得產(chǎn)品的平衡濕度控制在3%以下；然而，對(duì)于賴(lài)氨酸硫酸鹽來(lái)說(shuō)，在此保存環(huán)境下，平衡濕度基本都超過(guò)3%，甚至?xí)^(guò)5%。經(jīng)本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴(lài)氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類(lèi)型的氨基酸，盡管會(huì)降低產(chǎn)品中賴(lài)氨酸硫酸鹽的純度，但是會(huì)使得賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的抗吸濕性得到顯著提升，而且該純度的產(chǎn)品并不影響其作為賴(lài)氨酸飼料添加劑的效用。而且，本發(fā)明人還研究出了一種新的發(fā)酵方法，與現(xiàn)有技術(shù)的不斷加強(qiáng)生成賴(lài)氨酸的代謝途徑的思路相反，打開(kāi)非賴(lài)氨酸代謝的其他旁路，尤其是在十分復(fù)雜的代謝通路中令人意外地尋找到了一種酶，打開(kāi)的程度非常適中，從而能一次性發(fā)酵得到賴(lài)氨酸和其它類(lèi)型氨基酸配比適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，無(wú)需過(guò)多的制備工藝步驟，得到的產(chǎn)品仍舊能夠作為賴(lài)氨酸飼料添加劑，而且抗吸濕性得到顯著提升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供新的發(fā)酵制備含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括創(chuàng)新地向產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)通常被認(rèn)為與賴(lài)氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因。另夕卜，本發(fā)明還提供了該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品和應(yīng)用等。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括
(I)將編碼氨基酸序列如SEQ ID No :1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌；(2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，并收集培養(yǎng)的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸賴(lài)氨酸51 55份，優(yōu)選為51. 5 53. 5份，更優(yōu)選為52. 3份；天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I. 6份，更優(yōu)選為I. 54份；蘇氨酸O. 8 I. I份，優(yōu)選為O. 9 I份，更優(yōu)選為O. 94份；絲氨酸O. 4 O. 65份，優(yōu)選為O. 5 O. 6份，更優(yōu)選為O. 56份；谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為2. 4份；甘氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 92份；丙氨酸I. 2 I. 6份，優(yōu)選為L(zhǎng) 3 I. 5份，更優(yōu)選為L(zhǎng) 4份；纈氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 93份；甲硫氨酸O. 3 O. 5份，優(yōu)選為O. 35 O. 48份，更優(yōu)選為O. 42份；異亮氨酸O. 45 O. 75份，優(yōu)選為O. 55 O. 65份，更優(yōu)選為O. 61份；亮氨酸I I. 5份，優(yōu)選為I. 2 I. 35份，更優(yōu)選為I. 27份；酪氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 75份，更優(yōu)選為O. 67份；苯丙氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 7份，更優(yōu)選為O. 64份；組氨酸O. 8 I. 2份，優(yōu)選為O. 9 I. 05份，更優(yōu)選為O. 97份；和，精氨酸，O. 9 I. 3份，優(yōu)選為I I. 2份，更優(yōu)選為I. I份；(3)向步驟(2)獲得的上清液，加入硫酸并濃縮干燥至含水率小于3% (w/w)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述多核苷酸編碼氨基酸序列如SEQ ID No:l所示的蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)的不斷加強(qiáng)生成賴(lài)氨酸的代謝途徑的思路相反，本發(fā)明第一方面的方法通過(guò)引入RNA聚合酶sigma-32因子來(lái)適中地打開(kāi)非賴(lài)氨酸代謝的其他旁路，從而能一次性發(fā)酵得到賴(lài)氨酸和其它類(lèi)型氨基酸配比適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，無(wú)需過(guò)多的制備工藝步驟。RNA聚合酶sigma-32因子通過(guò)特異性地對(duì)熱休克啟動(dòng)子起作用，而參與熱休克過(guò)程，影響熱休克相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)谷氨酸發(fā)酵中的微生物克服代謝產(chǎn)生的毒物產(chǎn)生影響。盡管RNA聚合酶sigma-32因子已經(jīng)被公開(kāi)(可參見(jiàn)NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登錄號(hào)AAB18436. I ;也可參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第96193336號(hào))，但是RNA聚合酶sigma-32對(duì)賴(lài)氨酸發(fā)酵以及對(duì)其中的氨基酸產(chǎn)生分布的影響卻沒(méi)有任何啟示。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對(duì)如SEQ ID No :1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一個(gè)和幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，所述變體的氨基酸序列為對(duì)如SEQ IDNo 1所示的氨基酸序列添加、缺失和取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列，而且編碼該變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌后在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng),培養(yǎng)的上清液包含如本發(fā)明第一方面中所述重量配比的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)RNA聚合酶sigma-32因子的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼的核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子改造的核苷酸序列，以調(diào)節(jié)該代謝途徑打開(kāi)的程度。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所不。所述多核苷酸可以通過(guò)各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌，只要能夠使產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌表達(dá)所述RNA聚合酶sigma-32因子即可。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過(guò)構(gòu)建在質(zhì)粒等載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，工程菌是大腸桿菌，更優(yōu)選是對(duì)L-賴(lài)氨酸反饋抑制脫敏的大腸桿菌，最優(yōu)選是表達(dá)對(duì)L-賴(lài)氨酸反饋抑制脫敏的二氫吡啶二羧酸合成酶的大腸桿菌(參見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利第94194962號(hào))。由于大腸桿菌本身適合作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大腸桿菌的。在本文中，在表示配比時(shí)所用的“份”，是為了表示在所述組合物中，各成分的重量配比，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是能夠理解的。重量“份”在對(duì)組合物中一種以上的成分進(jìn)行限定時(shí)，可以看作是這些成分在該組合物中的比例。 在本文中，接種量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以體積百分比表示的時(shí)候，指的是菌體培養(yǎng)液(接入的菌液)體積相對(duì)于被接入的培養(yǎng)基體積的百分比量。本發(fā)明第一方面的方法中加入硫酸，從而可以和賴(lài)氨酸這一堿性氨基酸成鹽，更易于在干燥過(guò)程中凝結(jié)成顆粒。硫酸的加入量與上清液中賴(lài)氨酸的比例可以是恒定的。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，賴(lài)氨酸與硫酸的摩爾比為I 3 O. 5 I. 5，更優(yōu)選為
1.5 2. 5 O. 75 I. 25，最優(yōu)選為 2 I。液體的濃縮和干燥可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的設(shè)備，如，蒸發(fā)器、干燥機(jī)和/或烘箱，來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，上清液依次經(jīng)蒸發(fā)器濃縮，噴入流化床干燥機(jī)內(nèi)造粒，并于烘箱干燥。在第二方面，本發(fā)明提供了含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品，其包含賴(lài)氨酸硫酸鹽68. I 73. 5份，優(yōu)選為68. 8 71. 5份，更優(yōu)選為69. 9份；天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I. 6份，更優(yōu)選為I. 54份；和，谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為
2.4 份。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品包含如下重量配比的氨基酸賴(lài)氨酸硫酸鹽68. I 73. 5份，優(yōu)選為68. 8 71. 5份，更優(yōu)選為69. 9份；天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I. 6份，更優(yōu)選為I. 54份；蘇氨酸O. 8 I. I份，優(yōu)選為O. 9 I份，更優(yōu)選為O. 94份；絲氨酸O. 4 O. 65份,優(yōu)選為O. 5 O. 6份，更優(yōu)選為O. 56份；谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為2. 4份；甘氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 92份；丙氨酸I. 2 I. 6份，優(yōu)選為I. 3 I. 5份，更優(yōu)選為I. 4份；纈氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 93份；甲硫氨酸O. 3 O. 5份，優(yōu)選為O. 35 O. 48份，更優(yōu)選為O. 42份；異亮氨酸O. 45 O. 75份,優(yōu)選為O. 55 O. 65份，更優(yōu)選為O. 61份；亮氨酸I I. 5份，優(yōu)選為I. 2 I. 35份，更優(yōu)選為I. 27份；酪氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 75份，更優(yōu)選為O. 67份；
苯丙氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 7份，更優(yōu)選為O. 64份；組氨酸O. 8 I. 2份，優(yōu)選為O. 9 I. 05份，更優(yōu)選為O. 97份；和，精氨酸，O. 9 I. 3份，優(yōu)選為I I. 2份，更優(yōu)選為I. I份。經(jīng)動(dòng)物證實(shí)，即使進(jìn)一步包含發(fā)酵雜質(zhì)，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品在對(duì)動(dòng)物喂飼中使用仍舊是安全的，更由于其他種類(lèi)的氨基酸的加入，還可以進(jìn)一步提高飼料添加劑的功效。因此，優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品是飼料添加劑。經(jīng)本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)，令人意外地發(fā)現(xiàn)了，在抗吸濕性差的賴(lài)氨酸硫酸鹽中添加一定比例的其它類(lèi)型的氨基酸，會(huì)使得賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品的抗吸濕性得到顯著提升，因此適宜長(zhǎng)期保存。在本文中，平衡含水率可以與平衡濕度互換使用，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的吸濕性指標(biāo)，指的是在一定相對(duì)濕度環(huán)境下，產(chǎn)品含水率達(dá)到平衡(即，含水率既不會(huì)增加，也不會(huì)減少)時(shí)的含水率。優(yōu)選可以在常規(guī)保存條件下(相對(duì)濕度為33 58%)長(zhǎng)期保存，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品的(平衡)含水率小于5% (w/w)，優(yōu)選小于3%·(w/w),更優(yōu)選小于 2. 5% (w/w)。本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品可以不含有其他雜質(zhì)(即，本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品由上述氨基酸組成)，也可以進(jìn)一步包含雜質(zhì)，如發(fā)酵雜質(zhì)。經(jīng)本發(fā)明人研究，采用本發(fā)明第一方面的方法制備的產(chǎn)品中的其他雜質(zhì)，并不能使上述比例的氨基酸產(chǎn)品在常規(guī)保存條件下含水率高于3% (w/w) ο因此優(yōu)選本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品是由本發(fā)明第一方面的方法制備的。在第三方面，本發(fā)明提供了賴(lài)氨酸硫酸鹽、天冬氨酸和谷氨酸聯(lián)合在制備含水率小的含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的飼料添加劑中的應(yīng)用，優(yōu)選提供了賴(lài)氨酸硫酸鹽、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和精氨酸聯(lián)合在制備含水率小的含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的飼料添加劑中的應(yīng)用。優(yōu)選其中，(平衡)含水率小于5% (w/w),更優(yōu)選小于3% (w/w),最優(yōu)選小于2. 5% (w/w)。優(yōu)選在本發(fā)明第三方面的應(yīng)用中，含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的飼料添加劑是本發(fā)明第二方面的產(chǎn)品。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的產(chǎn)品抗吸濕性佳，使得產(chǎn)品中的含水率降低50%以上，適合于在我國(guó)南北方廣大地區(qū)長(zhǎng)期儲(chǔ)存、運(yùn)輸和使用；本發(fā)明的產(chǎn)品作為L(zhǎng)-賴(lài)氨酸飼料，安全可靠，功效有所提升；本發(fā)明的發(fā)酵方法實(shí)施步驟簡(jiǎn)單，一次發(fā)酵即可獲得相應(yīng)氨基酸配比的產(chǎn)品，節(jié)約了生產(chǎn)成本，無(wú)安全隱患。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說(shuō)明書(shū)等參考。
實(shí)施例IRNA聚合酶sigma-32因子基因構(gòu)建體的制備根據(jù)NCBI (http://www. nebi. nlm. nih. gov)的蛋白登錄號(hào) AAB 18436. I 的氨基酸序列，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了適度表達(dá)型密碼子(非表達(dá)量?jī)?yōu)化密碼子)，并通過(guò)商業(yè)途徑委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼RNA聚合酶sigma-32因子的基因并構(gòu)建入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-20b(+)(可購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，商品編號(hào)Cat. No. 69739-3)中?？寺∵^(guò)程參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》以及所用商品化試劑的操作指南進(jìn)行，簡(jiǎn)要過(guò)程如下通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀，合成RNA聚合酶sigma-32因子基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購(gòu)自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進(jìn)行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個(gè)核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購(gòu)自TaKaRa公司)連接12小時(shí)。然后，取I μ L上述連接產(chǎn)物在50 μ L反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No :3所示(引入了 EeoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、反向引物如序列表的SEQ ID Νο:4所示(引入了 Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn))，反應(yīng)條件為以94°C變性4分鐘，然后以94°C變性30秒、63 °C退火60秒并72°C延伸35秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72°C延伸4分鐘 并降溫至4°C。瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收約900bp大小的片段，用EcoR I和XhoI雙酶切該片段，并與經(jīng)這兩個(gè)內(nèi)切酶酶切的pET-20b(+)質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplOF’中。挑出陽(yáng)性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，相應(yīng)核苷酸序列如本發(fā)明人設(shè)計(jì)的SEQ ID No 2所示，編碼了如SEQ IDNo 1所示的RNA聚合酶sigma-32因子，由公司將構(gòu)建好的質(zhì)粒(命名為pET-sigma)寄回。實(shí)施例2大腸桿菌發(fā)酵的L-賴(lài)氨酸硫酸鹽產(chǎn)品對(duì)中國(guó)專(zhuān)利第94194962號(hào)所述的方法構(gòu)建的產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的大腸桿菌菌株W3110 (tyrA) /pCABD2,轉(zhuǎn)化pET-sigma質(zhì)粒，經(jīng)鑒定獲得轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆(命名為 W3110(tyrA)/pCABD2-sigma)后，將菌株 W3110 (tyrA)/pCABD2 和 W3110 (tyrA) /pCABD2-sigma分別參照中國(guó)專(zhuān)利第03120099號(hào)進(jìn)行賴(lài)氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之,將菌株接入液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到O. 35，以5%的接種量接入賴(lài)氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為:IOOg 葡萄糖,6Og (NH4)2SO4, 5Og CaCO3, 35mL 蛋白胨-B (Soy ProteinEnzymatic Hydrolysate,購(gòu)自上海信然生物技術(shù)有限公司，總氮含量不低于3 % ), IgKH2PO4,400mgMgS04 *7H20,200mg L-甲硫氨酸，IOmg FeSO4 ·7Η20，8· Img MnSO4 ·4Η20，300μ g生物素和200 μ g維生素BI，用Tris-HCl調(diào)節(jié)至pH7)中以36°C振蕩(250rpm)培養(yǎng)72小時(shí)。然后，離心收集培養(yǎng)基上清液(發(fā)酵液)，用HPLC定量上清液中的L-賴(lài)氨酸含量以及其他成分。結(jié)果如表 I 所示，相對(duì)于 W3110 (tyrA) /pCABD2 的發(fā)酵液，W3110 (tyrA) /pCABD2-sigma的賴(lài)氨酸含量略有下降，但其他氨基酸的種類(lèi)和比例明顯提高，其他雜質(zhì)(高于氨基酸分子量的雜質(zhì)(糖、多糖、肽和蛋白)和低于氨基酸分子量的雜質(zhì)(無(wú)機(jī)鹽))的含量基本不變，因此兩者發(fā)酵產(chǎn)物的性質(zhì)如果有不同，估計(jì)是歸因于其他氨基酸的種類(lèi)和比例。表I發(fā)酵液中的成分比較
權(quán)利要求
1.發(fā)酵制備含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括 (1)將編碼氨基酸序列如SEQID No 1所示的蛋白或其變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌； (2)在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng)步驟(I)獲得的菌，并收集培養(yǎng)的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸 賴(lài)氨酸51 55份，優(yōu)選為51. 5 53. 5份，更優(yōu)選為52. 3份； 天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I. 6份，更優(yōu)選為I. 54份； 蘇氨酸O. 8 I. I份，優(yōu)選為O. 9 I份，更優(yōu)選為O. 94份； 絲氨酸O. 4 O. 65份,優(yōu)選為O. 5 O. 6份,更優(yōu)選為O. 56份； 谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為2. 4份； 甘氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 92份； 丙氨酸I. 2 I. 6份，優(yōu)選為I. 3 I. 5份，更優(yōu)選為I. 4份； 纈氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 93份； 甲硫氨酸O. 3 O. 5份，優(yōu)選為O. 35 O. 48份，更優(yōu)選為O. 42份； 異亮氨酸O. 45 O. 75份，優(yōu)選為O. 55 O. 65份，更優(yōu)選為O. 61份； 亮氨酸I I. 5份，優(yōu)選為I. 2 I. 35份，更優(yōu)選為I. 27份； 酪氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 75份，更優(yōu)選為O. 67份； 苯丙氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 7份，更優(yōu)選為O. 64份； 組氨酸O. 8 I. 2份，優(yōu)選為O. 9 I. 05份，更優(yōu)選為O. 97份；和， 精氨酸，O. 9 I. 3份，優(yōu)選為I I. 2份，更優(yōu)選為I. I份； (3)向步驟(2)獲得的上清液，加入硫酸并濃縮干燥至含水率小于3%(w/w) 0
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中變體的氨基酸序列為對(duì)如SEQID No :1所示的氨基酸序列添加、缺失和取代一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而獲得的氨基酸序列，優(yōu)選編碼該變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌后在發(fā)酵條件下液體培養(yǎng),培養(yǎng)的上清液包含如權(quán)利要求I所述重量配比的氨基酸。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中賴(lài)氨酸與硫酸的摩爾比為I 3 O. 5 I. 5，優(yōu)選為I.5 2. 5 O. 75 I. 25，更優(yōu)選為 2 I。
4.權(quán)利要求I所述的方法，其中菌是大腸桿菌，優(yōu)選是對(duì)L-賴(lài)氨酸反饋抑制脫敏的大腸桿菌。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO 2所示。
6.含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品(其優(yōu)選是飼料添加劑)，其包含賴(lài)氨酸硫酸鹽68.I ,73. 5份，優(yōu)選為68. 8 71. 5份，更優(yōu)選為69. 9份；天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I.6份，更優(yōu)選為I. 54份；和，谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為2. 4份，優(yōu)選其包含 賴(lài)氨酸硫酸鹽68. I 73. 5份，優(yōu)選為68. 8 71. 5份，更優(yōu)選為69. 9份； 天冬氨酸I. 2 I. 8份，優(yōu)選為I. 45 I. 6份，更優(yōu)選為I. 54份； 蘇氨酸O. 8 I. I份，優(yōu)選為O. 9 I份，更優(yōu)選為O. 94份； 絲氨酸O. 4 O. 65份,優(yōu)選為O. 5 O. 6份,更優(yōu)選為O. 56份； 谷氨酸2 3份，優(yōu)選為2. 2 2. 6份，更優(yōu)選為2. 4份；甘氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 92份； 丙氨酸I. 2 I. 6份，優(yōu)選為I. 3 I. 5份，更優(yōu)選為I. 4份； 纈氨酸O. 75 I. I份，優(yōu)選為O. 85 I份，更優(yōu)選為O. 93份； 甲硫氨酸O. 3 O. 5份，優(yōu)選為O. 35 O. 48份，更優(yōu)選為O. 42份； 異亮氨酸O. 45 O. 75份，優(yōu)選為O. 55 O. 65份，更優(yōu)選為O. 61份； 亮氨酸I I. 5份，優(yōu)選為I. 2 I. 35份，更優(yōu)選為I. 27份； 酪氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 75份，更優(yōu)選為O. 67份； 苯丙氨酸O. 5 O. 8份，優(yōu)選為O. 6 O. 7份，更優(yōu)選為O. 64份； 組氨酸O. 8 I. 2份，優(yōu)選為O. 9 I. 05份，更優(yōu)選為O. 97份；和， 精氨酸，O. 9 I. 3份，優(yōu)選為I I. 2份，更優(yōu)選為I. I份。
7.權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品,其含水率小于5%(w/w),優(yōu)選小于3% (w/w),更優(yōu)選小于2.5% (w/w)。
8.權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其是由權(quán)利要求I 5之任一所述的方法制備的。
9.賴(lài)氨酸硫酸鹽、天冬氨酸和谷氨酸聯(lián)合在制備含水率小于5%(w/w)(優(yōu)選小于3%(w/w),更優(yōu)選小于2. 5% (w/w))的含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的飼料添加劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的飼料添加劑是權(quán)利要求6 8之任一所述的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供了發(fā)酵制備含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品的方法，其包括向產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌導(dǎo)入一個(gè)被認(rèn)為與賴(lài)氨酸代謝無(wú)關(guān)的基因。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品，該產(chǎn)品相對(duì)于現(xiàn)有含L-賴(lài)氨酸硫酸鹽的產(chǎn)品，能夠顯著提高抗吸濕性，從而適宜長(zhǎng)期保存。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102911976SQ20121044008
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者馬吉銀, 陳崇安, 孟剛 申請(qǐng)人:寧夏伊品生物科技股份有限公司