專利名稱：一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物篩選、應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)于抗生素濫用引起的耐藥性病原菌增加，以及畜禽產(chǎn)品藥殘超標(biāo)等嚴(yán)重問(wèn)題備受關(guān)注，人們對(duì)抗生素飼料添加劑帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)意識(shí)也在不斷提高。歐盟已全面禁止飼料中使用抗生素促生長(zhǎng)飼料添加劑。為了應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題，采用益生菌微生態(tài)制劑的生物防治措施成為當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖熱點(diǎn)而受到重視。益生菌在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，會(huì)分泌產(chǎn)生多種物質(zhì)，比如抗菌肽、細(xì)菌素，一方面可以拮抗大腸桿菌等病原菌生長(zhǎng)，另一方面利于自身定植，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善免疫等。微生態(tài)制劑作為一種新型的抗生素替代品的添加劑，具有無(wú)毒副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留、效 果顯著等優(yōu)點(diǎn)，受到了畜禽養(yǎng)殖的歡迎。作為飼用抗生素替代添加劑，微生態(tài)制劑研究和開(kāi)發(fā)前景廣闊。因此，篩選出具有良好效果的益生菌就具有重要的意義。但目前飼用添加劑的益生菌以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌最為常見(jiàn)，而短小芽孢桿菌在動(dòng)物飼料、預(yù)混料、飼料添加劑方面的報(bào)道和研發(fā)較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株新型短小芽孢桿菌及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用，所述短小芽孢桿菌篩選自肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的土壤，對(duì)動(dòng)物源大腸桿菌、沙門氏菌生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽飼料中，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能。本發(fā)明一方面提供了一株短小芽孢桿菌，該菌株命名為短小芽孢桿菌BP14 (Bacillus pumilus BP14)，已于2012年10月25日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，其保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2012428。本發(fā)明的短小芽孢桿菌BP14可應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種包含上述短小芽孢桿菌BP14的微生物制劑。上述的微生物制劑為短小芽孢桿菌BP14的菌粉，按質(zhì)量百分比為O. 1%-1%的比例添加至畜禽飼料中。本發(fā)明從肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中篩選到一株短小芽孢桿菌BP14，該菌株耐高溫、產(chǎn)蛋白酶，對(duì)動(dòng)物源大腸桿菌、沙門氏菌生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，能有效促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能，可作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽飼料中，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I短小芽孢桿菌BP14分離篩選及鑒定I、芽孢桿菌初篩采集肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)土樣6份，分別稱取25g 土樣,加入225mL無(wú)菌水,制備成懸液,經(jīng)80°C水浴處理IOmin后，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)獲得50株芽孢桿菌。2、抑菌型芽孢桿菌篩選I)指示菌大腸桿菌(ATCC25922)、沙門氏菌(ATCC14028)，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37°C，200rpm，培養(yǎng) 15h ；2)制備芽孢桿菌液初篩分離的芽孢桿菌，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37°C，200rpm，培養(yǎng) 24h ；3)體外抑菌實(shí)驗(yàn)一微量肉湯法將培養(yǎng)24h的芽孢桿菌液離心、收集上清，取無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，按1:1比例加入芽孢桿菌上清液及病原菌液，使得其中病原菌濃為IX 108cfu/mL，37°C，200rpm，作用6h，(對(duì)照組為不添加芽孢桿菌上清的病原菌液)，取出讀取各處理的0D_，計(jì)算抑菌率，公式如下
抑 |'4l 4'·=!-^—100%
A2 — yiOA為對(duì)照組OD6tltl, AO為Oh數(shù)據(jù)；A2為6h數(shù)據(jù)；B為芽孢桿菌上清處理組0D_，BO為Oh數(shù)據(jù)；B2為6h數(shù)據(jù)；4)經(jīng)體外抑菌實(shí)驗(yàn)，篩選得到I株對(duì)大腸桿菌(ATCC25922)、沙門氏菌(ATCC14028)生長(zhǎng)抑制顯著的芽孢桿菌，并進(jìn)一步鑒定分析。3、芽孢桿菌鑒定I)生化反應(yīng)采用API50細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，上述芽孢桿菌的生物學(xué)特性如下a、菌落形態(tài)特征在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，呈現(xiàn)為灰黃色、不透明、表面濕潤(rùn)、有皺褶、直徑約2-4mm菌落；b、細(xì)胞形態(tài)特征經(jīng)革蘭氏染色呈陽(yáng)性、短桿狀，芽孢為橢圓狀，位于中部或偏端；C、生理生化特征V-P試驗(yàn)⑴，淀粉水解⑴，酪素水解⑴，明膠水解⑴，硝酸鹽還原㈠，吲哚試驗(yàn)(_)，生長(zhǎng)溫度范圍15 45°C，pH范圍5 9，高于7%NaCl不生長(zhǎng)；生化鑒定結(jié)果顯示該芽孢桿菌為短小芽孢桿菌。2)利用試劑盒提取上述芽孢桿菌基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rRNA序列，測(cè)序后獲得長(zhǎng)度為1457bp的片段。通過(guò)BLAST比對(duì)分析，其與公布的多株短小芽孢桿菌的16S rRNA序列相似度為99%，與其他芽孢桿菌16S rRNA序列菌相似度低于99%。進(jìn)一步擴(kuò)增該菌的gyrB基因(用于編碼DNA促旋酶)序列，經(jīng)BLAST比對(duì)分析，其與公布的短小芽孢桿菌gyrB基因序列相似度為98%，與其他芽孢桿菌gyrB基因序列相似度低于90%，結(jié)合16S rRNA比對(duì)結(jié)果，鑒定證實(shí)該芽孢桿菌為短小芽孢桿菌，與生化鑒定結(jié)果一致。將該菌命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)BP14，并于2012年9月日，保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2012428。；實(shí)施例2 :短小芽孢桿菌BP14抑制動(dòng)物源病原菌實(shí)驗(yàn)I、指示病原菌來(lái)自病雞、豬腸道的大腸桿菌、沙門氏菌(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37°C，200rpm，培養(yǎng)15h ；2、制備短小芽孢桿菌BP14 :挑取單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37°C，200rpm，培養(yǎng)24h ；3、體外抑菌實(shí)驗(yàn)一微量肉湯法將培養(yǎng)24h的短小芽孢桿菌BP14菌液離心、收集上清，經(jīng)測(cè)定，上清中蛋白酶的酶活為 75U/mL。取無(wú)菌96孔培養(yǎng)板，按I: I比例加入短小芽孢桿菌BP14上清液及病原菌液，使得其中病原菌濃為I X 108cfu/mL, 37°C，200rpm,作用6h，(對(duì)照組為不添加芽孢桿菌上清的病原菌液)，取出讀取各處理的0D_，計(jì)算抑菌率，公式如下
權(quán)利要求
1.一種短小芽孢桿菌菌株，其保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012428。
2.權(quán)利要求I所述的菌株在飼料添加劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。
3.—種微生物制劑，所述的微生物制劑包含有權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物制劑，為權(quán)利要求I所述的短小芽孢桿菌的菌粉。
5.權(quán)利要求4所述的短小芽孢桿菌的菌粉的應(yīng)用，是將短小芽孢桿菌的菌粉按質(zhì)量百分比為O. 1%-1%的比例添加至畜禽飼料中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株短小芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用，上述菌株的保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012428，可應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域。本發(fā)明從肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中篩選到一株短小芽孢桿菌BP14，該菌株耐高溫、產(chǎn)蛋白酶，對(duì)動(dòng)物源大腸桿菌、沙門氏菌生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，能有效促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能，可作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽飼料中，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102911901SQ20121041343
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者彭虹旎, 梁莉, 馬俊孝 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司