專利名稱：從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料及窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法。
背景技術(shù)：
非釀酒酵母常常是葡萄酒非接種發(fā)酵的主要參與菌群，它們的代謝與發(fā)酵作用深刻地影響著葡萄酒的成分和風(fēng)味品質(zhì)，在一定程度上能夠提高葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)味的復(fù)雜性，它不僅能夠代謝葡萄汁中的糖生成甘油、高級醇、各種揮發(fā)性化合物，還能夠產(chǎn)生多種胞外酶影響葡萄酒的結(jié)構(gòu)與風(fēng)味品質(zhì)。Moreria等(2005)對葡萄汁有孢漢遜酵母0 wra/ ),季也蒙有孢漢遜酵母 (.H. guiIliermondiI)和釀酒酵母(5 cere visiae)的純種發(fā)酵及混合發(fā)酵進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)三種菌株都具有相似乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)率，在混合發(fā)酵時(shí)，葡萄汁有孢汗生酵母0 wra/ )和釀酒酵母(5 ce/wisiae)皆會受季也蒙有孢汗遜酵母的影響，生長率降低。而季也蒙有孢漢遜酵母iH. guiIliermondii )具有最高的生長力，同時(shí)也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的產(chǎn)生者，并且不受其它菌的影響，而這些物質(zhì)可賦于葡萄酒果香與花香。在純種發(fā)酵中，葡萄汁有孢汗生酵母0 生成最高量的含重硫化合物，季也蒙有孢汗遜酵母iH. guiIliermondii)和釀酒酵母(51 cerevisiae)產(chǎn)生相似量的甲硫醇和2-甲基四氫噻吩-3-酮。但季也蒙有孢汗遜酵母0 gui I Iiermondii )能生相對成較高量的3_甲硫基丙酸，3_甲硫基乙酸丙酷。傳統(tǒng)的分類鑒定主要根據(jù)《酵母菌的分類研究學(xué)》(Kreger-van Ri j，1998)第四版和Barnett等(2000)編著的《酵母菌特征與鑒定》第三版的標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。在對酵母進(jìn)行鑒定前，須在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面獲得大量的鑒定特征。WL(ffallerstein Laboratory Nutrient Agar)培養(yǎng)基鑒定方法相對于酵母菌的常規(guī)鑒定是一種新興的、較快的鑒定方法。大量研究表明葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型酵母菌都可以基于其在WL培養(yǎng)基上生長所形成的菌落顏色及形態(tài)進(jìn)行歸類和區(qū)別，并對不同葡萄酒酵母在WL培養(yǎng)基上的菌落特征進(jìn)行了詳細(xì)的描述。特別是對于季也蒙有孢汗遜酵母的鑒定，在顏色形態(tài)方面有著相當(dāng)詳細(xì)具體的描述，具有很好的鑒別能力，可以避免生理生化分析的大量工作，對于酵母菌鑒定工作來說，是相當(dāng)簡便、快速并且十分有效和節(jié)儉的方法，由于WL培養(yǎng)基對菌種的生理狀態(tài)依賴程度很大，菌種處于不同的生理狀態(tài)可能會導(dǎo)致不同的培養(yǎng)結(jié)果，尤其是菌落的顏色。所以本試驗(yàn)作出相應(yīng)的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為了解決上述的季也蒙有孢汗遜酵母菌在WL培養(yǎng)基上可能會出現(xiàn)不同的培養(yǎng)結(jié)果，而導(dǎo)致鑒定結(jié)果失敗的現(xiàn)象，提供一種改進(jìn)后的WL培養(yǎng)基即WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離純化鑒定紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料及窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，包括下述工藝步驟
(1)、從張?jiān)＜t葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌
①、在無菌條件下，取張?jiān)＜t葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥8 15g，加入5(Tl50mL濃度為O.9%的無菌生理鹽水，浸泡15 25min后搖勻，用移液槍吸取O. 05mL O. 2mL菌液，采用濃度為O. 9%的生理鹽水分別進(jìn)行15 25倍、9(Γ120倍、900 1200倍的梯度稀釋，得三份待分離的稀釋菌液；
②、在超凈工作臺上，取融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基倒平板，每個(gè)平 板中注入約15 25mL，按平板中所加入的融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基的量計(jì)算，即每升融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基加入O. I IOOmg的抑制細(xì)菌的抗生素，待融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基凝固后，?、偎玫娜荽蛛x的稀釋菌液O. 05mL O. 2mL分別加入到平板上，用無菌的三角刮鏟將菌液均勻涂布于平板表面；
所述的YPD固體培養(yǎng)基配方糖12 20g，多價(jià)蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，瓊脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖為白糖、紅糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物；
所述的抑制細(xì)囷的抗生素為青霉素、鏈霉素、氣霉素、紅霉素或慶大霉素；
③、將步驟②制備好的平板置于25°C 30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天；
④、用接種環(huán)分別挑取每個(gè)平板上出現(xiàn)的10-30個(gè)形態(tài)具有區(qū)別的典型酵母菌菌落至另一空白的YPD固體培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于25°C 30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天；
⑤、重復(fù)步驟④直至菌落完全純化，純化菌株斜面保藏于4°C冰箱中備用；
(2)、將步驟(I)分離純化獲得的多個(gè)純的酵母菌菌株每株分別劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基和空白的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，27 30°C下分別培養(yǎng)5-7天后，按照WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)鑒定法結(jié)合《微生物分類學(xué)》的方法進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)鑒定最終獲得季也蒙有孢漢遜酵母菌；
其中所述的YPD固體培養(yǎng)基配方糖12 20g，多價(jià)蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，瓊脂12 20g，水IOOOmL ;其中所述的糖為白糖、紅糖、蔗糖、冰糖、葡萄糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物；
所述的YPD液體培養(yǎng)基配方，以每升計(jì)算，酵母浸粉lg、葡萄糖2g、蛋白胨2g、瓊脂2g，余量以水補(bǔ)足；
所述的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以每升計(jì)算，含有5. Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O. 125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，余量由去離子水補(bǔ)足。配制好的WL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為6.0，在120°C下滅菌20分鐘。同時(shí)利用上述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法還可同時(shí)獲得葡萄汁有孢漢遜酵母菌、釀酒酵母菌和紅酵母菌。季也蒙有孢汗遜酵母菌、葡萄汁有孢漢遜酵母菌、釀酒酵母菌和紅酵母菌，這4種酵母菌都是在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的，但在張?jiān)＜t葡萄酒的生產(chǎn)原料或窖泥中，對這些酵母菌的分離和純化是為了找出其中的各種菌與葡萄酒風(fēng)味產(chǎn)生之間的直接關(guān)系。 上述最終所得的季也蒙有孢汗遜酵母菌iHanseniaspora guiIliermondii),其生長特征在于在YPD固體培養(yǎng)基上3-5天菌落較大，圓形，乳白色凸起，邊緣整齊，易挑起；在YPD液體培養(yǎng)基生長有沉淀。在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基5-7天菌落中央深綠色泛白，四周淺黃色，菌落扁平，邊緣有透明環(huán)。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料及窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，由于采用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基并結(jié)合微生物學(xué)技術(shù)從紅葡萄酒生產(chǎn)原料及窖泥中分離純化出季也蒙有孢汗遜酵母菌菌株，以利于用純菌株培養(yǎng)出具有獨(dú)特愉快香氣風(fēng)格的紅葡萄酒。進(jìn)一步，本發(fā)明的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料及窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，具有無雜菌污染、菌種易保藏、操作快速簡便、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的特點(diǎn)?！?br> 具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明所用的紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥取自山東煙臺張?jiān)？ㄋ固鼐魄f。本發(fā)明的各實(shí)施例所用的各種實(shí)驗(yàn)材料及試劑見下表
權(quán)利要求
1.一種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特征在于包括如下步驟 首先，利用YPD固體培養(yǎng)基從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌；所述的YPD固體培養(yǎng)基配方糖12 20g，多價(jià)蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，瓊脂 12 20g，水 IOOOmL ； 然后，將分離純化獲得的酵母菌菌株分別劃線接種于空白的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，27 3(TC培養(yǎng)5-7天后，按照WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)鑒定法結(jié)合《微生物分類學(xué)》的方法進(jìn)行菌種鑒定，最終獲得季也蒙有孢漢遜酵母菌； 其中所述的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以每升計(jì)算，含有4. 5^5. 5g酵母浸粉、4. 5^5. 5g酸水解酪蛋白、45 55g葡萄糖、O. 45 O. 65g磷酸氫二鉀、O. 325 O. 525g氯化鉀、O. 10 0. 15g氯化鈣、O. 10 0· 15g硫酸鎂、0.02(T0.024g溴甲酚綠、15 19g瓊脂，余量由去離子水補(bǔ)足。
2.如權(quán)利要求I所述的一種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特征在于所述的利用YPD固體培養(yǎng)基從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌，具體包括如下步驟 ①、在無菌條件下，取紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥8 15g，加入5(Tl50mL濃度為O.9%的無菌生理鹽水，浸泡15 25min后搖勻，用移液槍吸取O. 05mL O. 2mL菌液，采用濃度為O. 9%的生理鹽水分別進(jìn)行15 25倍、9(Γ120倍、90(Γ1200倍的梯度稀釋，得三份待分離的稀釋菌液； ②、在超凈工作臺上，取融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基倒平板，每個(gè)平板中注入約15 25mL，按平板中所加入的融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基的量計(jì)算，即每升融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基加入O. I IOOmg的抑制細(xì)菌的抗生素，待融化后并降溫至約45飛5°C的YPD固體培養(yǎng)基凝固后，取①中所得的三份待分離的稀釋菌液O. 05mL O. 2mL分別加入平板上并涂布均勻； ③、將步驟②制備好的平板置于25°C 30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天； ④、用接種環(huán)分別挑取每個(gè)平板上出現(xiàn)的10-30個(gè)形態(tài)具有區(qū)別的典型酵母菌菌落至空白的YPD固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，然后置于25°C 30°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天； 所述的YPD固體培養(yǎng)基配方糖12 20g，多價(jià)蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，瓊脂 12 20g，水 IOOOmL ； ⑤、重復(fù)步驟④直至菌落完全純化，純化的菌株斜面保藏于4°C冰箱中備用。
3.如權(quán)利要求2所述的一種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌的方法，其特征在于所述的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，以每升計(jì)算，含有5. Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O.125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，余量由去離子水補(bǔ)足。
4.如權(quán)利要求3所述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特征在于所述的紅葡萄酒為張?jiān)＜t葡萄酒。
5.如權(quán)利要求4所述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特征在于步驟②、④中所用的YPD固體培養(yǎng)基配方糖12 20g，多價(jià)蛋白酵母膏5 10g，蛋白胨12 20g，瓊脂12 20g，水1000mL。
6.如權(quán)利要求5所述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特征在于步驟②、④中所用的YPD固體培養(yǎng)基配方中所用的糖為白糖、紅糖、葡萄糖、蔗糖、冰糖或蜂蜜中的一種或兩種以上組成的混合物。
7.如權(quán)利要求6所述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定季也蒙有孢汗遜酵母菌方法，其特征在于步驟②中所述的抑制細(xì)菌的抗生素為青霉素、鏈霉素、氯霉素、紅霉素或慶大霉素。
8.如權(quán)利要求f7任一權(quán)利要求所述的從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化季也蒙有孢汗遜酵母菌方法中所用的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其特征在于以每升計(jì)算，含有4.5^5. 5g酵母侵粉、4. 5^5. 5g酸水解酪蛋白、45 55g葡萄糖、O. 45、. 65g磷酸氫二鉀、O.325 O. 525g氯化鉀、O. 10 0· 15g氯化鈣、O. 10 0· 15g硫酸鎂、O. 020 0· 024g溴甲酚綠、15 19g瓊脂，余量由去離子水補(bǔ)足。
9.如權(quán)利要求8所述的WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其特征在于以每升計(jì)算，含有5.Og酵母浸粉、5. Og酸水解酪蛋白、50g葡萄糖、O. 55g磷酸氫二鉀、O. 425g氯化鉀、O. 125g氯化鈣、O.125g硫酸鎂、O. 022溴甲酚綠、17. Og瓊脂，余量由去離子水補(bǔ)足。
全文摘要
本發(fā)明公開了從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法。即包括紅葡萄生產(chǎn)原料及窖泥進(jìn)行純化分離，及按照WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)鑒定法結(jié)合《微生物分類學(xué)》的方法進(jìn)行菌種鑒定2個(gè)步驟，最終得到純化的季也蒙有孢汗遜酵母菌株。從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法，有利于用純菌株培養(yǎng)出具有獨(dú)特愉快香氣風(fēng)格的紅葡萄酒。并且，這種從紅葡萄酒生產(chǎn)原料或窖泥中分離純化鑒定獲得季也蒙有孢汗遜酵母菌株的方法具有無雜菌污染、菌種易保藏、操作快速簡便、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK102899258SQ20121038115
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者馮濤, 游雪燕, 莊海寧, 榮志偉, 周彬耀 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院