專利名稱：微腔室靜態(tài)pcr與毛細(xì)管電泳ce功能集成微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，屬于PCR與CE集成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微流控芯片(Microfludics)指的是在一塊幾平方厘米的芯片上構(gòu)建的化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室，可以在微觀通道下依靠電、磁、機(jī)械、化學(xué)等各種方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以實(shí)現(xiàn)其設(shè)計(jì)的功能。目標(biāo)是將化學(xué)和生物領(lǐng)域涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測、培育、分選等集成在微芯片上，而且可多次使用，最終發(fā)展方向是微全分析系統(tǒng)。微流控芯片其最大的特點(diǎn)是生化環(huán)境依賴于MEMS微細(xì)加工制作出來的微流體環(huán)境，以可靠微流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，這也是其中文譯名的由來。微流控芯片的構(gòu)造一般為多層結(jié)構(gòu)的復(fù)合封裝，最簡單的微流控芯片就是使用一片基材用微加工技術(shù)刻有細(xì)微通道，然后與另外一塊平整基材覆合在一起，·形成具有封閉通道的芯片，在其中一片上還有通道的進(jìn)出口，以進(jìn)行芯片內(nèi)外的流體交換。微流控芯片在應(yīng)用上具有以下突出特點(diǎn)
1)流體處于微米級甚至納米級的微通道環(huán)境中，因此流體基本都呈現(xiàn)出低雷諾數(shù)和層流流動(dòng)的特點(diǎn)，使得其流動(dòng)狀況與混合情況都與宏觀尺度表現(xiàn)出不一樣的情況。通過合理的流體通道設(shè)計(jì)，流體的混合、分流、改變流向的復(fù)雜的過程將短時(shí)間內(nèi)完成，同時(shí)MEMS技術(shù)的加工可以使得微流控通道能夠通過電、磁、機(jī)械等各種方式對流體以及流體內(nèi)部介質(zhì)進(jìn)行控制，使得微流控芯片具有極高的可操作性；
2)微流控芯片中尺度為微觀，流體與顆粒都具有高的體表面積比，能夠提高生物化學(xué)反應(yīng)的速度，因此微通道中的反應(yīng)需要的劑量小但呈現(xiàn)高通量、反應(yīng)時(shí)間很短，往往為秒甚至毫秒級，使得微流控芯片具有高效的特點(diǎn)；
3)芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進(jìn)行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制不同區(qū)域的溫度；在微流控通道中更容易實(shí)現(xiàn)宏觀尺度下難以實(shí)現(xiàn)的溫度快速精確變化，高精度的溫控對研究特殊的生化反應(yīng)有著突出貢獻(xiàn)；
4)微流控芯片可采用多種檢測手段對微流控通道中的試劑進(jìn)行直接檢測，包括激光誘導(dǎo)突光檢測(Laser induced fluorescence, LIF)、實(shí)時(shí)突光檢測、電化學(xué)檢測、質(zhì)譜檢測等方式等。因此微流控芯片中進(jìn)行生化反應(yīng)的結(jié)果可以在線獲得，并轉(zhuǎn)化為電信號直接輸出到計(jì)算機(jī)中進(jìn)行處理，大大降低了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，提高了對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度與可調(diào)試性；
5)高度整合度，通過合理的芯片設(shè)計(jì)將使得不同的復(fù)雜的反應(yīng)過程能夠集成于同一個(gè)反應(yīng)芯片上，實(shí)現(xiàn)功能一體化自動(dòng)化，防止了轉(zhuǎn)移時(shí)試劑的浪費(fèi)和污染；同時(shí)由于MEMS加工技術(shù)的特點(diǎn)，這種高度整合的微流控芯片還能批量化低成本的生產(chǎn)，有利于這種具有復(fù)雜功能集成的微系統(tǒng)在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR技術(shù)原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合，為后續(xù)反應(yīng)做準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至50-65 °C，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。PCR技術(shù)已經(jīng)是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展中一個(gè)重要發(fā)展方向，成為一種廣泛應(yīng)用的檢測手段與技術(shù)方法，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)工程、遺傳科學(xué)、法醫(yī)鑒定等方面都具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵是快速而準(zhǔn)確的控制溫度循環(huán)，PCR擴(kuò)增循環(huán)中的每一步都有最短的有效反應(yīng)時(shí)間，溫度變化過程太長不僅浪費(fèi)時(shí)間，且隨著時(shí)間的延長Taq DNA聚合酶的活性而逐漸下降，因此較長的反應(yīng)過程對PCR是很不利的。因此直接提供PCR反應(yīng)效率的思路就是減少PCR混合液的體積，可以縮短循環(huán)時(shí)間，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。 這恰恰是以微米為尺度的微流控芯片的突出特點(diǎn)。因此利用MEMS加工技術(shù)制作出高效的PCR微流控芯片成為微流控芯片發(fā)展的一個(gè)重要分支。PCR微流控芯片是PCR技術(shù)和MEMS技術(shù)在新技術(shù)環(huán)境下的高效結(jié)合。隨著微流控芯片技術(shù)發(fā)展，以MEMS加工工藝在硅、玻璃和聚合物材料基礎(chǔ)上加工出來的PCR微流控芯片，內(nèi)部集成了微閥、微泵等流體控制元件和微加熱器、微傳感器等溫度控制元件，在微米量級甚至更低的封閉環(huán)境中完成了樣品的操作與PCR反應(yīng)，而后續(xù)集成的檢測部件中還能完成擴(kuò)增結(jié)果的分離和檢測。因此使得PCR反應(yīng)獲得了更大的集成度和極高的反應(yīng)效率。PCR微流控芯片具有以下明顯優(yōu)勢
1)溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可以達(dá)到很高的升/降溫速率(甚至可高達(dá)60-900C / S)，反應(yīng)時(shí)間成倍縮短；
2)反應(yīng)液體積減小，反應(yīng)試劑的消耗量降低，反應(yīng)液溫度的均勻性提高，擴(kuò)增的特異性增強(qiáng)，既節(jié)省了成本又提高了效率；
3)微通道的比表面積較大，可選用導(dǎo)熱系數(shù)高的材料，提升熱傳遞速率，大大降低反應(yīng)液溫度平衡的時(shí)間和循環(huán)所需要耗費(fèi)時(shí)間，溫度能夠更快的穩(wěn)定和檢測；
4)芯片易于集成和功能化，能夠快速便捷的實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增、結(jié)果分析一體化，空間尺度的減小使得可以利用微加工技術(shù)將微加熱器和溫度傳感器等直接集成在芯片上，可進(jìn)一步提高熱傳遞速率；也可將芯片與樣品純化、混合、芯片電泳和熒光實(shí)時(shí)檢測等操作過程集成，提高自動(dòng)化程度和一體化過程。PCR微流控芯片在發(fā)展中主要可以分為靜態(tài)微腔室式PCR和連續(xù)流PCR兩大類，兩者的主要差別在于進(jìn)行PCR循環(huán)時(shí)反應(yīng)液是否處于流動(dòng)狀態(tài)，若是處于靜止?fàn)顟B(tài)一般可歸于靜態(tài)腔室型，若處于不斷的流動(dòng)狀態(tài)則一般可以歸于連續(xù)流型。傳統(tǒng)的靜態(tài)微腔室型PCR芯片結(jié)構(gòu)比較簡單，一般使用微加工技術(shù)加工出反應(yīng)的微腔室(微腔室有可以封閉的流體進(jìn)出口)，用于加熱與溫度傳感的電極以及冷卻與散熱裝置。其基本原理和傳統(tǒng)PCR儀器相近，是對注入反應(yīng)腔內(nèi)的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行直接的升降溫控制，實(shí)現(xiàn)溫度循環(huán)。雖然結(jié)構(gòu)簡單，但是由于微觀尺度效應(yīng)，熱慣性小，PCR反應(yīng)液在微腔室中可以很快地進(jìn)行升降溫工作，熱傳感器也能及時(shí)反饋并對溫度進(jìn)行控制。由于微腔室芯片結(jié)構(gòu)簡單，也意味著能夠在一塊晶片上加工多個(gè)反應(yīng)池，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)。通過微加工制作的微腔室也可以通過微通道和流體控制與其他功能部件相連，實(shí)現(xiàn)功能集成化，這些特點(diǎn)都在實(shí)際使用中具有很大的優(yōu)勢。靜態(tài)微腔室型PCR芯片顯著地降低了混合液的消耗量，但溫控系統(tǒng)及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)直接決定的加熱冷卻速度仍舊對溫度循環(huán)與穩(wěn)定起著決定性影響，一般來說與理想的升降溫反應(yīng)速度仍舊有一定差距。一般加熱與散熱裝置需要集成加工在芯片上，這使得加工成本也有所上升。且傳統(tǒng)靜態(tài)腔室PCR芯片的試劑準(zhǔn)備、反應(yīng)后試劑提取依舊需要有外部轉(zhuǎn)移過程，可能導(dǎo)致試劑的浪費(fèi)與轉(zhuǎn)移污染的出現(xiàn)。因此，向著實(shí)現(xiàn)類似連續(xù)流PCR的獨(dú)立多溫區(qū)循環(huán)與更多的功能集成化發(fā)展都成為靜態(tài)腔PCR芯片發(fā)展的方向。毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis CE)芯片是微流控芯片發(fā)展起點(diǎn)，也是微流控芯片發(fā)展最廣最多的方向。其已經(jīng)是一個(gè)比較成熟的微分離檢測技術(shù)手段，可實(shí)現(xiàn)對多種生物分子、離子的分離檢測。CE芯片原理和操作都非常簡單，其主要涉及微流體環(huán)境中的兩種電現(xiàn)象電滲與電泳。電滲是使用電極電壓對微流控通道中的流體進(jìn)行驅(qū)動(dòng)的一種方法，在微流控芯片中，如果使用高壓電極與微通道內(nèi)反應(yīng)試劑接觸，施加電壓；在？沿3條件下，在微通道內(nèi)部的固液交界面處會(huì)形成一層偶電層，偶電層會(huì)在通道兩端的電場力的作用下定向移動(dòng)，由于粘度的作用同時(shí)會(huì)帶動(dòng)幾十微米內(nèi)的液體一同流動(dòng)(微通道設(shè)計(jì) 尺寸一般將使得電滲帶動(dòng)整個(gè)流體)，在摩擦力平衡下形成一種扁平形狀的液流定向運(yùn)動(dòng)，這就是電滲現(xiàn)象。電滲由于可以利用電壓方便的控制流體的流動(dòng)，是一種很適宜于微流控芯片環(huán)境的流體控制驅(qū)動(dòng)方式，長期以來得到了廣泛的應(yīng)用與研究。在電滲導(dǎo)致微通道內(nèi)液體流動(dòng)的同時(shí)，微通道兩端的施加的電壓也使得液體環(huán)境中的帶電粒子在電場作用下向相反的電極方向移動(dòng)，這就是電泳。微觀尺度下電泳將使得不同的荷質(zhì)比的粒子在電場力作用下分離形成相應(yīng)的分離譜帶。如果分離譜帶附加上熒光并用光學(xué)儀器記錄分析或者使用其對光譜的吸收特性進(jìn)行分析，就可以得到分離的定量結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了分離檢測的目的。在有帶正電、負(fù)電和不帶電的混合物存在的條件下，用電滲的方法可以很容易分開，但是如果只有帶負(fù)電的DNA的條件下，要抑制電滲，只對DNA進(jìn)行電泳，這樣分辨率會(huì)更高一些。為了抑制電滲，一般用聚乙烯醇、線性聚丙烯酰胺、聚-N-羥乙基丙烯酰胺、吡咯烷酮等化合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)修飾或者對通道表面進(jìn)行烷基化修飾，這樣既能抑制電滲流又可以防止DNA在通道表面的吸附。微流控芯片中各種生物與化學(xué)過程都是處于微米量級的幾何尺度內(nèi)，檢測空間的狹小與檢測試劑的快速反應(yīng)使得微流控芯片的檢測方式要求靈敏度高，響應(yīng)速度快，能夠微型化。檢測器與微流控芯片一同發(fā)展，因此繼承于微流控芯片初期毛細(xì)管電泳芯片的發(fā)展，包括激光誘導(dǎo)熒光檢測、化學(xué)發(fā)光和紫外吸收等的光學(xué)檢測法一直是主流的檢測手段；電化學(xué)檢測方法檢測價(jià)格低廉、裝置簡單、非常易于整合，適于一些靈敏度要求不高的領(lǐng)域；質(zhì)譜檢測具備高分辨率，敏感度和結(jié)構(gòu)分析能力有突出優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備較昂貴。激光誘導(dǎo)突光(Laser Induced Fluorescence, LIF)檢測是目前最靈敏也是最常用的微流控芯片檢測方法之一，其檢測限很低，一般能達(dá)到10-9-10-13mol/L，甚至在一些改進(jìn)技術(shù)支持下能達(dá)到單分子檢測。根據(jù)不同的需要運(yùn)用不同的檢測方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測一個(gè)和多個(gè)PCR片段的功能，即使相同的片段大小也可分辨。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，特點(diǎn)是包括上蓋片、與其相鍵合的下基片以及鍵合中間層，所述上蓋片的下表面設(shè)有PCR反應(yīng)腔、樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池、PCR反應(yīng)腔與樣品池之間的溝道以及樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池之間的十字型溝道，PCR反應(yīng)腔的每一端均設(shè)有毛細(xì)管閥，PCR反應(yīng)腔的前端設(shè)有進(jìn)樣孔，PCR反應(yīng)腔的體積小于I μ I ;所述下基片的上表面設(shè)有與上蓋片上的PCR反應(yīng)腔的位置相對的加熱電極和溫度傳感電極，以及分別與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的電極點(diǎn)，以及分別與樣品池電極點(diǎn)、緩沖液池電極點(diǎn)、樣品廢液池電極點(diǎn)、廢液池電極點(diǎn)直接電性連接的高壓電極；所述下基片的上表面覆鍵合中間層，上蓋片鍵合于下基片上，在上蓋片上與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的部位分別設(shè)有放樣孔，與所述放樣孔相對的鍵合中間層上也分別設(shè)有通孔，放樣孔經(jīng)通孔與其對應(yīng)的池 相貫通。進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述下基片的材質(zhì)為玻璃、石英或者硬質(zhì)透明高聚物材料。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述透明高聚物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺或者聚對苯二酸乙二酯。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述下基片的厚度為100 μ m 2mm。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述上蓋片的材質(zhì)為硅、玻璃、石英或者聚合物材料。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述聚合物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺或者聚對苯二酸乙二酯。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述上蓋片的厚度為100 μ m 10mm。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述鍵合中間層為高聚物薄膜，其厚度為ΙΟΟμπι以下。更進(jìn)一步地，上述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其中，所述高聚物薄膜是PDMS薄膜。本發(fā)明技術(shù)方案突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要體現(xiàn)在
1)微流控芯片中尺寸為微觀，流體與顆粒都具有高的體表面積比，能夠提高生物化學(xué)反應(yīng)的速度，PCR微腔室體積小于1μ 1，體積的縮小可大大減少PCR反應(yīng)時(shí)間，易于批量化低成本的生產(chǎn)；
2)芯片為多層結(jié)構(gòu)，多層結(jié)構(gòu)能夠集成多種功能，如加熱電極可以集成在上面，對溫度控制的精確度更高；設(shè)置被動(dòng)閥，被動(dòng)閥的設(shè)置比起通過通道體積比的控制液流更加靈活；
3)芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進(jìn)行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制不同區(qū)域的溫度；可采用多種檢測手段對微流控通道中的試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)和終點(diǎn)檢測；實(shí)現(xiàn)PCR-CE功能一體化自動(dòng)化，防止了轉(zhuǎn)移時(shí)試劑的浪費(fèi)和污染；
4)溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可達(dá)到很高的升/降溫速率(甚至可高達(dá)60-900C / S)，反應(yīng)時(shí)間成倍縮短；反應(yīng)液體積減小，反應(yīng)液溫度的均勻性提高，擴(kuò)增的特異性增強(qiáng)，既節(jié)省了成本又提高了效率；芯片易于集成和功能化，能夠快速便捷的實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增、結(jié)果分析一體化；
5)具有同時(shí)檢測一個(gè)和多個(gè)PCR片段的功能，即使相同的片段大小也可分辨。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明
圖I:本發(fā)明芯片的構(gòu)造原理示意 圖2 7 :下基片的制作工藝流程 圖8 12 :上蓋片的制作工藝流程 圖13 14 :下基片與上蓋片相鍵合的制作工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明設(shè)計(jì)一種具有實(shí)時(shí)和終點(diǎn)檢測一個(gè)或多個(gè)PCR片段功能的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，具有檢測五色熒光的特性，即使片段的大小相等也可進(jìn)行分辨。如圖I所示，微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，包括上蓋片、與其相鍵合的下基片以及鍵合中間層，上蓋片的下表面設(shè)有PCR反應(yīng)腔2、樣品池6、緩沖液池7、樣品廢液池8、廢液池9、PCR反應(yīng)腔與樣品池之間的溝道以及樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池之間的十字型溝道，PCR反應(yīng)腔2的每一端均設(shè)有毛細(xì)管閥5，PCR反應(yīng)腔的前端設(shè)有進(jìn)樣孔1，PCR反應(yīng)腔2的體積小于I μ I ;下基片的上表面設(shè)有與上蓋片上的PCR反應(yīng)腔的位置相對的加熱電極3和溫度傳感電極4，以及分別與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的電極點(diǎn)，以及分別與樣品池電極點(diǎn)、緩沖液池電極點(diǎn)、樣品廢液池電極點(diǎn)、廢液池電極點(diǎn)直接電性連接的高壓電極10 ;下基片的上表面覆鍵合中間層，上蓋片鍵合于下基片上，在上蓋片上與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的部位分別設(shè)有放樣孔，與放樣孔相對的鍵合中間層上也分別設(shè)有通孔，放樣孔經(jīng)通孔與其對應(yīng)的池(樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池)相貫通。電泳部分高壓電極伸到儲(chǔ)液池的中央。其中，下基片的材質(zhì)為玻璃、石英或者透明高聚物材料，硬質(zhì)透明高聚物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂(ΡΜΜΑ)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物(C0C)、聚對二甲苯、聚酰亞胺(PI)、聚對苯二酸乙二酯(PET)等，下基片的厚度為ΙΟΟμπι 2mm ο 上蓋片的材質(zhì)為硅、玻璃、石英或者聚合物材料，聚合物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物(C0C)、聚對二甲苯、聚酰亞胺(PI)、聚對苯二酸乙二酯(PET)等，上蓋片的厚度為ΙΟΟμπι 10mm。鍵合中間層為高聚物薄膜，其厚度為400 μ m 10mm，高聚物薄膜是PDMS薄膜。芯片的制作工藝如圖2 14，其中，如圖2，示意了采用玻璃、石英或者高聚物材料作為下基片101，在其上涂一層光刻膠102，如圖3，通過曝光顯影利用顯影液將曝光后的光刻膠去除，如圖4，然后用金屬濺射或者電鍍技術(shù)，在下基片的表面鍍上一層10 300nm厚的金屬電極如圖5 ;然后將光刻膠剝離如圖6，形成電極103，在基片上旋涂一層高聚物薄膜104，其厚度為400nm 10 μ m，如圖7。如圖8，示意了拋光硅片作為上蓋片105，在其上涂一層負(fù)膠106，如圖9，經(jīng)曝光并顯影后顯示出微通道和微腔室的突起如圖10，在其上灌注高聚物107，如圖11，然后在高聚物上形成微通道和微腔室如圖12。將圖7形成的結(jié)構(gòu)與圖12形成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鍵合，形成如圖13的結(jié)構(gòu)，并鉆孔獲得 完整的芯片如圖14，形成放樣孔108和微腔室109，放樣孔108經(jīng)通孔與其對應(yīng)的池相貫通。這里鍍金屬層部分可以去掉，而是在PCR反應(yīng)腔的外面加一個(gè)加熱塊和制冷快代替，高壓電極可在儲(chǔ)液池的上方引入。集成的PCR-CE芯片是由PCR反應(yīng)單元與CE分離通道組成的微流控芯片。由上蓋片、下基片鍵合，上蓋片集成了微流控通道、反應(yīng)腔、儲(chǔ)液池、相應(yīng)的流體進(jìn)出口和微閥等。下基片作為芯片底座，基片表面濺射沉積了 Cr/Pt或者Ti/Pt電極，作為外部溫度控制、高壓電源控制及檢測的載體。在上蓋片與下基片鍵合時(shí)，中間還有一層薄層高聚物薄膜作為鍵合中間層，起到提高鍵合穩(wěn)固性的作用，同時(shí)可將上蓋片通道中的液體與下基板的電極隔開。芯片由三層組成，加熱電極和溫度傳感器不直接與微流控通道中的液體接觸，因此其上附一層高聚物材料薄膜，用于阻隔與液體的接觸。高壓電極與點(diǎn)用通道中的液體相連。PCR熱循環(huán)過程中，加熱部分直接做在芯片上，而制冷部分因?yàn)轶w積較大作為芯片外部的附屬部分，以增加制冷的速度。自然降溫比較慢，因此用風(fēng)扇制冷或者帕爾貼元件制冷。具體應(yīng)用時(shí)，首先將待擴(kuò)增檢測的PCR樣品混合物從進(jìn)樣孔注入到PCR反應(yīng)腔2。反應(yīng)腔兩端的毛細(xì)管閥5起到阻礙液流流動(dòng)的作用，只有當(dāng)液壓增大到一定程度才能導(dǎo)通，但對于氣流的流動(dòng)沒有影響。反應(yīng)液全部泵入PCR反應(yīng)腔后，使用加熱電極3與溫度傳感電極4進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增完成后，繼續(xù)用連接注入口的泵體將反應(yīng)液泵入CE儲(chǔ)液池。接著可以在CE中以CE電極通以高電壓進(jìn)行CE進(jìn)樣及分離操作。在分離通道距離廢液池大約Icm的地方從外界引入激發(fā)光源并將激發(fā)的熒光信號引到外部進(jìn)行熒光檢測，從而得到分離數(shù)據(jù)。最終從加樣、PCR反應(yīng)、CE分離并檢測在微流控芯片上得以實(shí)現(xiàn)。上蓋片流體進(jìn)樣孔I與外置泵相連，由泵控制流體進(jìn)出；CE部分儲(chǔ)液池也與外界相通，可以加入CE緩沖液以及收集廢液及反應(yīng)液；芯片表面的電極的引腳外露，導(dǎo)通內(nèi)部電極。PCR下的溫控電極及連接到各CE儲(chǔ)液池部分的電極是被高聚物薄膜與上蓋片通道內(nèi)的液體隔離開，但儲(chǔ)液池內(nèi)的電極是與CE儲(chǔ)液池中的液體接觸，提供了電滲和電泳所需要的強(qiáng)電場。在法醫(yī)鑒定中，需要將PCR產(chǎn)物取出適量以1:10的比例加入甲酰胺，以使DNA產(chǎn)物變?yōu)閱捂?，因此微腔室PCR及毛細(xì)管電泳之間加入一個(gè)加甲酰胺的步驟。并且其檢測部分采用激光誘導(dǎo)的熒光檢測法，檢測光路采用共焦光路其靈敏度是可達(dá)10-12mol/L左右，可同時(shí)檢測五色熒光，可同時(shí)檢測攜帶不同熒光基團(tuán)的片段。因?yàn)镻CR與CE直接相連，所以PCR中的產(chǎn)物隨時(shí)可以進(jìn)行電泳檢測，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，而且也可以對PCR之后的產(chǎn)物進(jìn)行最終檢測。綜上所述，本發(fā)明微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片凸顯以下特點(diǎn)
1)微流控芯片中尺寸為微觀，流體與顆粒都具有高的體表面積比，能夠提高生物化學(xué)反應(yīng)的速度，PCR微腔室體積小于1μ 1，體積的縮小可大大減少PCR反應(yīng)時(shí)間，易于批量化低成本的生產(chǎn)；
2)芯片為多層結(jié)構(gòu)，多層結(jié)構(gòu)能夠集成多種功能，如加熱電極可以集成在上面，對溫度控制的精確度更高；設(shè)置被動(dòng)閥，被動(dòng)閥的設(shè)置比起通過通道體積比的控制液流更加靈活；
3)芯片的微環(huán)境的熱容量小，可進(jìn)行高速的升降溫控制，并能精確的檢測與控制不同區(qū)域的溫度；可采用多種檢測手段對微流控通道中的試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)和終點(diǎn)檢測；實(shí)現(xiàn)·PCR-CE功能一體化自動(dòng)化，防止了轉(zhuǎn)移時(shí)試劑的浪費(fèi)和污染；
4)溫度循環(huán)系統(tǒng)體積減小，熱容降低，可達(dá)到很高的升/降溫速率(甚至可高達(dá)60-900C / S)，反應(yīng)時(shí)間成倍縮短；反應(yīng)液體積減小，反應(yīng)液溫度的均勻性提高，擴(kuò)增的特異性增強(qiáng)，既節(jié)省了成本又提高了效率；芯片易于集成和功能化，能夠快速便捷的實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增、結(jié)果分析一體化；
5)現(xiàn)有的微流控技術(shù)一般是PCR微流控芯片與毛細(xì)管電泳芯片分別制作成不同的設(shè)備，如PCR微流控芯片設(shè)備，毛細(xì)管電泳芯片設(shè)備。而本發(fā)明芯片將PCR和CE功能整合在一塊微流控芯片上，減小了設(shè)備的體積，使PCR和CE全自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。現(xiàn)有的的CE芯片不能進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定，分辨率達(dá)不到，而本發(fā)明芯片的毛細(xì)管電泳芯片增長了分離通道，并且優(yōu)化了分離膠，使其分辨率達(dá)到lbp。具有同時(shí)檢測一個(gè)和多個(gè)PCR片段的功能，即使相同的片段大小也可分辨。需要理解到的是以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于包括上蓋片、與其相鍵合的下基片以及鍵合中間層，所述上蓋片的下表面設(shè)有PCR反應(yīng)腔、樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池、PCR反應(yīng)腔與樣品池之間的溝道以及樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池之間的十字型溝道，PCR反應(yīng)腔的每一端均設(shè)有毛細(xì)管閥，PCR反應(yīng)腔的前端設(shè)有進(jìn)樣孔，PCR反應(yīng)腔的體積小于I μ I ;所述下基片的上表面設(shè)有與上蓋片上的PCR反應(yīng)腔的位置相對的加熱電極和溫度傳感電極，以及分別與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的電極點(diǎn)，以及分別與樣品池電極點(diǎn)、緩沖液池電極點(diǎn)、樣品廢液池電極點(diǎn)、廢液池電極點(diǎn)直接電性連接的高壓電極；所述下基片的上表面覆鍵合中間層，上蓋片鍵合于下基片上，在上蓋片上與樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池的位置相對的部位分別設(shè)有放樣孔，與所述放樣孔相對的鍵合中間層上也分別設(shè)有通孔，放樣孔經(jīng)通孔與其對應(yīng)的池相貫通。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述下基片的材質(zhì)為氧化鋁、氮化鋁、銅、硅、玻璃、石英或者透明高聚物材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特 征在于所述透明高聚物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺或者聚對苯二酸乙二酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述下基片的厚度為100 μ m 2mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述上蓋片的材質(zhì)為硅、玻璃、石英或者聚合物材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述聚合物材料是環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲脂、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物、聚對二甲苯、聚酰亞胺或者聚對苯二酸乙二酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述上蓋片的厚度為100 μ m 10mm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述鍵合中間層為高聚物薄膜，其厚度為IOOym以下。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，其特征在于所述高聚物薄膜是PDMS薄膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及微腔室靜態(tài)PCR與毛細(xì)管電泳CE功能集成微流控芯片，上蓋片的下表面設(shè)有PCR反應(yīng)腔、樣品池、緩沖液池、樣品廢液池、廢液池、十字型溝道，PCR反應(yīng)腔體積小于1μl；下基片的上表面設(shè)有與上蓋片上的PCR反應(yīng)腔的位置相對的加熱電極和溫度傳感電極，以及分別與樣品池電極點(diǎn)、緩沖液池電極點(diǎn)、樣品廢液池電極點(diǎn)、廢液池電極點(diǎn)直接電性連接的高壓電極；下基片的上表面覆鍵合中間層，上蓋片鍵合于下基片上，在上蓋片上設(shè)有放樣孔，與放樣孔相對的鍵合中間層上也分別設(shè)有通孔，放樣孔經(jīng)通孔與其對應(yīng)的池相貫通。該芯片具有實(shí)時(shí)和終點(diǎn)檢測一個(gè)或多個(gè)PCR片段功能，具有檢測五色熒光的特性，即使片段的大小相等也可進(jìn)行分辨。
文檔編號C12M1/34GK102899245SQ20121038111
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者何越, 唐偉忠, 李民, 艾洪新, 楊楠 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司